Dna适配体结合组氨酸标签及其应用
【专利说明】DNA适配体结合组氨酸标签及其应用
[0001]下文中描述的本发明涉及单链DNA适配体结合组氨酸标签的独特核苷酸序列，及其应用。
[0002]原核细胞和真核细胞常常作为生产重组蛋白的高效表达体系。亲和层析法经常被用来获取满足纯度和质量要求的蛋白质。固定化金属亲和层析法(IMAC)是这种层析法中的一个例子。使用这种技术必须要一个短小的组氨酸标签(His-tag)融合在目标蛋白质上，其通常含有6个连续重复的组氨酸残基。组氨酸标签能可逆结合在某种金属离子上(比如，钴、铜、镍和锌)。使用合适的含有上述一种离子的载体，可以保证组氨酸标签蛋白质的纯度或固定。通过采用western blotting蛋白质印迹技术，使用直接针对该标签的单克隆或多克隆抗体，结合在重组蛋白上的组氨酸标签可以用来检测它们。这种蛋白质检测体系可在其它研究蛋白质之间交互作用的体外技术中使用，比如拉下实验，免疫共沉淀技术或者Far Western blotting蛋白质检测印迹技术。
[0003]DNA适配体定义为具有约40-100个核苷酸长度的单链脱氧核糖核酸分子，对配体结合有较高的特异性和亲和性。该适配体丰富的二级和三级结构，意味着针对分子靶选择的适配体的匹配度可达到最佳。
[0004]本发明的目的是提供一种新的方法来识别包含有组氨酸标签的分子，特别是通过提供对包含组氨酸标签的分子靶，或其它包含组氨酸六聚物的分子(比如，肽、蛋白质、DNA衍生品)具有强亲和性的新分子来实现。
[0005]上述技术目标可以根据所述的发明来实现。
[0006]本发明的主题是对组氨酸标签具有亲和性的DNA适配体，其具有序列编号SEQID.N0.1的下述核苷酸序列:
5’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTCTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3’，下称“适配体Al”，
或序列编号SEQ ID.N0.2的下述核苷酸序列:
5’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTTTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3’，下称“适配体BI”。
[0007]本发明可允许DNA序列的某些变化，只要能保证其对含有组氨酸标签肽或蛋白质的亲和性，也允许在多种蛋白质的混合中对组氨酸标签蛋白质进行选择性纯化。特别地，本发明的范围覆盖了上述序列的至少在一个嘌呤碱基或嘧啶碱基上不同的变体。
[0008]本发明的另一个主题是，带有上文定义的一个DNA序列的寡聚核苷酸，用于制备对包含组氨酸标签的分子靶具有亲和性的分子的用途。
[0009]所述用途可如下:
-作为组氨酸标签的直接抗体激动剂使用，
-用于检测包含组氨酸标签的分子靶，
-用于纯化包含组氨酸标签的分子靶，
-用于结合包含组氨酸标签的分子靶，
-用于分析包含组氨酸标签的分子靶的浓度。
[0010]特别地，这些寡聚核苷酸能以带附加标签的分子的形式使用，比如使用荧光标签来标识含有组氨酸标签的分子靶。
[0011]这类分子能用于，例如通过使用技术人员熟悉的光谱技术，如FRET (荧光共振能量转移)或BiFC (双分子荧光互补)，来监测蛋白质之间的相互作用。
[0012]下文可以进一步明确本发明的特征:
图1所示为一个包含组氨酸标签的蛋白质与适配体之间的结合。图列说明:1)蛋白质标记，2)与BI适配体孵育的HiS-PCNA组氨酸-增殖细胞核抗原蛋白质，3)与BI适配体孵育的增殖细胞核抗原蛋白质，4)与一种参照适配体孵育的组氨酸-增殖细胞核抗原蛋白质，5)与一种参照适配体孵育的增殖细胞核抗原蛋白质。对试样进行SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后对蛋白质进行考马斯亮蓝G-250染色。
[0013]
图2所示为从一种大肠杆菌蛋白提取物中对组氨酸标签蛋白的纯化。图列说明:1)蛋白质标记，2)40mg大肠杆菌蛋白提取物，3)在BI适配体帮助下纯化的组氨酸-增殖细胞核抗原蛋白。对试样进行SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后对蛋白质进行考马斯亮蓝G-250染色。
