生产腺病毒的方法
【专利说明】生产腺病毒的方法
[0001] 本公开设及用于制造某些腺病毒的方法W及由此获得的病毒产品，所述腺病毒例 如嵌合型腺病毒，特别是复制型腺病毒。
[000引背景
[0003]目前，制药领域正处于意识到病毒作为供人类使用的疗法的潜力的边缘。迄今为 止，衍生自0NXY-15 (ONYX制药，已被上海=维生物技术收购）的病毒已在数量有限的国家 获批准用于头颈癌。然而，当前有许多处于临床的病毒，运些中的一些应当有希望获得注册 应用于人类。
[0004] 许多病毒疗法都基于腺病毒，例如ColoAdl是当前临床试验治疗结直肠癌的嵌合 型溶瘤腺病毒（W0 2005/118825)。
[0005] 运些基于腺病毒的治疗剂需要W运样的数量被制造，即适合于支持临床试验并满 足注册后的需求且在符合良好制造规范（GMP)的条件下。
[0006] 作为制造方法的一部分，病毒在哺乳动物细胞中体外增殖，例如，在细胞悬浮培养 物中。病毒通过细胞裂解从运些细胞中回收并随后纯化。图1摘自Kamen&Hen巧2004Q GeneMed. 6:pages184-192)，显示设及GMP级腺病毒制造方法的示意图。明显地，病毒复 制之后，细胞被裂解。
[0007] 裂解之后来自细胞的污染DNA是值得注意的问题，且必须尽可能从治疗腺病毒产 品中去除。运详细描述于申请W0 2011/045381中，其中描述了裂解细胞，使细胞悬液中的 DNA片段化或沉淀，并利用切向流澄清。图1中的第S个步骤还示出用DNAse消化DNA。
[0008] 腺病毒GMP制造领域中的许多工作针对Ad5实施。现有技术显示，对于批式法，感 染后大约40小时达到最大病毒滴度，之后开始出现细胞死亡。此外，对病毒感染力降低的 关注通常通过保持任何GMP方法中最低保持处理时间来解决，所述病毒感染力是所生产病 毒活性的度量。
[0009] 简而言之，开发成功的重组腺病毒方法需要详细了解基本的宿主细胞系生理学和 代谢；重组病毒W及细胞系与病毒之间的关系。基本上，方法需要根据病毒或病毒载体的具 体类型而调整。
[0010] 本发明人令人吃惊地建立了通过运样的方法来制备嵌合型溶瘤腺病毒，所述方法 从细胞培养基中分离病毒并避免裂解细胞的必要性，因而显著减少病毒产品中DNA污染的 初始水平。
[0011] 发明概述
[0012] 因而，本公开提供了用于制造具有包含E2B区的基因组的嵌合型溶瘤腺病毒的方 法，其中所述E2B区包含来自第一种腺病毒血清型的核酸序列和来自第二种不同的腺病毒 血清型的核酸序列；其中所述第一种和第二种血清型各自独立地选自腺病毒亚群B、C、D、E 或F，其中所述方法包括W下步骤：
[0013]a.在适合于供养细胞的培养基存在下，培养用腺病毒感染的哺乳动物细胞使得所 述病毒复制，其中所述细胞能够支持病毒复制，W及
[0014]b.在培养期结束时，通过过滤从步骤a)的培养基中分离腺病毒，其中所述病毒的 分离不在细胞裂解步骤之后。
[0015] 还提供的是用于制造具有B亚群的纤突和六邻体的腺病毒（例如Adll，特别是 Adllp，又被称为Slobitski毒株）的方法，其中所述E4区的一部分被删除，所述方法包括 W下步骤：
[0016]a.在适合于供养细胞的培养基存在下，培养用腺病毒感染的哺乳动物细胞使得所 述病毒复制，其中所述细胞能够支持病毒复制，W及
[0017]b.在培养期结束时，通过过滤从步骤a)的培养基中分离所述病毒，其中所述病毒 的分离不在细胞裂解步骤之后。
[0018] 在一实施方案中，所述病毒为复制型或复制缺陷型。
[0019] 在一实施方案中，所述腺病毒已删除部分或全部E3区。
[0020] 本发明人还令人吃惊地发现，所述方法可成功地扩展至野生型Adll病毒，例如 Adllp，还可扩展至具有来自Adll的纤突和六邻体的病毒，包括Adllp。
[0021] 附图简述
[0022] 图 1 为摘自Kamen和Henry2004(JGeneMed. 6:S184-192)的示出设及GMP级 腺病毒制造方法的示意图。
[0023] 图2示出WM0I10感染的肥K293悬液的与细胞和上清液（SN)相关的感染 ColoAdl颗粒的比例。
[0024] 图3示出WM0I10 (感染复数10)感染的贴壁肥K293的与细胞和上清液（SN)相 关的感染ColoAdl颗粒的比例。
[00巧]图4示出测试感染条件下肥K293悬浮培养物的病毒颗粒总量。
[0026] 图5可视化ColoAdl感染的肥K293细胞在感染后40小时，46小时和70小时的细 胞裂解液（裂解液）或上清液（SN)中的细胞和病毒DNA。
