专利名称：一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素降解酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶及其编码基因，以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的应用。
背景技术：
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是由镰刀菌属缺乏营养物质时产生的次级代谢产物，主要来自禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌，而禾谷镰刀菌是小麦赤霉病和玉米穗腐病的重要病原。DON是一种全球性的谷物污染物，污染水平居镰刀菌毒素之首，该真菌毒素主要发生于小麦、大麦、燕麦、黑麦和玉米，而很少发生于水稻、高粱和黑小麦。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染不仅对人类与动物健康造成巨大危害、导致巨大的经济损失，而且导致大量国际贸易纠纷。 目前，国内外DON的去毒方法主要有物理去除及吸附、化学处理等。对已经污染真菌毒素谷物的物理、化学处理方法主要有冲洗和漂洗、热处理、离子辐射、无机吸附、化学试剂的处理及臭氧氧化等。但是，物理化学脱毒效率并没有预期的高，且改变了食品的品质，易造成营养物质的流失，欧盟不允许在食品生产过程中应用化学方法消除真菌毒素。由于传统的物理和化学方法有一定的局限性，微生物或酶制剂的降解为成功控制真菌毒素的污染提供了新的思路。生物降解不仅可以高效将毒素转化为无毒产物、环保安全，而且生物酶催化方法专一性强、转化效率高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶及其编码基因，该酶可以降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是本发明所提供的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶被命名为Dasag，来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) ACCC No. 36245 (中国农业微生物菌种保藏管理中心,简称ACCC)所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中的SEQ ID NO 1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID NO :I氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇活性的由SEQID NO 1衍生的蛋白质。其中，序列表中的SEQ ID NO 1由454个氨基酸残基组成。上述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一(a)序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(b)编码序列表中SEQ ID NO :1蛋白质序列的多核苷酸。其中，序列表中的SEQ ID NO 2由1365个碱基组成，其编码序列为自5’端第I到第1365位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本发明基因的表达载体、细胞系、工程菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明还提供了一种表达所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的方法，是将含有上述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶。其中，所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌等，优选为酵母菌。所述酵母菌优选为巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris),例如巴氏德毕赤酵母GS115。用于构建所述重组大肠杆菌及重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在大肠杆菌中表达的PEB载体，以及在巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的 pPIC9K、pPIC9、pPIC3. 5K 等。
上述重组表达载体均可按常规方法构建。本发明还提供了所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。本发明的优点进行表达的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶可以对粮食中真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行削减，对控制粮食污染起到有效的作用。
图I重组质粒pPIC9K_Dasag的表达产物的SDS-PAGE图，泳道1，表达产物；泳道M，蛋白分子量标准，图2脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶能力测定图。
具体实施例方式以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。实施例I脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因Dasag的获得及脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的表达脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因质粒文库的建立(I)将标准菌株尖孢镰刀菌ACCC No. 36245 (购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)活化后接入PDA液体培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然)，然后将菌株的悬浮液接入IOOml同样的培养基，摇床条件为220转/分钟，30°C，72小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。提取RNA (Trizol法)；(2)以RNA为模板逆转录合成cDNA序列；2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的获得以步骤I中获得的cDNA序列为模板，在引物I和引物2的引导下进行PCR反应，
扩增脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的序列。引物I :5’ GGAATTCCATATGACTGCACTAAACGTTACAAAC3’ (划线部分碱基为 Nde I 识别位点)和引物2 :5’ CCCAAGCTTCTAGCCAATGAATTGCCCATAC3’ (划线部分碱基为 Hind III识别位点)
