抗肝纤维化青霉呋喃酮a化合物及其药物组合物和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及具有抗肝纤维化活性的呋喃酮聚酮类 活性化合物Penicilfuranone A及其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及 其在制备治疗肝纤维化疾病的药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 呋喃酮类聚酮类化合物是一类有真菌产生的次生代谢产物，目前见报道于真菌 Aspergillus rugulosus, Cephalosporium gregatum,以及 Penicillium daleae 的次生代 谢产物中。迄今为止，文献报道的呋喃聚酮类化合物不足20个化合物，且其分子量皆为300 左右。前人研究表明该类化合物具有抗菌，致植物枯萎，抑制哺乳动物Y族DNA酶等作用。 本发明化合物结构新颖，分子量为486,与之前报道的该类化合物，结构完全不一样。迄今为 止，现有技术中尚未见有本发明的结构新颖的呋喃酮聚酮类化合物被报道，同时也未见任 何文献报道该类呋喃酮类化合物具有抗肝纤维化活性的研究。
【发明内容】
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[0003] 本发明目的在于提供从内生真菌Penicillium daleae中分离得到的咲喃聚酮类 化合物A，其制备方法，在药物中特别是在抗肝纤维化药物中的应用。
[0004] 为了实现本明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0005] 下述结构式（I)所示的青霉呋喃酮A化合物或其药学上可接受的盐，
[0007] 药物组合物，其包含所述的青霉呋喃酮A化合物或其药学上可接受的盐和至少一 种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
[0008] 根据所述的青霉呋喃酮A化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的药学上可接 受的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐、 乙二酸盐。
[0009] 本发明同时提供了青霉呋喃酮A化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，取青 霉咲喃酮A Penici 11 ium daleae发酵物，用有机溶剂提取，浓缩得浸膏，分别用乙酸乙酯萃 取，硅胶层析柱，制备型高效液相色谱等方法得结构式（I)化合物。
[0010] 更具体的制备方法如下：取Penicillium daleae菌丝体接种于灭菌马铃薯葡萄 糖培养液中PDA，于室温下以170转每分钟在摇床中震荡五天，做成种子液，将种子液转接 到灭菌的大米培养基中，28°C条件下无菌培养40天，用乙酸乙酯提取利用大米培养基培养 40天后的菌丝体，共提取四次，得到乙酸乙酯提取物，利用硅胶柱色谱，高效液相色谱质谱 联用，制备型高效液相色谱处理乙酸乙酯提取物，最后得到青霉呋喃酮A，其制备液相色谱 条件为：12mL/min，UVX_ 230nm，MeCN-H20 45:55,保留时间 15.0min。
[0011] 上述制备方法中，青霉咲喃酮A化合物可进一步与适当的酸成盐，适当的酸选自 盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸或其他适合的有机酸或 无机酸。
[0012] 本发明还提供了所述的青霉呋喃酮A化合物或药物组合物在制备抗肝纤维化的 药物中的应用。
[0013] 本发明的药物组合物，能作为适宜口服或注射给药的制剂形式。
[0014] 其中所述的口服给药的制剂形式为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、滴 丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂或酏剂，所述的 注射给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂 或微囊。
[0015] 本发明化合物青霉呋喃酮A结构新颖，分子量为486,与之前报道的该类化合物结 构完全不一样，且具有明显的抗肝纤维化活性，其机制与阻断TGF-β 1刺激肝星状细胞的 过度激活和细胞外基质的形成能力有关，在低于32 μ Μ的浓度下，Penicilfuranone A未见 明显的肝细胞毒性。
【附图说明】：
[0016] 图1为本发明Penicilfuranone A的结构示意图；
[0017] 图2为本发明Penicilfuranone A的X-单晶衍射结构示意图；
