油S醋、乙酷化的甘 油单醋、脂肪酸（例如硬脂酸、栋桐酸、油酸和亚油酸）及其组合。着色剂和增白剂可W包 括抑&C类型的染料和色淀，水果和植物提取物，二氧化铁及其组合。胶基可W包含或可W 不包含蜡。
[006引除了水不溶性胶基部分之外，典型的口香糖组合物包括水溶性增量部分和一种或 多种调味剂。水溶性部分可W包括增量甜味剂、高强度甜味剂、调味剂、软化剂、乳化剂、着 色剂、酸化剂、填充剂、抗氧化剂和提供所需属性的其他组分。
[0069]向口香糖添加软化剂是为了优化口香糖的巧嚼性能和口感。软化剂，也被称为增 塑剂和塑化剂，一般占口香糖重量的约0. 5 %至约15 %。软化剂可W包括甘油、卵憐脂及其 组合。水性甜味剂溶液例如含有山梨糖醇、氨化淀粉水解物、玉米糖浆及其组合的那些水性 甜味剂溶液，也可W在口香糖中用作软化剂和粘合剂。
[0070] 增量甜味剂包括糖和无糖组分两者。增量甜味剂一般占口香糖重量的约5%至约 95%，更通常为口香糖重量的约20 %至约80%，更通常为口香糖重量的约30 %至约60%。 糖类甜味剂一般包括在口香糖技术领域中公知的含糖组分，包括但不限于单独或组合的薦 糖、右旋糖、麦芽糖、糊精、干粉转化糖、果糖、左旋糖、半乳糖、玉米糖浆固形物等。无糖甜味 剂包括但不限于糖醇例如单独或组合的山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、氨化淀粉水解物、麦 芽糖醇等。
[0071]高强度甜味剂也可W单独或与上述物质组合使用。优选的甜味剂包括但不限于单 独或组合的=氯薦糖、阿斯己甜、安赛蜜的盐、阿力甜、糖精及其盐、环拉酸及其盐、甘草酸 盐、二氨查尔酬、奇异果甜蛋白、罗汉果、应乐果甜蛋白、甜叶菊及其糖巧等。为了提供更持 久的甜味和香味感受，可能希望包封或W其他方式控制至少一部分人造甜味剂的释放。诸 如湿法成粒、蜡法成粒、喷雾干燥、喷雾激冷、流化床包衣、凝聚和纤维延伸的技术可用于获 得所需的释放特征。
[0072] 糖和/或无糖甜味剂的组合可用于口香糖中。此外，软化剂也可W提供额外的甜 味，例如使用水性糖或糖醇溶液。
[007引有机溶剂
[0074] 本发明的方法包括将可延展聚合物溶解在有机溶剂中。溶剂是能够溶解或分散一 种或多种其他物质的物质。有机溶剂是碳基溶剂（即它们在分子结构中含有碳）。可W在 本发明的方法中使用的示例性的有机溶剂包括氯仿、二甲苯、甲苯、1，2-二氯苯、己烧、四氨 巧喃、二氯甲烧或丙酬。
[0075] 缓冲液
[0076] 术语"缓冲溶液"是指由弱酸及其共辆碱或弱碱及其共辆酸的混合物构成并且被 用于使溶液的抑保持几乎恒定的水性溶液。在本发明的方法中使用的缓冲溶液是中性或 微碱性的，并保持核酸稳定。在本发明的任一方法中使用的示例性缓冲液示出在表1中。
[0077] 表1 -常用生物缓冲液
[0078]
[0079] 术语"Tris缓冲液"是指包含S(径甲基）氨基甲烧的缓冲溶液。Tris缓冲液也 被称为化is碱、Trizma、Trisamine、THAM、氨下S醇、氨基下S醇和缓血酸胺。
[0080] 也可W使用包含Tris的缓冲溶液例如TAE缓冲液灯ris-乙酸-EDTA，其是含有 化is碱、乙酸和邸TA的溶液）或TBE缓冲液灯ris-棚酸-邸TA，其含有化is碱、棚酸和 邸TA)来进行本发明的方法。
[0081]或者，可W使用棚酸裡缓冲液（LB)(其是含有单水氨氧化裡和棚酸的溶液）或棚 酸钢缓冲液（SB)来进行本发明的方法。
[008引核酸