[0027] 图6A-病毒分布（CVL或上清液），
[0028]B-总病毒产量（vp/细胞），W及
[002引 C-ColoAdl感染后各个时间点的细胞活力。
[0030] 图7A-病毒分布（CVL或上清液），
[0031]B-总病毒产量（vp/细胞），W及 [00础C-NG135感染后各个时间点的细胞活力。
[003引图8A-病毒分布（CVL或上清液），
[0034]B-总病毒产量（vp/细胞），W及
[00对 C-NG76感染后各个时间点的细胞活力。
[003引图9A-病毒分布（CVL或上清液），
[0037]B-总病毒产量（vp/细胞），W及
[003引 C-野生型Ad5感染后各个时间点的细胞活力。
[003引图10A-病毒分布（CVL或上清液），
[0040]B-总病毒产量（vp/细胞），W及
[0041]C-野生型Adllp感染后各个时间点的细胞活力。
[0042] 本文所使用的NG135设及具有插入转基因的ColoAdl病毒的衍生物。所述转基因 为全长抗体。NG135为具有添加的转基因盒的SEQID1。
[0043] 本文所使用的NG76设及具有插入转基因的ColoAdl病毒的衍生物。所述转基因 为ScFv抗体片段。NG76为具有添加的转基因盒的SEQID1。
[0044] 发明详述
[0045] 本文所使用的制造嵌合型溶瘤病毒的方法旨在系指运样的方法，其中病毒被复 审IJ，由此增加病毒颗粒的数目。特别是提供了制造足够数目的病毒颗粒W配制治疗产品，例 如可产生范围为1-9X105至1-9X102°或更多的颗粒，例如范围为1-9X108至l-9Xl〇is病 毒颗粒，特别是可由1化批式处理产生1至9X10"或1-9X10 1S病毒颗粒。
[0046] 本文所使用的部分E4区被删除意指至少一部分，例如范围为1至99%的E4区被 删除，例如删除 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、91、92、93、9495、96、97 或 98%。
[0047] 本文所使用的"衍生自"系指，例如其中DNA片段从腺病毒取得，或对应于在腺病 毒中最初发现的序列。该语言并非意味着限定序列是如何获得的，例如根据本公开，在病毒 中所使用的序列可为合成的。
[004引在一实施方案中，衍生物全长与原始DNA序列具有100%的序列同一性。
[0049] 在一实施方案中，衍生物与原始DNA序列具有95、96、97、98或99 %的同一性或相 似性。
[0050] 在一实施方案中，衍生物在严紧条件下与原始DNA序列杂交。
[0051] 如本文所使用严紧性"通常发生在约Tm(解链溫度）-50°C(比探针的Tm低5°C) 至约低于Tm2(TC至25°C的范围。如本领域技术人员所理解，严紧杂交可用来鉴定或检测相 同的多核巧酸序列或者用来鉴定或检测相似或相关的多核巧酸序列。如本文所使用，术语 "严紧条件"意指如果序列之间的同一性至少为95%，如至少97%时，通常发生杂交。
[0052] 如本文所使用，"杂交"应包括"通过碱基配对将多核巧酸链与互补链结合到一起 的任何方法"（Coombs,J. ,DictionaryofBiotechnolo邑y,StocktonPress,NewYork,N. Y. , 1994) 〇
[0053]本文所使用的"其中所述分离不在细胞裂解步骤之后"旨在系指运样的事实，制造 方法并不包括特定的裂解步骤。也就是说，其中设计条件W裂解培养物中的全部或大部分 细胞的步骤。例如，将病毒从上清液中分离。
[0054] 本文所使用的大部分设及大多数，例如80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或 99%。
[0055] 本文所使用的"在培养期结束时"系指运样的时期结束时，在该时期期间病毒在所 感染的细胞中已被允许复制。结束设及选择收获的所选择的时间点。本文所使用的结束并 非是确定的终点。在一实施方案中，在对待释放至培养基或上清液中的所复制的病毒或其 相当比例培养足够的时间之后，选定终点。在一实施方案中，收获发生在多个时间点，或者 在其被启动之后还在进行。
[0056] 有利地，本方法可简化病毒的下游处理，因为避免了细胞裂解步骤而降低了来自 细胞的污染DNA的初始浓度。运可W节约成本，因为可减少下游处理中使用的试剂、仪器和 时间。还可W是更高的纯度和较低终浓度的污染DNA和/或较低浓度的大片段的污染DNA。
[0057] 此外，通过避免细胞裂解，使病毒暴露于细胞酶最小化，运使得病毒暴露于诸如来 自细