[0018] 图3为本发明Penicilfuranone A对正常人肝脏细胞生长活力的影响（MTT法；处 理 48h);
[0019] 图4为本发明Penicilfuranone A抑制TGF-β 1诱导下，肝星状细胞纤维化形成相 关蛋白的表达（western blot法；A为大鼠 T6肝星状细胞株，B为人LX-2肝星状细胞株）。
【具体实施方式】：
[0020] 下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以 此来限定本发明。
[0021] 实施例1 :
[0022] 化合物 Penicilfuranone A 的制备：
[0023] 分离流程：取少量Penicillium daleae菌丝体接种于1000ml灭菌马铃薯葡萄 糖培养液中（PDA)，于室温下以170转每分钟在摇床中震荡五天，做成种子液。将种子 液转接到2. 0公斤灭菌的大米培养基中，25度条件下，无菌培养35天。用乙酸乙酯5L 提取利用大米培养基培养35天后的菌丝体，共提取五次，每次5L，得到乙酸乙酯提取物 18g。利用硅胶柱色谱，高效液相色谱质谱联用，制备型高效液相色谱处理18g的乙酸乙 酯提取物，最后得到Penicilfuranone A 12mg，其制备液相色谱条件为：12mL/min，UVAmax230nm，MeCN-H2045:55,保留时间 15. Omin。
[0024] 实施例2 :
[0025] Penicilfuranone A 结构解析：
[0026] 化合物Penicilfuranone A，金色针状晶体，[a ]22D - 6 (c 0· 2, MeOH) iSI-MS谱给 出准分子离子峰为m/z 509[M+Na]+，结合高分辨正离子HR-ESI-MS(m/z[M+Na]+509. 1792， 计算值为C26H3Q09Na，509. 1782)和13C NMR、DEPT谱提供的信息，确定其分子式为C26H3Q09,不 饱和度为12。UV光谱在196 (4. 5)，222 (4. 6)，359 (4. 0)，495 (2. 6) nm处有吸收，说明分子中 存在大共辄基团。分析4和13C NMR谱（表1)，再结合HSQC，HMBC，4-? C0SY，以及R0ESY 谱表明得到化合物Penicilfuranone A的结构。最后，通过X-单晶衍射分析进一步证实了 以上分析，并确定了其立体构型（图2)。Penicilfuranone A的X-单晶衍射数据已经上传 到应该剑桥大学单晶数据库www. cede, cam, ac. uk,其登记号为:CO)C 1042018。
[0027] 表 1. Penicilfuranone A 的 NMR 波谱数据（δ in ppm, Jin Hz)
[0029] 11试于600MHz仪器，溶剂为DMSO-d 6.b测试于600MHz仪器，溶剂为acetone-d 6.
[0030] 实施例3 :
[0031] Penicilfuranone A对正常人肝细胞的毒性检测：
[0032] 正常人肝脏细胞（L-02细胞株）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源 中心；RPMI 1640培养基为Hyclone公司产品；胎牛血清为Gibco公司产品；二甲基亚砜 (DMSO)和噻唑蓝（MTT)为sigma公司产品；全自动酶标仪（美国，Thermo公司）；恒温C02培养箱（美国，Thermo公司）；正常人肝细胞L-02细胞株用RPMI1640培养基（含10%灭 活胎牛血清，100U/mL青霉素和100yg/mL链霉素）于37°C、饱和空气湿度、含5% 0)2的 培养箱内常规传代培养。取指数生长期L-02细胞株，1000 Xg离心5min，弃去上清液，用相 应的培养基打匀，制成细胞悬液，计数后稀释成浓度为3 X 104个细胞/mL的细胞悬液，接种 于96孔板，每孔200 μ L，置于细胞培养箱24h后给药，分别设置细胞对照组和11个浓度的 Penicilfuranone A 样品组（0· 125、0· 25、0· 5、1、2、4、8、16、32、64、128 μΜ)，每个浓度设置 3个复孔，加药后将96孔板分别培养于细胞培养箱中48h后，每孔加20uL ΜΤΤ溶液（用PBS 将MTT粉末配成5mg/mL的储存液），在细胞培养箱中继续孵育4h后离心弃去上清液，每孔 加入100uL DMS0,轻微振荡使紫色晶体完全溶解，用酶标仪于570nm处测定每孔吸光度（0D 值），计算3个复孔0D值平均值，并计算细胞存活率：细胞存活率（％) =(给药组细胞0D 均值一背景0D均值V (对照组细胞0D均值一背景0D均值）X 100%。
[0033] 肝细胞损伤往往被认为是发生肝脏纤维化的诱发因子，因此，药物可以通过保护 肝细胞的方式来阻止肝脏纤维化进程，至少其本身应没有肝细胞毒性。MTT检测结果发现， 经Penicilfuranone A各浓度处理48h后，