至100小时，例如35至70小时，例如40、45、50、55、 60或65小时。
[0107] 在一实施方案中，培养期为65、70、75、80、85、90、95小时或更久。
[010引在一实施方案中，在64小时的时间点时，90%W上的嵌合型溶瘤病毒存在于上清 液中，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%，如95%或更多，特别是98%或更多。
[0109] 在一实施方案中，38小时之后，大量病毒在培养基中。例如，38小时之后，超过 50 %，特别是超过70 %的病毒在培养基中。
[0110] 在一实施方案中，最大总病毒产量在感染后约40至60小时达到，例如感染后49 小时。在一实施方案中，最大量之后病毒产量的降低是缓慢的。
[0111] 在一实施方案中，最大总病毒产量在感染后约70至90小时达到。
[0112] 本发明人令人吃惊地发现，当使用该方法时，感染后超过90小时，细胞保持高活 力（如80至90%活力）。因而在一实施方案中，只要细胞仍然存活，就可继续收获和处理。
[0113] 本文所使用的最大总病毒产量意指每个细胞产生的病毒颗粒总数且包括上清液 和细胞中的病毒颗粒。
[0114] 在一实施方案中，感染后49小时，对于ColoAdl，上清液中的病毒产量为约20000 至30000病毒颗粒/细胞（vp/细胞）。例如26000VP/细胞。
[0115] 在一实施方案中，感染后49小时，对于NG135,上清液中的病毒产量为约20000至 30000vp/细胞，例如26000vp/细胞。
[0116] 在一实施方案中，感染后49小时，对于NG76,上清液中的病毒产量为约6000至 lOOOOvp/细胞，例如SOOOvp/细胞。
[0117] 在一实施方案中，在64小时的时间点，即64小时之后，CVL团块中存在不到10% 的可检测的病毒，例如9、8、7、6、5、4、3、2、1 %可检测的病毒。实施例6描述了如何获得CVL。
[0118] 本文所使用的意指病毒粗裂解液。
[0119] 培养细胞可使用灌流培养，补料批式培养，批式培养，稳态培养，连续培养或者其 一种或多种的组合，只要技术上是适当的，特别是灌流培养。
[0120] 在一实施方案中，所述方法为灌流法，例如连续灌流法。
[0121] 在一实施方案中，所述培养方法包括一种或多种培养基更换。运可有利于优化细 胞生长、产量等。使用培养基更换时，从被更换的培养基中回收病毒颗粒可能是有必要的。 运些颗粒能与主要的病毒批相混合W确保病毒产量最优化。还可使用与灌流法的培养基类 似的技术来优化病毒回收。
[0122] 在一实施方案中，所述培养方法并不包括更换培养基的步骤。运可能是有利的，因 为不会损失病毒颗粒，因而产量可最优化。
[0123] 在一实施方案中，所述培养方法包括一种或多种细胞添加或更换。本文所使用的 细胞添加更换系指补充一些或全部细胞，并且任选地去除死细胞。
[0124] 在一实施方案中，所述嵌合型溶瘤腺病毒在培养期间的浓度为20至150颗粒/细 胞（ppc)，例如40至lOOppc，特别是50ppc。
[0125] 病毒浓度的下限值，例如l(K)ppcW下，特别是50ppc，可能是有利的，因为与更高 的病毒浓度相比，运样的结果是增加细胞活力，特别是在收获之前测定细胞活力时。
[0126] 低细胞活力能导致细胞裂解，运可使细胞暴露于酶，所述酶随着时间的推移可进 攻病毒。然而，在诸如细胞培养的动态过程中，一定比例的细胞，例如小比例的细胞，可能不 能存活。运在实践中通常不会引起重大问题。
[0127]在一实施方案中，用ColoAdl感染时，例如96小时的时间点（即感染后96小时）， 细胞活力在该方法中约为85至95%，例如90%的活力。
[012引在一实施方案中，用NG76感染时，例如96小时的时间点（即感染后96小时），细 胞活力在该方法中约为80至90%，例如83%的活力。
[0129] 在一实施方案中，用NG135感染时，例如96小时的时间点（即感染后96小时），细 胞活力在该方法中约为80至90%，例如85%的活力。
[0130] 在一实施方案中，用Adll感染时，例如96小时的时间点（即感染后96小时），细 胞活力在该方法中约为80至90%，例如85%的活力。
[0131] 在一实施方案中，所述培养基和/或细胞周期性增补或补充。
[0132] 在一实施方案中，在该方法中，例如在不连续的时间点或连续地收获细胞。
[0133] 在所述方法的一实施方案中，用初始浓度为l-9X104vp/ml或更大，例如 1-9X1〇5、1-9X1〇6、1-9X1〇7、1-9X1〇8、1-9X1〇9,特别是 1-5Xl〇6vp/ml或 2. 5-5X1〇\口/ ml的病毒感染所述哺乳动物细胞。
