可延展聚合物内的核酸的检测和定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供了从粘附于可W在活生物体内延展的聚合物、特别是可W在所述活生 物体的口腔中延展的聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物或哺乳动物细胞提取核酸的 方法。本发明还提供了粘附于可延展聚合物例如口香糖或俘获在其中的微生物的检测和定 量方法。
【背景技术】
[0002] 关于口香糖首次使用的描述可W追溯到古希腊，在那里人们使用来自于乳香黄连 木的树脂来止渴或清新口气。直至19世纪晚期，第一块口香糖才成功上市，在那时，人屯、果 树的橡胶状树汁形成了 口香糖的基础。在20世纪晚期，口香糖不仅被当作生活方式的象 征，而且也已报道了对认知表现、情绪、警觉性和食欲控制的影响。此外，口香糖已被更多地 朝向口腔护理和功能性食品（"营养品"）方向开发，因为它提供了容易应用的药物递送介 质，对口腔健康具有潜在益处。高达每人每年2. 5kg的高消费率已使其成为数十亿美元的 产业。
[0003] -般来说，口香糖由被称为胶基的合成弹性体如聚乙酸乙締醋或聚异下締的水不 溶性混合物构成。对胶基材料的重要要求是它们在口中不溶解，并且可W被长时间巧嚼而 不经历组成变化。在所有可商购的口香糖中，胶基被增补有结构剂、软化剂和调味剂，而目 前，糖常常被人造甜味剂例如山梨糖醇、木糖醇或甘露糖醇代替。
[0004] 据描述，包含木糖醇和其他人造甜味剂能减少牙齿上口腔生物膜的形成。口腔生 物膜是世界上最普遍的感染性疾病、即離齿和牙周病的病因。離齿由牙釉质的天然存在的 去矿化与再矿化之间的失衡造成。当由于糖被牙齿上口腔生物膜的所选成员发酵而造成口 腔生物膜的pH下降到低于5. 5时，发生去矿化。大多数人造糖不被或几乎不被口腔细菌发 酵，因此不降低抑。此外，日香糖引起巧嚼增加，其刺激唾液产生，因此提高了日腔中再矿 化所需的巧和憐酸盐的浓度。已向商品化口香糖添加了氣化物，W防止牙釉质去矿化并刺 激再矿化。将巧嚼口香糖当作每日口腔卫生程序的补充是有吸引力的，特别是因为古往今 来大多数人不能维持预防疾病所需的口腔生物膜控制水平。运导致了向口香糖渗入抗微生 物剂例如氯己定和草药提取物，并且事实上已证明口香糖在防止口腔生物膜的重新生长方 面是成功的。尽管已知巧嚼口香糖有助于除去齿间残渣化ako化ar等，DentalResearch Journal7:64 - 69, 2011)，并且已向口香糖添加去污剂例如多憐酸盐W提高它们的清洁 力，但尚不清楚巧嚼口香糖是否真正从口腔除去细菌。特别是通过口香糖优先除去引起疾 病的生物体例如产酸的变异链球菌（Streptococcusmutans)或被视为牙釉质的初始定植 者的物种，使口香糖变成每日口腔卫生程序的有价值的补充。
[0005] 人类口腔含有不同且大量的菌群，并且胃肠系统和呼吸系统的许多疾病可W在口 腔中显现。还存在许多口腔特有的疾病。除了细菌生物体之外，口腔微生物可W包括真菌、 原生动物和病毒物种，并且许多运些微生物粘附于牙齿、銀沟、舌和颊粘膜。每个位点具有 允许生物体实现驻留的独特方式。许多运些微生物可能粘附于它们在口腔中时接触的聚合 物，并且运些聚合物除了包括如上所述的口香糖之外，还包括牙科和牙周器具和组合物。
[0006] 因此，对于开发检测、鉴定和定量粘附于口腔中的聚合物或俘获在所述聚合物内 的微生物、例如在使用后被捕获在口香糖中的细菌的新方法，存在着需求。
【发明内容】
[0007] 已知口香糖对维持口腔健康有贡献；然而，尚不清楚口香糖是否能够实际上从口 腔除去细菌和其他微生物。本发明提供了一种使用扩增方法例如定量聚合酶链反应（PCR) 来检测和定量来自于微生物的核酸的方法，所述微生物粘附于活生物体口腔内的可延展聚 合物例如口香糖的外表面和/或俘获在所述聚合物的内表面中。本文中提供的研究描述了 一种定量和定性被捕获在巧嚼后的口香糖中的细菌的数量的方法（体外或体内）。
[0008] 本发明提供了从可W在活生物体内延展的聚合物提取核酸的方法，所述方法包 括：a)将所述聚合物与i)有机溶剂和ii)缓冲溶液相接触，W及b)分离所述有机溶剂和 缓冲溶液，其中从所述聚合物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液内。本发明设想了在所述 聚合物与活生物体相接触后执行所述从聚合物提取核酸的方法。所述方法可W在体外或所 述活生物体外部执行。
[0009] 运些方法还可W包括鉴定从所述聚合物提取的核酸的来源的步骤，和/或对从所 述聚合物提取的核酸进行定量的步骤。使用扩增方法例如聚合酶链反应、链置换、连接酶链 反应、解旋酶依赖性扩增、等溫逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等溫 扩增和基于序列的扩增来进行鉴定步骤或定量步骤。
[0010] 本发明的方法从可W在活生物体中延展、例如可W在活生物体的口腔中延展的聚 合物提取核酸。术语"可W在活生物体中延展"是指在活生物体中的溫度和抑下是柔性和 初性的聚合物，但在暴露于由所述生物体施加的不同力和条件（例如溫度、pH、酶）时聚合 物的组成是稳定的。例如，本发明的方法包括对由生物体施加的力（例如牙齿或牙銀的巧 嚼、研磨或咬切）、生物体中的溫度（例如生物体口腔的溫度）或化学条件（例如由生物体 产生的酶、活生物体口腔的pH)做出响应可W延展的聚合物。运些可延展聚合物可能是有 机的（具有碳基（carbonbase))，因此运些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。 运样的聚合物的实例包括口香糖、泡泡糖或胶基。
