胞的核酸酶的潜在降解剂最小化。运可W是通过例如感染力测量的更高的病毒稳定性 和/或效价。
[0058] 如果需要的话，还可避免或减少使用核酸酶来降解细胞DNA，运可能是有利的。特 别地，可避免去除核酸酶和表明不存在残留核酸酶的检测。
[0059] 有趣的是，离开细胞之后，本公开的病毒并未粘附在细胞上，因而可容易地从上清 液回收。运可能是本文所述的溶瘤病毒所特有的现象，其使本方法变得容易。相反地，野生 型Ad5被认为粘附于细胞。事实上，结果显示基本上没有野生型Ad5病毒颗粒存在于上清 液中（参见图9和表6)。
[0060] 然而不愿受理论束缚，在一实施方案中，离开细胞且不粘附于其上的能力可能与 嵌合的E2B区有关。
[0061] 在一实施方案中，离开细胞的能力可能与小的病毒基因组和/或E4和/或E3区 部分删除有关。
[0062] 在一实施方案中，本公开的病毒还包括转基因。
[0063] 在一实施方案中，没有粘附至细胞可能与溶瘤病毒的六邻体和纤突有关。
[0064] 溶瘤病毒是那些优先感染癌细胞并加速细胞死亡的病毒，例如通过裂解所感染的 细胞或在癌细胞中选择性复制。
[0065] 优先感染癌细胞的病毒是运样的病毒，与正常健康细胞相比，其显示较高的感染 癌细胞速率。
[0066] 本公开的嵌合型腺病毒可通过检测其在一组肿瘤细胞中的裂解潜能来评估其对 特定肿瘤类型的偏好，例如结肠肿瘤细胞系包括HT-29、DLD-1、LS174T、LS1034、SW403、 HCT116、SW48W及C〇1〇320DM。任何可获得的结肠肿瘤细胞系对于运样的评估都是同等有 用的。
[0067] 前列腺细胞系包括DU145和PC-3细胞。膜腺细胞系包括Panc-1细胞。乳腺肿瘤 细胞系包括MDA231细胞系，W及卵巢细胞系包括0VCA-3细胞系。造血细胞系包括但不限 于Raji和DaudiB-淋己细胞，K562成红细胞样细胞，U937髓系细胞，W及服B2T-淋己细 胞。其他可获得的肿瘤细胞系是同等有用的。
[0068] 溶瘤病毒包括那些可W在运些细胞系中被类似地评估的非嵌合型病毒，例如Ad 11，例如Adllp。
[0069] 在癌细胞中选择性复制的病毒是那些需要癌细胞中上调基因或蛋白来复制的病 毒，例如p53基因。
[0070] 在一实施方案中，嵌合型溶瘤病毒为调亡的，也就是加速程序性细胞死亡。
[0071] 在一实施方案中，嵌合型溶瘤病毒为溶细胞的。本公开的嵌合型溶瘤腺病毒的溶 细胞活性可在代表性肿瘤细胞系中测定，并且数据转换成效价的计量，例如将属于C亚群 的腺病毒，优选Ad5,用作标准（即指定效价为1)。适合于测定溶细胞活性的方法为MTS试 验（参见W0 2005/118825的实施例4,图2,其通过援引并入本文）。
[0072] 在一实施方案中，本公开的嵌合型溶瘤腺病毒引起细胞坏死。
[0073] 在一实施方案中，所述嵌合型溶瘤腺病毒针对癌细胞具有提高的治疗指数。
[0074]"治疗指数"或"治疗窗"系指表明给定腺病毒的溶瘤潜能的数目，其可通过将嵌合 型溶瘤腺病毒在相关肿瘤细胞系中的效价除W同一腺病毒在正常（即非癌性）细胞系中的 效价来确定。
[00巧]在一实施方案中，所述嵌合型溶瘤病毒在选自w下的一种或多种癌细胞中具有提 高的治疗指数：结肠癌细胞，乳腺癌细胞，头颈癌细胞，膜腺癌细胞，卵巢癌细胞，造血肿瘤 细胞，白血病细胞，胶质瘤细胞，前列腺癌细胞，肺癌细胞，黑素瘤细胞，肉瘤细胞，肝癌细 胞，肾癌细胞，膀脫癌细胞W及转移性癌细胞。
[0076] 本文所使用的嵌合型溶瘤腺病毒系指包含E2B区的腺病毒，其具有衍生自至少两 种不同的腺病毒血清型的DNA序列，并且其中所述病毒为溶瘤的。
[0077] 目前存在大约56种腺病毒血清型。表1示出了腺病毒血清型的分区：
[0078] 亚群腺病毒血清型
[0079]A 12, 18, 31
[0080]B 3, 7, 11，14, 16, 21，34, 35, 50, 55
[0081]C 1, 2, 5, 6
[0082]D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-51，53, 54, 56
[0083]E 4
[0084]F 40,41
[0085]G 52
[0086]E2B区是腺病毒中已知的区域且代表大约18%的病毒基因组。其被认为编码蛋白 IVa2,DNA聚合酶和末端蛋白。在Adi1的Slobitski毒株（被称为AdiIp)中，运些蛋白分别 在基因组序列的位点5588-3964,8435-5067和10342-8438处被编码，并且E2B区从10342 至3950。E2B区的确切位点可在其他血清型中变化，但是迄今所检测的功能在所有人腺病 毒基因组中是保守的，因为它们全部都具有相同的大体结构。
[0087] 在一实施方案中，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有B亚群六邻体。