[0134] 在所述方法的一实施方案中，W1X106细胞/ml,约1至2(K)ppc，例如40至 120PPC，如50ppc的初始浓度感染所述哺乳动物细胞。
[0135] 本文所使用的PPC系指每个细胞的病毒颗粒数目。
[0136] 在一实施方案中，所述方法在约35至39°C下进行。例如37°C。
[0137] 在一实施方案中，所述方法在约4-6%C〇2下进行。例如5%CO2。
[0138] 在一实施方案中，过滤所述包含病毒例如嵌合型溶瘤病毒颗粒的培养基，W去除 细胞并提供粗上清液用于进一步的下游处理。
[0139] 在一实施方案中，使用切向流过滤器。
[0140] 在一实施方案中，使用具有基于纤维素的深层过滤器的Millipore的 Mmistak+?POD系统来过滤培养基。Millistak+@|深层过滤器培养基W可量的一次性 形式提供，即Pod过滤器系统（PodFilterSystem)。理想的是，各种一级和二级净化应用， 包括细胞抬养。
[0141] Mi川stak+K'Pod过滤器有S种不同的介质级别W满足特定的应用需求。 M川istak+'KDE，CI';和HC介质通过梯度密度基质W及带正电的表面电荷性质表现出最 佳的性能。在一实施方案中，过滤受到切向流技术的影响，例如采用Cogent?M系统，其包含PelliconMini盒式膜支架、压力传感器、10升带揽拌器的循环罐、渗余液流量计、称重计、 进料累、输送累、管道和阀口。除半自动的渗滤和浓缩外，系统的控制和操作为手动。操作 员手动控制累转速、所有阀口W及操作程序。如果需要，在此步骤中所述病毒同样可W配制 成最终的缓冲液。
[0142] 因此，在一实施方案中，在过滤步骤中，提供最终或接近最终制剂的浓缩且经调节 的腺病毒材料。
[0143] 在一实施方案中，所述方法包括两个或多个过滤步骤。
[0144] 在一实施方案中，所述下游处理包括串联的Mi11istak+POD系统35CE和50CE盒， 随后的opticapXLlOexpress0. 5/0. 2ym膜过滤器。
[0145] 在一实施方案中，所述方法还包括纯化步骤，选自CsCl梯度法，色谱法步骤，例如 尺寸排阻色谱法，离子交换色谱法，特别是阴离子交换色谱法，W及它们的组合。
[0146] 离子交换色谱法可W强力结合DNA，因此常用于除去任何残留的DNA。离子交换树 脂/膜结合病毒和DNA，在盐梯度洗脱期间，病毒通常先从柱子中洗脱出来（低盐梯度），而 DNA在盐浓度更高很多时才被洗脱，因为DNA与树脂之间的相互作用比病毒更强。
[0147] 在一实施方案中，所述色谱步骤采用整体柱（monolith)技术，例如可由BIA Separations获得。
[0148] 在一实施方案中，采用SartobindQ(季胺膜纯化过程）作为纯化步骤。
[0149] 在一实施方案中，在纯化步骤中采用SourceQRESIN。
[0150] 在一实施方案中，在所分离的病毒下游处理中使用SartobindQ随后SourceQ RESIN。
[0151] 在一实施方案中，在纯化步骤中使用SourceQ。
[0152] 在一实施方案中，纯化后所制备的病毒含有的污染DM少于80ng/mU例如，6化g/ ml至1化g/血之间。
[0153] 在一实施方案中，所有污染DNA片段基本上为700碱基对或更少，例如500bp或更 少，例如2(K)bp或更少。
[0154] 在一实施方案中，在纯化的病毒产品中残留的核酸酶含量为Ing/mL或更少，例如 0. 5ng/mL或更少。
[0155] 在一实施方案中，在纯化的病毒产品中残留的宿主细胞蛋白含量为20ng/mL或更 少，例如15ng/血或更少，特别是采用ELISA测试测定时。.
[0156] 在一实施方案中，在纯化的病毒产品中残留的吐溫为0.Img/ml或更少，例如 0. 05mg/ml或更少。
[0157]在一实施方案中，所述病毒具有来自B群腺病毒的六邻体和纤突，例如Adi1，特别 是其中所述病毒为ColoAdl。
[0158] 在一实施方案中，提供了分离纯化的ColoAdl，其中污染DM含量小于80ng/mL。
[0159]ColoAdl在WO2005/118825已公开，该病毒的全序列在本文中提供，即SEQID No:l。
[0160] 其他的嵌合型溶瘤病毒包括OvAdl和0vAd2,其分别为WO2008/080003中公开的 沈QIDNO:2和3,通过援引并入本文。
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