[0014]图3所示为ELISA酶联免疫吸附试验的结果，其中使用BI适配体来检测含有组氨酸标签的重组蛋白。数据所示为三次独立实验的平均结果。
[0015]本发明通过下述实施例进行补充说明。它们并不代表本发明的所有范围。
[0016]实施例1.对组氨酸标签具有亲和性的DNA适配体的生成。
[0017]研究对含有组氨酸标签的分子靶具有亲和性DNA分子的生成过程，结果显示含有下述序列之一的DNA适配体具有强烈的亲和性:
5 ’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTCTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3 ’ (序列编号 SEQ ID.N0.1),
5 ’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTTTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3，
(序列编号 SEQ ID.N0.2)，
本发明可用专业人员熟悉的常规DNA合成方法来获取DNA分子。
[0018]提供一个采用固相化学合成技术获取寡聚核苷酸分子的实施例(扎拉特夫，1.，马诺哈兰，M.，瓦瑟尔，J.-J.以及莫尔万，F.5’-三磷酸DNA RNA的固相化学合成，以及化学修饰的寡聚核苷酸.核酸化学的实验室指南.2012; 50:1.28.1-1.28.16.)
根据上文中定义的序列获得的适配体Al及A2，长度为60的核苷酸，合成质量分别为64 Img及612mg，通过HPLC高效液相色谱法进行验证。
[0019]拥有这些序列的DNA分子上可更易进行更多修饰。特别地，可与已知的染料(比如，一些荧光剂)，或其它分子(比如，生物素)联合使用。
[0020]生物素化适配体Al及BI的实施例，其质量分别为477mg及459mg，通过生物素化寡聚核苷酸在5’末端自动合成而获得。(彭，R.T.—种用于亚磷酰胺自动合成5’ -生物素化寡聚核苷酸的长链生物素试剂，四面体快讯.1991; 32: 1715 - 1718).产物通过HPLC高效液相色谱法进行验证。
[0021]实施例2.组氨酸标签蛋白质与结合色谱树脂的适配体的结合。
[0022]1ml的50%琼脂糖耦合链霉亲合素装入一个1.5ml Eppendorf埃彭道夫管中，并用蒸馏水冲洗。随后用BW缓冲液（17. 5 g/L NaCl, 50 mM磷酸盐缓冲液NaH2P04/Na2HP04，0.1% (v/v)吐温20，pH 7. 5)冲洗3次。之后，将树脂浸入300 μ I BW缓冲液中，该缓冲液包含20mg的5’ -生物素化的BI或是其它带有序列（ACTG) xlO - GAGGAACATGCGTCGCAAAC的参照适配体。试样在室温下孵育lh。孵育完成后，用BW缓冲液冲洗树脂三次，随后用AS缓冲液（137 mMNaCl, 12. 7 mMKCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, 5 mM MgC12, O. I % (v/v)吐温20，pH 7. 4)冲洗两次。最后一次冲洗后，附有结合的适配体的树脂浸入300 μ I的AS缓冲液中，加入重组的人类增殖细胞核抗原蛋白，到最终浓度为O. 13 mg/ml。在这个实验中，使用了两种不同的增殖细胞核抗原蛋白：a)含有组氨酸标签以及b)不含组氨酸标签。带有蛋白的树脂在室温下孵育lh。孵育完成后，用AS缓冲液冲洗四次，浸入GLB缓冲液（50 mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷-盐酸，2% SDS (w/v)溴酚蓝2% (w/v), 10%甘油，200 mM β-巯基乙醇，pH 6.8)中，并在95°C孵育5min。获得的试样进行SDS-PAGE(Laemmli莱姆利法）处理。分离完成后，用考马斯亮蓝G-250对蛋白质进行染色。所得结果如图I所示。
[0023]实施例3.从蛋白细胞提取物中纯化含有组氨酸标签的蛋白。
