流感病毒A型如化N1和H3N3、人类流感病毒B型 和人类流感病毒C型。病毒可W是引起普通感冒的病毒例如鼻病毒。
[0103] 已知某些瘤疹病毒（单纯性瘤疹病毒和引起水痘和带状瘤疹的水痘-带状瘤疹病 毒）是牙銀炎的病因。其他瘤疹病毒（巨细胞病毒和化stein-Barr病毒）也可能在某些 类型的牙周疾病、包括侵袭性和严重慢性牙周疾病的发作或发展中发挥作用。所有瘤疹病 毒经历活动期，然后是潜伏期W及可能的重新激活。运些病毒可能W不同方式引起牙周疾 病，包括释放组织破坏性细胞因子、牙周细菌的过度生长、抑制免疫因子和引发引起细胞死 亡的其他疾病过程。
[0104]本发明的方法可W检测真菌例如假丝酵母如白假丝酵母（Candidaa化icans)、曲 霉（Aspergillus)、新型隐球菌（Cryptococ州Sneoformans)、格特隐球菌（Cryptococ州S gattii)、芙膜组织胞浆菌化istoplasmacapsulatum)、皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis)、己西副球抱子菌（Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球抱子菌 (Coccidiodesimmites)和接合菌狂ygomycota)。
[0105] 本发明的方法可W检测原生动物，例如銀内阿米己巧ntamoebagingivalis)和口 腔毛滴虫（Trichomonasten曰x)。
[0106] 本发明设想了检测引起口腔疾病和障碍或与其相关的微生物，所述口腔疾病和障 碍例如牙周疾病（牙銀组织的炎症或感染）例如慢性牙周炎和急性成人牙周炎、牙銀炎 例如急性坏死溃瘍性牙銀炎、樊尚咽峡炎、離齿、瘤疹病毒感染、原发性瘤疹性銀口炎或口 腔瘤疹（唇瘤疹和口溃瘍）、生殖器瘤疹、水痘-带状瘤疹病毒感染例如水痘或带状瘤疹、 流感、普通感冒、性病、单核细胞增多症、柯萨奇病毒感染例如手足日病、瘤疹性咽峡炎、急 性淋己结性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、风疹（德国麻疹）、非洲伯基特淋己瘤、鼻咽癌、口 腔毛状白斑症、幼儿急疹、卡波西肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎（碟口疮）、急性 萎缩性（红斑性）念珠菌病、慢性增生性念珠菌病、和慢性萎缩性（红斑性）念珠菌病、 曲霉病、隐球菌病、组织胞浆菌病（也称为化ve病、达林氏病值arling'sdisease)、俄亥 俄山谷病、网状内皮增殖病、Spelunker肺病和化ver病）、芽生菌病（也称为北美芽生菌 病、芽生菌性皮炎和Gilc虹ist病）、副球抱子菌病（也称为己西芽生菌病、南美芽生菌病、 Lutz-Splendore-deAlmeida病和副球抱子菌肉芽肿）、毛霉菌病（由毛霉引起）、藻菌病 (由藻菌引起）和蛙粪霉菌病（由蛙粪霉菌引起）和接合菌病（毛霉菌病）。本发明还提 供了由粘附于可W在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的存在引 起或与所述微生物的存在相关的任何病症、疾病或障碍的诊断方法。
[0107] 哺乳动物细胞
[010引本发明的任一方法也可用于检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的来自于哺乳 动物细胞的核酸，所述哺乳动物细胞例如人类细胞、犬类细胞、猫类细胞、鼠类细胞、大鼠细 胞、牛类细胞、马类细胞、绵羊细胞、山羊细胞、灵长类细胞、来自于水生哺乳动物例如嫁和 海豚的细胞W及来自于其他外来哺乳动物的细胞。可W检测的哺乳动物细胞包括上皮细 胞、鱗状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、成牙质细胞、成釉细胞、味蕾内的细胞例如感觉 细胞、支架（或支柱）细胞、干细胞、基底细胞、唾液腺内的细胞例如浆液细胞和粘液细胞。 [010引此外，所述细胞可W是癌细胞，其例如来自于在舌、口、唇、咽、扁桃体或牙銀上发 生的肿瘤例如口腔鱗状细胞癌、唾液腺腺癌、粘液表皮样癌、腺样囊性癌、肉瘤（从骨骼、软 骨、脂肪、纤维组织或肌肉产生的肿瘤）、淋己瘤或黑素瘤。所述细胞可W是来自于患有癌前 期病变例如粘膜白斑病或粘膜红斑病的对象的癌前细胞。