[0083] 术语"核酸"、"核酸序列"或"核酸分子"是指DNA或RNA序列。该术语涵盖了由 已知的DNA和RNA的任何碱基类似物形成的分子，所述碱基类似物例如但不限于4-4-乙酷 基胞喀晚、8-径基-N6-甲基腺嚷岭、氮丙晚基-胞喀晚、假异胞喀晚、5-(簇基径甲基）尿 喀晚、5-氣尿喀晚、5-漠尿喀晚、5-簇基甲基氨基甲基-2-硫尿喀晚、5-簇基-甲基氨基 甲基尿喀晚、二氨尿喀晚、次黄巧、N6-异戊締基腺嚷岭、1-甲基腺嚷岭、1-甲基假尿喀晚、 1-甲基鸟嚷岭、1-甲基次黄巧、2,2-二甲基-鸟嚷岭、2-甲基腺嚷岭、2-甲基鸟嚷岭、3-甲 基胞喀晚、5-甲基胞喀晚、N6-甲基腺嚷岭、7-甲基鸟嚷岭、5-甲基氨基甲基尿喀晚、5-甲 氧基氨基-甲基-2-硫尿喀晚、P-D-甘露糖基Q巧、5' -甲氧基幾基-甲基尿喀晚、5-甲 氧基尿喀晚、2-甲基硫-N6-异戊締基腺嚷岭、尿喀晚-5-氧乙酸甲醋、尿喀晚-5-氧乙酸、 oxybutoxosine、假尿喀晚、Q巧、2-硫胞喀晚、5-甲基-2-硫尿喀晚、2-硫尿喀晚、4-硫尿 喀晚、5-甲基尿喀晚、N-尿喀晚-5-氧乙酸甲醋、尿喀晚-5-氧乙酸、假尿喀晚、Q巧、2-硫 胞喀晚和2,6-二氨基嚷岭。
[0084] 本发明的方法可W检测和/或定量天然存在的或"天然"核酸或非天然存在的、非 天然的人造、合成的或人造核酸。术语"天然存在的"或"天然的"当与生物材料例如核酸 分子、多肤、宿主细胞等联合使用时，是指在自然界中存在并且没有被人为操作的材料。类 似地，"非天然存在的"或"非天然的"当在本文中使用时，是指在自然界中不存在的或已被 人类在结构上修改或合成的材料。
[00财术语"提取的核酸"是指（1)当从来源细胞分离总DNA时，已与至少约50%的天然 存在的蛋白质、脂类、糖类或其他材料分离开，并且（2)不与所述"提取的核酸"在自然界中 连接的多核巧酸的全部或一部分相连的核酸。优选地，本发明的分离或提取的核酸分子基 本上不含在其天然环境中存在的任何其他污染的核酸分子或其他污染物。
[008引扩增核酸的方法
[0087] 本发明的方法包括对从粘附于聚合物或俘获在聚合物中的微生物提取的核酸进 行扩增。术语"扩增方法"是指通过片段的复制增加核酸序列的特定片段的拷贝数的任何 方法。通常使用热循环仪来进行运些方法。
[0088] 聚合酶链反应（PCR)是最常用的核酸扩增方法，其使用至少两种引物和DNA聚合 酶。实时PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是一种扩增和定量核酸的非常灵敏的方法。实时 PCR检测反应过程中核酸扩增的产物，并且对于确定初始祀的拷贝数来说通常被认为比终 点PCR更准确。
[0089] 其他核酸扩增方法包括使用链置换DNA聚合酶的链置换（SDA)，等溫扩增方法例 如解旋酶依赖性扩增（HDA)和等溫逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增（RT-tHDA)，可W合成 环状核酸的多个拷贝的作为单向核酸复制的滚环扩增（RCA)，使用单一溫度溫育进行扩增 的环介导等溫扩增（LAMP)，作为使用热稳定DNA连接酶和热稳定DNA聚合物来扩增祀核酸 的核酸扩增方法的连接酶链反应化CA)，作为扩增RNA和体外转录的一步等溫方法的基于 核酸序列的扩增（NASBA)。可W使用本领域中标准的技术来进行运些方法。本发明还设想 了使用序列分析来验证使用PCR扩增的DNA片段的同一性。
[0090] 在本发明的方法中，可W使用"PCR反应混合物"来进行PCR，它是适用于执行PCR 的混合物。PCR反应混合物含有适量的热稳定DNA聚合酶；待扩增的线性或环状的模板DNA、 优选为双链DNA;-对寡核巧酸引物，使得一条引物被构造成退火到模板的一条链，另一条 引物被构造成退火到模板的另一条或互补链;ATP;适量的各个四种脱氧核糖核巧=憐酸 (dNT巧；W及缓冲液、盐例如MgC12、防腐剂、还原剂和可能需要的水。
