在非常高的浓度（32 μ M)下，人正常肝脏细胞也 没有出现明显的活力抑制现象，这意味着，在低于32 μΜ的浓度下，Penicilfuranone Α未 见明显的肝细胞毒性，结果见图3。
[0034] 实施例4 :
[0035] 采用western blot方法检测Penicilfuranone A对TGF-β 1刺激肝星状细胞激 活及细胞外基质成分表达的影响
[0036] 人肝星状细胞LX-2细胞株引自中国典型培养物保藏中心；大鼠肝星状细胞Τ6 细胞株为引自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；分别用DMEM培养基和 1?^11640培养基（含10%灭活胎牛血清，1001]/1^青霉素和100以8/1^链霉素），于37°(：， 含5% C02的培养箱内常规传代培养。取对数生长期的肝星状细胞株LX-2和Τ6,在6孔培 养板以5X 104个细胞/孔进行接种，细胞培养过夜后，分别以相应的无血清培养基同步化 培养24h，此后，分组换液，分别加入终浓度10ng/ml的重组人TGF- β 1 (美国P印rotech公 司）和不同浓度的Penicilfuranone A(l，2和4μΜ)，同时分别设溶剂对照组（0.5%DMS0) 和浓度为10 μΜ的SB431542(TGF-f3 1 I型受体激酶抑制剂，美国Cayman公司）阳性对照 组。药物作用48h后收集细胞，蛋白裂解液裂解细胞，4°C、12000 X g低温离心30min，收集上 清。上清经BCA法测定其蛋白浓度。加入等体积2XSDS加样缓冲液（125mm〇l/L Tris-HCl、 20 %甘油，0. 01 %溴酚蓝、4 % SDS、200mmo 1/L DTT)，调整各组上样蛋白浓度一致后，沸水浴 中加热511^11，505-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，含5%脱脂奶粉的了851'封闭111后，分别加 入α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA),波形蛋白（vimentin)、I型胶原（type I collagen)、结 缔组织生长因子（CTGF)和内参β-actin抗体，4°C孵育过夜。TBST洗涤3次，加入辣根酶 标记羊抗兔IgG二抗，37°C下与膜反应lh，TBST洗膜3次，按ECL试剂盒说明书进行化学发 光，分析相关蛋白的表达情况。
[0037] 肝星状细胞激活后可以产生大量的细胞外基质成分，因此在肝脏纤维化的发生、 发展过程中起到关键作用。TGF-β 1是目前已知诱导肝星状细胞激活的最强因子，它不仅 诱导肝星状细胞激活，上调细胞标志物a -SMA和vimentin的表达水平，同时还提高肝脏 内type I collagen为主的细胞外基质合成。Western blot结果显不，Penicilfuranone A处理肝星状细胞48h后，可以明显降低TGF- β 1诱导下细胞激活的标志物蛋白a -SMA和 vimentin表达，同时显著降低肝星状细胞合成type I collagen的能力，其降调vimentin 表达的能力，甚至强于阳性对照药SB431542。此外，CTGF作为TGF-β 1下游最重要的调控 蛋白，可协同TGF-βΙ，促进肝组织内大量生成细胞外基质。Western blot的结果同时发 现，Penicilfuranone A各剂量组处理后，与TGF-β 1诱导组比较，肝星状细胞内CTGF蛋白 表达水平显著降低。上述结果提示，Penicilfuranone A具有明显的抗肝纤维化作用，其机 制与阻断TGF-β 1刺激肝星状细胞的过度激活和细胞外基质的形成能力有关，结果见图4。
[0038] 实施例5 :
[0039] 按实施例1制得Penicilfuranone A，按其与赋形剂重量比1:1的比例加入赋形 剂，制粒压片。
[0040] 实施例6 :
[0041] 按实施例1制得Penicilfuranone A，按其与赋形剂重量比1:2的比例加入赋形 剂，制粒压片。
[0042] 实施例7 :
[0043] 按实施例1制得Penicilfuranone A，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
[0044] 实施例8 :
[0045] 按实施例1制得Penicilfuranone A，再按下述方法制成片剂：
[0046] 片齐Penicilfuranone A， I OOmg 淀粉 适量 玉米浆 ：适量： 硬脂酸镁 适量
[0047] 实施例9 :
[0048] 胶囊剂：PenicilfuranoneA， 100mg
[0049] 淀粉 适量
[0050] 硬脂酸镁 适量
[0051] 制备方法：将Penicilfuranone A，与助剂混合，过筛，在合适的容器中均勾混合， 把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
[0052] 实施例10 :