[0110] 试剂盒
[0111] 本发明还提供了执行本发明的方法的试剂盒。具体来说，本发明提供的试剂盒包 含按照本发明的任一方法对来自于粘附于聚合物或俘获在聚合物中的细胞或微生物的核 酸进行检测和/或定量的组分。所述试剂盒包含用于扩增目标微生物、哺乳动物细胞例如 人类细胞或癌细胞特异性的核酸片段的寡核巧酸引物。所述试剂盒还可W包含用于扩增核 酸的通用正向和/或反向引物。所述试剂盒还可W包含执行本发明的方法的说明书。
[0112] 本发明的试剂盒还可W包含执行PCR或其他扩增方法所必需的组分。例如，试剂 盒可W含有下列一种或多种物质：Taq聚合酶或另一种热稳定聚合酶，ATP，适量的各个四 种脱氧核糖核巧S憐酸（dNTP)，W及缓冲液、盐例如MgClz、防腐剂、还原剂或水。
[0113] 试剂盒还可W包含执行检测测定法所必需的任何组分例如有机溶剂和缓冲溶液， 如氯仿和/或Tris缓冲液。试剂盒可W包含缓冲液、载样染料、凝胶、分子量标志物、膜、滤 器、阻断缓冲液和用于Ncxrthern印迹分析、Southern印迹分析、条状印迹分析或原位杂交 分析W及本领域中常用的任何其他方法的检测试剂。
[0114] 在考虑了下面的说明性实施例后，本发明的其他方面和优点将被理解。
[0115] 实施例
[0116] 实施例1描述了粘附于手指揉磋的口香糖的细菌的定量，实施例2描述了在体内 粘附于口香糖的细菌的定量，实施例3描述了定量在体内粘附于口香糖的细菌的其他实 验。
[0117] 实施例1
[011引在体内粘附于口香糖或俘获在口香糖中的细菌的定量
[0119] 进行了进一步研究W证实口香糖可W从口腔除去细菌，并且可W提取细菌的核 酸。
[0120] 5位健康人类志愿者（1位男性，4位女性，年龄为27至56岁）给出了他们参加本 研究的书面知情同意书。本研究的包含判据是每位志愿者健康状况良好，并且他们的恒牙 具有至少16种天然元素。排除判据是在研究之前的一个月内使用抗生素或漱口液。此外， 志愿者在研究期间不使用抗生素、漱口液和其他口香糖类型。所述实验进行一式两份。
[0121] 接下来，要求志愿者将两种不同的口香糖类型巧嚼最多10分钟的不同量的时间， 并根据使用巧嚼过的口香糖片的超声处理获得的CFU，和根据使用从溶解在氯仿中的巧嚼 过的口香糖片分离的细菌DNA的qPCR获得的任意单位，来确定巧嚼过的口香糖中的细菌数 目。使用两种方法确定细菌数目，产生了在巧嚼后短时间内渗入的细菌量的初始峰。随着 巧嚼时间增加直至10分钟，细菌渗入量减少（图1)。
[0122] 在不同天，要求志愿者巧嚼1.5g每种类型的口香糖0.5、1、3、5或10分钟。巧嚼时 间被随机分派并且在一天中的相同时间点进行。在巧嚼后，将口香糖吐在含有10ml无菌水 的聚苯乙締杯中，然后将巧嚼过的口香糖置于特氣龙模具中，按照实施例1中对手指揉磋 的口香糖的描述进行超声处理。将得到的悬液铺于血琼脂板（2号血琼脂基料40g/l，氯高 铁血红素5mg/l，甲糞酿Img/l，绵羊血50ml/L)上，并在37°C和厌氧条件（5-10%肥，10% C02,80%N2)下溫育 7 天（Concept400 厌氧工作站，RuskinnTechnologyLtd.，Pencoed， UK)后，确定CFU的数量。
[0123] 在分开的实验运行中，5位健康志愿者（4位男性，1位女性）将1. 5g每种类型的口 香糖巧嚼0. 5、1、3、5或10分钟。同样地，将巧嚼过的口香糖吐在含有10ml无菌水的聚苯 乙締杯中，然后在无菌离屯、管中将它用5ml氯仿化7-66-3,FisherScientific,Waltham， USA)和 3mlTE缓冲液（AM9849,Ambk)n骇-LifeTechnologies?，Carlsbad,USA)溶解。 将管振摇至少30分钟W完全溶解口香糖。将得到的悬液离屯、10分钟W从水性顶层中除去 大的粒子和胶基。