[0091] 可W对寡核巧酸引物进行设计W特异性扩增对目标基因或鉴定特定微生物的基 因来说特异的核酸。在设计寡核巧酸引物时，引物的长度取决于它的（A+T)含量和它的配 偶体的Tm。此外，引物应该足够复杂，W降低引物退火到所选祀之外的其他序列的可能性。 本发明的方法可W利用长度在10-30个核巧酸范围内的引物；优选地，引物长度为17个核 巧酸。一般来说，对引物推荐40 % -60 %的G+C含量，W避免内部二级结构和任一种碱基的 长区段。此外，引物不应退火到具有比引物更高的烙点的二级结构区域（祀内）。
[0092] 寡核巧酸引物可W是扩增在所有类型的特定微生物中存在的核酸序列的通用引 物，例如对任何类型的细菌、真菌、病毒或原生动物特异的通用引物，例如用于细菌核糖体 16SrRNA基因的引物。例如，通用引物可W特异性针对特定类型的细菌，例如特异性针对 厌氧细菌的通用引物、特异性针对好氧细菌的通用引物、特异性针对革兰氏阴性细菌的通 用引物或特异性针对革兰氏阳性微生物的通用引物。此外，通用引物可W特异性针对微生 物的特定属，例如扩增链球菌特异性的核酸序列的通用引物，或者通用引物可W特异性针 对微生物的特定种，例如扩增变异链球菌（Streptococcusmutans)特异性的核酸序列的通 用引物，通用引物可W特异性针对微生物的特定株，例如扩增变异链球菌（Streptococcus mutans)MT8148特异性的核酸序列的通用引物。
[0093] 脱氧核糖核巧=憐酸（dNT巧包括2'-脱氧腺巧-5'憐酸（dATP)、2'-脱氧 胞巧-5' 憐酸（dCT巧、2'-脱氧鸟巧-5' 憐酸（dGT巧和2'-脱氧胸巧-5' 憐酸（dTT巧。一般来说，PCR反应中dNTP的浓度为约200yM。重要的是保持4种dNTP的浓度高于每种dNTP的估算Km(l〇yM-15iiM)，并为最佳碱基渗入进行平衡。等摩尔浓 度地降低dNTP和儀离子的浓度可W提高保真度。也可W使用修饰的dNTP(dig-ll-加TP、 5-漠-加TP、次黄巧、生物素-11-加TP、生物素-16-加TP和7-去氮杂dGT巧和2'-脱氧 尿巧-5'憐酸（加TP)。
[0094] 此外，除了PCR和其他扩增方法之外，可W使用任何常规测定法对提取的核酸进 行分析，W鉴定特定序列的来源或存在/表达。运些测定法可W代替扩增方法或与扩增方 法相组合来进行。示例性的测定法包括常规和脉冲场Southern印迹、Nodhern印迹、变 性梯度凝胶电泳、斑点印迹杂交、条形印迹杂交、微阵列、外切核酸酶活性、巧光原位杂交 (FISH)或通过阻遏蛋白结合进行的原位定位。
[0095] 微生物
[0096] 本发明提供了检测粘附于在活生物体内可延展的聚合物或俘获在所述聚合物中 的微生物的检测方法。此外，本发明提供了确定来自于活生物体的唾液样品的微生物分布 情况的方法。唾液样品的微生物分布情况可用于确定生物体发生離齿或牙周疾病的易感性 或风险，不论所述微生物目前是否引起感染。此外，本发明的方法可用于质量控制方法，w确定聚合物对微生物的附着或俘获易感还是有抗性。
[0097]"微生物"是指微小的生物体，其可W是单细胞或多细胞生物体，并且对宿主生物 体来说可W是病原性或共生的。本发明提供了粘附于可W在活生物体内延展的聚合物或俘 获在所述聚合物中的微生物的检测和定量方法，并且运些微生物包括细菌、病毒、真菌和原 生动物。