在PCR反应中，PCR反应条件为94°C，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次升温至94°C，保持I分钟，降温至54°C，保持I分钟，升温至68°C，保持2分钟；然后于68°C，保持10分钟，最后于4°C保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约I. 4kb的单一带，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接pMD19-T Vector转化大肠杆菌JM109,获得重组质粒pMD19-Dasag测序鉴定。则该脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO :2，其对应的氣基酸序列为序列表SEQ ID N0:1。3、含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶编码基因序列的重组表达载体的构建所获得的PCR产物两端具有Nde I和Hind III限制性内切酶位点，用(Nde I)和(Hind III)限制性内切酶对PCR产物和质粒pPIC9K同时进行双酶切反应，酶切体系50yL :目的片段或质粒 20 μ L，10 X K Buffer 5 μ L, Nde I 2 μ L，Hind III 2 μ L, ddH20 21 μ L，酶切条件是37°C反应3h。酶切产物经柱回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性菌落培养，重组表达载体经PCR鉴定、酶切鉴定，测序验证。经琼脂 糖电泳后载体。回收的目的片段和载体片段定量并按摩尔比为3:1的比例用T4DNA连接酶进行体外连接，连接反应体系10 μ L :目的片段5 μ L，pPIC9K载体2 μ L 10XT4DNA连接缓冲液lμL，T4DNA连接酶(350U/μL)lμL，ddH20 I μ L。16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落37°C振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为后pPIC9K_Dasag。超声波破碎，离心收集上清，取15 μ L上清用SDS-PAGE电泳进行检测。对pPIC9K_Dasag进行测序，证明融合连接入质粒PPIC9K的DNA序列与序列表SEQ ID NO :2相同，构建含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因序列的重组表达载体pPIC9K-Dasag正确。4、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶在毕赤酵母中的表达将重组表达载体pPIC9K_Dasag用Sal I限制性内切酶酶切使之线性化后，采用电击方式，将线性化的载体pPIC9K-Dasag导入毕赤酵母GS115 (北京茂健联星科技有限公司)中，经选择性培养基培养，筛选His+和抗G418的高表达菌株。挑取选择性培养基上长出的单菌落接种于5ml YPD液体培养基(酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，30°C培养12-24小时后，转入500mlBMGY培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨、酵母氮源(YNB) I. 34%、IOOmM磷酸缓冲液PH6. 0,4X10-5生物素，1%甘油)中继续培养至菌液的0D600=2_3，离心收集菌体，再用无碳源BMMY培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨、酵母氮源(YNB)L 34%、100M磷酸缓冲液PH6. 0,4X10-5生物素，O. 5%甲醇)将稀释至0D600=1后加入O. 5%甲醇进行诱导培养，培养期间每隔24小时补加甲醇至终浓度为O. 5%，培养至118小时即可停止培养。离心收集上清，取15 μ L上清用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图I所示泳道I为蛋白标准分子量(97KDa，66KDa, 45KDa, 31KDa, 21KDa, 14KDa);泳道2、3为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株在甲醇诱导下表达的蛋白质的分子量约52. 3KDa，与从氨基酸推段出的理论分子量(52. 3kDa)大小一致。5、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶表达产物的纯化宿主为大肠杆菌时进行表达的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶使用GE公司组氨酸标记亲和柱纯化目的蛋白。具体的方法参照HisTrap FF组氨酸标签融合蛋白纯化实验流程的说明书进行；而在毕赤酵母中表达的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶可以直接分泌到培养液的上清中，直接用于酶活性测定。实施例2脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的活性检测样品处理重组的毕氏酵母ASAG2菌株(实验组)和野生型毕氏酵母GS115菌株(对照组，空质粒整合菌株)诱导表达。5天后，取上清液800 μ L置I. 5mL离心管中，再加入200 μ L IOOppm的D0N，使终浓度达到20ppm。添加后30°C反应0h_5h后处理。取处理好的样品10 μ L进高效液相色谱检测DON的残留。检测方法按照GB/T 23504-2009方法进行。高效液相色谱检测条件Agilent Eclipse X DB-C18, 150mmX4. 6mm(5 μ m)色谱柱，流动相水/甲醇=80%/20%，紫外检测器检测，柱温30°C，流速I. Oml/min,进样量10 μ L。通过高效液相色谱检测得知经过在Tuner中诱导表达的上清液液与DON处理后，DON最高降解率为30% (图2)。可以表明，Dasag基因克隆表达出的降解酶具有降解DON的活性。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中的SEQID NO I的氣基酸残基序列组成的蛋白质； (b)将序列表中的SEQID NO: I氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇活性的由SEQ ID NO :1衍生的蛋白质。
2.权利要求I所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因，其特征在于，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一 (a)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列； (b)编码序列表中SEQID NO 1蛋白质序列的多核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
5.权利要求I所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
6.权利要求2或3所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶编码基因在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
7.—种表达权利要求I所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的方法，是将含有权利要求2或3所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌；用于构建所述重组表达载体的出发载体为pEB、pPIC9K、pPIC9、pPIC3. 5k。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主为巴氏德毕赤酵母。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述宿主为巴氏德毕赤酵母GS115。
全文摘要
本发明公开了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶及其编码基因与应用，该酶来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID NO1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白质。本发明所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)具有高效降解作用。
文档编号C12N15/63GK102816745SQ20121033579
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者吴子丹, 伍松陵, 孙长坡, 任保中 申请人:国家粮食局科学研究院