[0024]10μ1的50%琼脂糖耦合链霉亲合素装入一个L 5mlEppendorf埃彭道夫管中，并用蒸馏水冲洗。之后，用BW缓冲液（O. 3 M NaCl, NaH2P04/Na2HP04 50 mM磷酸盐缓冲液，O. I % (v/v)吐温20，pH 7. 5)冲洗3次。将树脂浸入300ml BW缓冲液中，该缓冲液包含20mg的5’ -生物素化的适配体BI，试样在室温下孵育lh，随后用BW缓冲液冲洗三次，用AS缓冲液（137 mM NaCl, 12. 3 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, 5 mM MgC12, O. I% (v/v)吐温20，pH 7. 4)冲洗两次。最后一次冲洗后，附有结合的适配体的树脂浸入300 μ I的AS缓冲液中。之后，从过表达组氨酸-增值增殖细胞核抗原蛋白质的大肠杆菌细胞制备的总蛋白提取物加入，到浓度为2. O mg/ml ο树脂在室温下孵育lh。孵育完成后，将树脂用AS缓冲液冲洗四次。组氨酸-增殖细胞核抗原在洗脱缓冲液（50 mM Tris三羟甲基氨基甲烷，PH 7. 5)作用下洗脱。洗脱后的蛋白质与GLB缓冲液（50 mM Tris，2% SDS(w/v)溴酚蓝2% (w/v), 10%甘油，200 mM β-巯基乙醇，pH 6. 8)混合，并在95°C孵育5min。获得的试样进行SDS-PAGE (Laemmli法)处理。分离完成后，用考马斯亮蓝G-250对蛋白质进行染色。所得结果如图2所示。
[0025]实施例4.采用ELISA方法检测组氨酸标签蛋白。
[0026]一个96孔ELISA平板上覆盖人类增殖细胞核抗原蛋白（O. 5mg蛋白质/孔)。在实验中，使用了两种不同的增殖细胞核抗原蛋白：a)含有组氨酸标签以及b)不含组氨酸标签。该蛋白质在4°C下与平板结合16h。随后，用PBST缓冲液（lx PBS含有O. 5% (v/v)吐温20)冲洗ELISA板3次。之后，平板在室温下静置在含有2% (w/v)牛血清蛋白的IxPBS缓冲液中2h。接下来，用PBST缓冲液冲洗平板三次，并与5’生物素化BI或参照适配体一起，在 AS 缓冲液（137 mM NaCl, 12. 3 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, 5 mMMgC12, pH 7.4，0.1% (v/v)吐温20)中，在室温下孵育一个小时。适配体最终的浓度为0.01 mg/ml O孵育完成后，平板用PBST缓冲液冲洗三次，然后与链霉亲合素耦合辣根过氧化物酶（1:200稀释在PBS缓冲液中）一起，在室温下孵育40分钟。平板再用PBST缓冲液冲洗三次，然后在孔中加入辣根过氧化物酶底物。当蓝色出现时，通过IM的H2S04来终止反应，在波长450nm下测试吸光度。所得结果如图3所示。
【主权项】
1.一种DNA适配体，其特征在于，具有对组氨酸标签的亲和性，包含了 SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2中的任意一个核苷酸序列。2.包含如权利要求1所述的序列之一的寡聚核苷酸用于制备分子的用途，其特征在于，制备的分子对包含组氨酸标签的分子靶具有亲和性，详细来说: -作为组氨酸标签的直接抗体激动剂使用， -用于检测包含组氨酸标签的分子靶， -用于纯化包含组氨酸标签的分子靶， -用于结合包含组氨酸标签的分子靶， -用于确定包含组氨酸标签的分子靶的浓度。
【专利摘要】获得一种DNA适配体，具有对组氨酸标签的亲和性，且含有SEQ？IDNo.？1和SEQ？ID？No.？2中的任意一个核苷酸序列，并有明确的用途。
【IPC分类】C12N15/115
【公开号】CN105189753
【申请号】CN201480018979
【发明人】菲利普·巴特尼基, 艾娃·科瓦尔斯卡, 卡塔尔金娜·佩尔斯, 沃依切赫·斯特尔扎卡
【申请人】积克隆斯基大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年5月17日
【公告号】EP2997147A1, US20160060631, WO2014185802A1