[0053] 鼻喷雾剂：PenicilfumnoneA 80 mg 氯化钠 S mg .EDTA lmg 礴酸钠缓冲液（pH6.5) 10 mg 多乙氧基醚 10 mg 重蒸馏水 2 ml
[0054] 制备方法：搅拌下于适当体积的重蒸馏水中每次加入一种成分，直至完全深解，然 后再加入另一种成分。加水至2ml后，将该溶液在无菌过滤器上过滤，装入瓶中并按照适当 的剂量分隔。
[0055] 实施例11 :
[0056] 滴丸：Penicilfuranone A lg
[0057] 聚乙二醇 6000 9g
[0058] 制法：Penicilfuranone A与聚乙二醇6000恪融液的制备：按上述处方量称取 Penicilfuranone A，加入适量无水乙醇，微热溶解后，加入处方量的聚乙二醇恪融液中 (60°C水浴保温），搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽为止，静置于60°C水浴中保温30分钟，待气 泡除尽，然后将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内，在保温80-85Γ的条件下，控制 滴速，一滴滴地滴入冷凝液中，等冷凝完全，倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去丸上 的冷凝液，放置硅胶干燥器中或自然干燥即可。
【主权项】
1. 下述结构式（I)所示的青霉巧喃酬A化合物或其药学上可接受的盐，2. 药物组合物，其包含权利要求1所述的青霉巧喃酬A化合物或其药学上可接受的盐 和至少一种药学上可接受的载体和/或稀释剂。3. 如权利要求1所述的青霉巧喃酬A化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的药学 上可接受的盐为盐酸盐、氨漠酸盐、硝酸盐、硫酸盐、憐酸盐、酒石酸盐、巧樣酸盐、甲酸盐、 乙酸盐、乙二酸盐。4. 权利要求1所述的青霉巧喃酬A化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，取青霉 巧喃酬APenicilliumdaleae发酵物，用有机溶剂提取，浓缩得浸膏，分别用乙酸乙醋萃 取，硅胶层析柱，制备型高效液相色谱方法得青霉巧喃酬A化合物。5. 如权利要求4所述的青霉巧喃酬A化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特 征在于取化nicilliumdaleae菌丝体接种于灭菌马铃馨葡萄糖培养液中PDA,于室溫下W 170转每分钟在摇床中震荡五天，做成种子液，将种子液转接到灭菌的大米培养基中，28Γ 条件下无菌培养40天，用乙酸乙醋提取利用大米培养基培养40天后的菌丝体，共提取四 次，得到乙酸乙醋提取物，利用硅胶柱色谱，高效液相色谱质谱联用，制备型高效液相色谱 处理乙酸乙醋提取物，最后得到青霉巧喃酬A，其制备液相色谱条件为：12mL/min，UV入m。、 230nm，MeCN-H20 45:55，保留时间15.0min。6. 如权利要求4或5所述的青霉巧喃酬A化合物或其药学上可接受的盐的制备方法， 其特征在于青霉巧喃酬A化合物进一步与适当的酸成盐，适当的酸选自盐酸、氨漠酸、硝 酸、硫酸、憐酸、酒石酸、巧樣酸、甲酸、乙酸、乙二酸或其他适合的有机酸或无机酸。7. 权利要求1所述的青霉巧喃酬A化合物或权利要求2所述的药物组合物在制备抗肝 纤维化的药物中的应用。8. 根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于其作为适宜口服或注射给药的制剂 形式。9. 根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述的口服给药的制剂形式为片剂、缓释 片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、 口服溶液、糖浆剂或馳剂，所述的注射给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉 末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。
【专利摘要】由结构式(1)所示的青霉呋喃酮A(Penicilfuranone？A)或其药用盐，以其为有效成分和至少一种药学上可接受的载体组成的药物组合物，其制备方法，以及其在制备预防或治疗肝纤维化药物中的应用。青霉呋喃酮A为化学结构新颖的呋喃聚酮类化合物，具有显著的体外抗肝纤维化活性，化学结构新颖，活性强，作为抗肝纤维化药物有较多优势。
【IPC分类】C07D307/68, A61P1/16, A61K31/365, C12R1/80, C12P17/04
【公开号】CN105399708
【申请号】CN201510670985
【发明人】普建新, 汪伟光, 李傲, 杜雪, 孙汉董
【申请人】中国科学院昆明植物研究所, 重庆理工大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月16日