[0011] 在一种实施方式中，在本发明的任何方法中使用的可延展聚合物是弹性体，例如 聚乙酸乙締醋、聚下締、聚异下締、异下締-异戊二締共聚物（下基弹性体）、苯乙締-下 二締、苯乙締-下二締共聚物、聚乙酸乙締醋、聚异戊二締、聚乙締、乙酸乙締醋-月桂酸 乙締醋共聚物，娃酬、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶（sorva)和己拉塔树胶（massaran化ba balata)或其组合。
[0012] 在另一种实施方式中，在本发明的任何方法中使用的可延展聚合物在牙科或牙周 组合物、器具或装置内。例如，所述可延展聚合物可W是包含在牙髓（牙科）或牙周器械 或组合物上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在牙套、填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内 嵌体、牙科外嵌体和镶盖中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科装置（例如支架或 承载物）、颂面器具例如聘裂板、上颂支架和正崎矫治器上或其中。运些可延展聚合物是甲 基丙締酸甲醋、聚甲基丙締酸甲醋（PMM)、聚甲基丙締酸乙醋（PEM)、甲基丙締酸甘油醋 (GMA)、二甲基丙締酸S乙二醇醋灯EGDMA)、双酪A-甲基丙締酸甘油醋度IS-GMA)、古塔波 胶（guttapercha)和聚下締，包括a-下締、顺下締、P-下締、反P-下締、异下締、尼龙 和可生物降解聚合物例如聚丙交醋（PLA)或其组合。
[0013]在本发明的任一方法中，使用有机溶剂和缓冲溶液从聚合物提取核酸。术语"有机 溶剂"是指能够溶解或分散一种或多种其他物质的基于碳的溶剂。可W使用有机溶剂例如 氯仿、二甲苯、甲苯、1,2-二氯苯、己烧、四氨巧喃、二氯甲烧或丙酬来进行本发明的任一方 法。
[0014] 术语"缓冲溶液"是指由弱酸及其共辆碱或弱碱及其共辆酸的混合物构成W便 保持溶液的抑几乎恒定的水性溶液。可W使用分子生物学领域中常规的并且核酸在其 中稳定的任何缓冲溶液，例如Tris缓冲液、TBE缓冲液灯ris-棚酸-EDTA)和TAE缓冲液 灯ris-乙酸-EDTA)来进行本发明的任一方法。在特定实施方式中，缓冲溶液是包含S(径 甲基）氨基甲烧的化is缓冲液。化is缓冲液也被称为化is碱、T;rizma、T;risamine、THAM、 氨下S醇、氨基下S醇和缓血酸胺灯romethane)。
[0015] 在本发明的任一方法中，所述聚合物可W被有机溶剂部分或完全溶解。
[0016] 在本发明的任一方法中，从所述聚合物的内表面提取核酸。本发明还提供了从所 述聚合物提取核酸的方法，其中至少约99%的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的 核酸被提取，至少约98%的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少 约95%的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约90%的粘附于 所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约85 %的粘附于所述聚合物或俘获 在所述聚合物中的核酸被提取，至少约80 %的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的 核酸被提取，至少约75%的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少 约60%的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约55%的粘附于 所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，或至少约50 %的粘附于所述聚合物或俘 获在所述聚合物中的核酸被提取。
[0017] 在一种实施方式中，本发明提供了从粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的 微生物、包括俘获在所述聚合物的内表面中的微生物或粘附于所述聚合物的外表面或俘 获在所述聚合物的外表面中的微生物提取核酸的方法。例如，本发明提供了其中核酸的 来源是细菌、病毒、真菌或原生动物的方法。