[0088] 在一实施方案中，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有Adll六邻体，例如 A1Ip六邻体。
[0089] 在一实施方案中，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有B亚群纤突。
[0090] 在一实施方案中，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有Adll纤突，例如Allp 纤失。
[0091] 在一实施方案中，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有来自同一血清型的纤 突和六邻体，例如B亚群腺病毒，例如Adll,特别是AdiIp。
[0092] 在一实施方案中，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有来自同一血清型的纤 突，六邻体和五邻体蛋白，例如Adll,特别是Adllp，例如存在于后者的基因组序列的位点 30811-31788,18254-21100 和 13682-15367。
[0093] 与第一种病毒不同的血清型的病毒可来自同一亚群或不同的亚群，但是通常来自 不同的血清型。在一实施方案中，组合如下（第一种Ad血清型：第二种Ad血清型）：AA、 AB、AC、AD、AE、AF、AG、BB、BC、BD、BF、BG、CC、CD、CE、CF、CG、孤、DE、DF、DG、EE、邸、EG、FF、 FGW及GG。
[0094] 在一实施方案中，所述嵌合型E2B区衍生自Ad3和Adll(特别是AdiIp)。
[0095] 在一实施方案中，所述E2B区为本文SEQIDNO: 2所示的序列。
[0096] 哺乳动物细胞为源自哺乳动物的细胞。在一实施方案中，所述哺乳动物细胞选自 肥K、C册、C0S-7、HeLa、Viro、A549、化rC6W及GMK，特别是肥K293。
[0097] 在一实施方案中，细胞W贴壁或悬浮培养生长，特别是悬浮培养。
[0098] 本文所使用的培养哺乳动物细胞系指细胞在离体的受控条件下生长。合适的条 件为本领域技术人员所熟知的且可包括诸如37°C的溫度。C〇2水平可能需要受控制，例 如保持5%的水平。详细内容在W下文本中给出：动物细胞培养：基础技术与专业应用手 册，第六版，R.Ian Rreshney;细胞培养基础，第二版，J. M. Davis编（Qilture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques and Specialised Applications Edition Six R. Ian Freshney ；Basic Cell Culture(Practical Approach)Second Edition, Edited by J. M. Davis)。
[0099] 在用腺病毒感染之前，通常培养细胞W产生足够的数量。运些方法是本领域技术 人员所熟知的或在出版的手册或文献中可易于获得。
[0100]一般W工业规模培养细胞，例如化、1化、1化、2化、2化、3化、3化、4化、4化、5化、 10化、2001^、30化、4001^、50化、6001^、70化、8001^、900、10001等。
[0101] 适合于培养哺乳动物细胞的培养基包括但不限于来自Sigma-Al化ich的 EX-CELL感培养基，女日用于HEK293细胞的EX-CELL?293无血清培养基，用于CH0细胞 的EX-CELL?ACFCH0无血清培养基，用于CH0细胞的EX-C疋LL竣3膽无血清培养基， EX-CE化CD水解液融合培养基补充物，来自LonzaRMPI的（如含有肥阳S和k谷氨酷 胺的RMPI1640,含有或不含k谷氨酷胺的RMPI1640,W及含有叫traGlutamine的RMPI 1640)，MEM和DMEM，SFMII培养基。
[0102] 在一实施方案中，所述培养基不含血清。运是有利的，因为其有利于制造方法在监 管部口的登记。
[0103] 本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤病毒，具有与用作载体的那些腺病毒如Ad5不同 的特征，运包括它们能从培养基中回收而无需细胞裂解的事实。因而不愿受理论束缚，所述 病毒似乎具有离开细胞的机制。
[0104] 此外，本公开的病毒，例如嵌合型溶瘤腺病毒，在离开细胞之后似乎并不结合或粘 附细胞，运同样有利于从上清液中回收，特别是当细胞培养条件为最优化时。
[0105] 另外，所述嵌合型溶瘤病毒似乎并不会退化，即使当培养过程延长至70小时或更 久时。病毒的退化可通过测试病毒的感染力来检测。病毒的感染力随着病毒颗粒退化而降 低。
[0106] 在一实施方案中，培养期为30