[0098] 细菌可W是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌W及厌氧或好氧细菌。本发明特别设 想了检测口腔细菌例如共生口腔细菌和病原口腔细菌例如链球菌（streptococci)、乳芽 胞杆菌（lactobacilli)、葡萄球菌（staphylococci)、棒状杆菌（cOTynebacteria)、放线 菌（actinomcyessp.)、梭形杆菌（fusobacteriumsp.)和各种不同厌氧菌、尤其是拟杆 菌化acteroides)的方法。示例性的口腔细菌包括变异链球菌（Str巧tococ州Smutans)、 口腔链球菌（Str巧tococcusoralis)、唾液链球菌（Str巧tococcussalivarius)、 内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、 牙銀化P林单胞菌任orphyromomasgingivalis)、中间化P林单胞菌（Po巧hymomas intermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直月易 弯曲杆菌（Camp}dobacterrectus)、纠缠真杆菌巧ubacteriumnodatum)、微小消化链 球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、 Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体（Treponemadenticola)、晒蚀 艾肯菌巧：ikenellacorrodens)、牙銀二氧化碳嗜纤维菌（Capno巧to地agagingivalis)、 格氏链球菌（Streptococ州sgordonii)、小韦荣氏球菌（Veillonellaparvula)、核粒梭杆 菌（F'usobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌（Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆 菌(Xactobacillussalivarius)、唾液链球菌（Str巧tococ州Ssalivarius)和远源链球菌 (Streptococcussobrinus)。
[0099]病毒可W是瘤疹病毒科的成员例如人类瘤疹病毒（HHV)，包括HHV-1 (也称 为单纯性瘤疹病毒化SV) -1)、HHV-2化SV-2)、HHV-3 (也称为水痘-带状瘤疹病毒）、 HHV-4 巧pstein-Barr病毒）、HHV-5 (巨细胞病毒）、HHV-6、HHV-7 和HHV-8。
[0100] 病毒可W是小核糖核酸病毒科（肠病毒属）的成员，例如脊髓灰质炎病毒、A组柯 萨奇病毒、B组柯萨奇病毒、埃可病毒。具体来说，病毒可W是引起手足口病的病毒例如柯萨 奇病毒A16、A5、A7、A10、B2和B5,引起瘤疹性咽峡炎的病毒例如柯萨奇病毒A1-6、A8、A10 和A22W及肠病毒7UEV-71)。
[0101] 病毒可W是乳多空病毒科的成员例如人乳头瘤病毒家族（HPV)，包括HPV-16、 HPV-18、HPV-33和HPV-35。病毒可W是副粘病毒科（腮腺炎病毒属）的成员例如腮腺炎病 毒、新城疫病毒、人类副流感病毒2型、4a型和4b型。病毒可W是副粘病毒科（麻疹病毒 属）的成员。此外，病毒可W是披膜病毒科（风疹病毒属）的成员。病毒也可W是犬口腔 乳头瘤病毒、猫杯状病毒和猫瘤疹病毒。
[0102] 病毒还可W是流感病毒例如人类