具体来说，核酸的来源可W是口腔的病原细 菌或共生细菌，例如变异链球菌（Streptococ州Smutans)、口腔链球菌（Streptococ州S oralis)、内氏放线菌（Actinomycesnaeslundii)、血链球菌（Streptococcussanguinis)、 牙銀化P林单胞菌任orphyromomasgingivalis)、中间化P林单胞菌（Po巧hymomas intermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直月易 弯曲杆菌（Camp}dobacterrectus)、纠缠真杆菌巧ubacteriumnodatum)、微小消化链 球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、 Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体（Treponemadenticola)、晒蚀 艾肯菌巧：ikenellacorrodens)、牙銀二氧化碳嗜纤维菌（Capno巧to地agagingivalis)、 格氏链球菌（Streptococ州sgordonii)、小韦荣氏球菌（Veillonellaparvula)、核粒梭杆 菌（F'usobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌（Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆 菌(Xactobacillussalivarius)、唾液链球菌（Str巧tococ州Ssalivarius)和远源链球菌 (Streptococcussobrinus)。
[0018] 在另一种实施方式中，本发明提供了从哺乳动物细胞提取核酸的方法，所述哺乳 动物细胞例如人类细胞、犬类细胞、猫类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、牛类细胞、马类细胞、绵 羊细胞、山羊细胞、灵长类细胞、来自于水生哺乳动物例如嫁和海豚的细胞W及来自于其他 外来哺乳动物的细胞。例如，本发明提供了其中核酸的来源是上皮细胞、鱗状细胞、成纤维 细胞、干细胞或角膜细胞的方法。本发明还提供了从癌细胞提取核酸的方法。
[0019] 本发明的另一方面是粘附于可W在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合 物内的微生物的检测方法，所述方法包括：a)将至少一部分所述聚合物溶解在有机溶剂和 缓冲溶液中，b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述微生物提取的核酸被包含在所 述缓冲溶液内，W及C)使用至少一种对所述微生物特异的寡核巧酸引物扩增所述核酸。此 夕F，所述方法可W使用两种或更多种引物、=种或更多种引物来进行。在运种方法中，所检 测的微生物可能粘附于所述聚合物的外表面或俘获在所述聚合物的外表面中或俘获在所 述聚合物的内表面中。本发明设想了在将聚合物与活生物体相接触后执行检测粘附于所述 聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的方法。所述方法在体外或所述活生物体的外部进 行。运些方法的执行可用于质量控制目的，例如在食品安全、食品腐败和发酵领域中工作， 并用于与食品相接触的聚合物例如包装物中的聚合物的微生物风险评估。运些方法的执行 也可用于诊断对象口腔的感染、疾病、障碍或病症，用于确定对象发生疾病、障碍或病症的 易感性，或用于产生对象的微生物分布情况（profile)。
[0020] 可W使用本领域中已知的任何方法来进行运些方法的扩增步骤。例如，可W使用 聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等溫逆转录-嗜热性解旋酶依 赖性扩增、滚环扩增、环介导等溫扩增、基于序列的扩增或基于序列的扩增来扩增粘附于聚 合物或俘获在聚合物中的微生物的核酸。
[0021] 运些方法还可W包括对粘附于聚合物或俘获在聚合物中的微生物的数量进行定 量的步骤。使用扩增方法例如聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等 溫逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等溫扩增或基于序列的扩增来进 行鉴定步骤或定量步骤。
[0022] 本发明提供了粘附于可W在活生物体内延展的聚合物例如口香糖、泡泡糖或胶基 或俘获在所述聚合物中的微生物的检测方法。运些可延展聚合物可能是有机的（具有碳 基），因此运些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。在一种实施方式中，所述可延 展聚合物是弹性体例如聚乙酸乙締醋、聚下締、聚异下締、异下締-异戊二締共聚物（下基 弹性体）、苯乙締-下二締共聚物、聚乙酸乙締醋、聚异戊二締、聚乙締、乙酸乙締醋-月桂酸 乙締醋共聚物、娃酬、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和己拉塔树胶或其组合。
[0023] 在另一种实施方式中，微生物粘附或俘获在其中的可延展聚合物可W在牙科或牙 周组合物、器具或装置内。例如，可延展聚合物可W是包含在牙髓（牙科）或牙周器械或组 合物上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内嵌体、牙科 外嵌体和镶盖中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科装置（例如支架或承载物）、颂 面器具例如聘裂板、上颂支架和正崎矫治器上或其中。运些可延展聚合物是甲基丙締酸甲 醋、聚甲基丙締酸甲醋（PMMA)、聚甲基丙締酸乙醋（PEMA)、甲基丙締酸甘油醋（GMA)、二甲 基丙締酸S乙二醇醋（TEGDMA)、双酪A-甲基丙締酸甘油醋度IS-GMA)、古塔波胶和聚下締， 包括a-下締、顺下締、0-下締、反P-