[0124] 对于qPCR分析来说，使用由1000y1PCR-混合物（Sso化stTMEvaGreen成Supermix，Bio-rad，Her州les，USA)、500y1 无DNA的水（FisherScientific，Waltham， USA)和250y1引物混合物构成的主混合物。所述引物混合物是270yL无DM的水和15yL 的9种特定细菌菌种的验证过的正向和反向引物的溶液。引物的详细情况提供在下面的表 2中。
[01幼表2
[0126]
[0127]
[012引
[0129] 在 96 孔PCR板（MSP-9601，Bio-rad，Hercules,USA)中，将从水性溶液获取的 2. 5yL样品与17, 5yL主混合物混合。然后在热循环仪（CFX96,Bio-rad，Hercules,USA) 上，按照2步扩增巧5. 0°C10秒，55. 0°C30秒）进行qPCR，进行39个循环并制作烙解曲线 (65°C至95. (TC)。板包括取决于引物组的阳性对照和阴性对照：无DNA和无引物。结果表 示成倍数表述并在实验内进行比较，同时将细菌计数表示成任意单位（AU)。
[0130] 根据运些体内实验，取决于巧嚼时间，被捕获在口香糖中的细菌的量被估算为 lxl〇7。据估算，整个唾液带有1〇8-1〇9个微生物度u;rt等，JournaloftheAmericanDental Association127:190 - 196, 2006)，意味着1-10 %的唾液细菌可W被口香糖实际捕获并从 口腔移除。
[0131] 实施例2
[0132] 定量在体内粘附于口香糖或俘获在口香糖中的细菌的其他实验
[0133] 进行了进一步的实验W确定使口香糖被细菌饱和所必需的最少时间，并对粘附于 口香糖的细菌进行定量。方法总体来说如上面实施例1中所述来进行。
[0134] 要求5位对象在2周内巧嚼留兰香口香糖。只允许对象每天巧嚼一片口香糖。将 巧嚼过的口香糖嚼团储存在15血无菌化Icon管中，直至进行PCR分析。运些样品被描述 在下面的表3中。
[0135] 表3-巧嚼时间和嚼团重量
[0136]
[0137]
[0138] 对于分析来说，将冷冻的口香糖嚼团从冰箱取出并允许其升至室溫。向含有口香 糖嚼团的管加入TE缓冲液（3ml)和氯仿巧ml)。将样品混合30分钟，并且在口香糖嚼团完 全溶解后，将样品W4500巧m离屯、10分钟。随后，取出2ml水性顶层并通过PCR进行分析。
[0139] 使用Sso化st试剂盒，按照制造商的说明书，使用正向和反向通用引物进行PCR。 反应如下进行：95.0°C3分钟，95.0°C10秒，55.0°C30秒，随后将下列循环重复39次： 95. 0°C10秒，然后烙解曲线65. 0°C至95°C:增量为0. 5°C5秒。
[0140] 根据表3中的结果，在巧嚼1分钟后粘附于口香糖的细菌计数为约400。如图1中 所示，当巧嚼时间前进到巧嚼20分钟时，粘附于口香糖的细菌的量略微降低。
[0141] 本研究进一步证实，本发明的方法可W检测并定量粘附于口香糖的口腔细菌。
[0142] 对于本领域技术人员来说，在考虑了目前优选的实施方式后，预期可W在本发明 的实践中进行大量修改和改变。因此，对本发明的范围设置的唯一限制是在权利要求书中 出现的限制。
【主权项】
1. 一种从可以在活生物体内延展的聚合物提取核酸的方法，所述方法包括： a) 将所述聚合物与i)有机溶剂和ii)缓冲溶液相接触，以及 b) 分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述聚合物提取的核酸被包含在所述缓冲溶 液中。2. 权利要求1的方法，其还包括鉴定从所述聚合物提取的核酸的来源的步骤。3. 权利要求1或2的方法，其还包括对从所述聚合物提取的核酸进行定量的步骤。4. 权利要求2或3的方法，其中使用扩增方法来进行鉴定步骤或定量步骤。5. 权利要求4的方法，其中所述扩增方法是聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解 旋酶依赖性扩增、等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等温扩增或基 于序列的扩增。6. 权利要求2、4或5任一项的方法，其中使用聚合酶链反应来鉴定所述核酸的来源。7. 权利要求3-5任一项的方法，其中使用定量聚合酶链反应来定量所述核酸。8. 权利要求1-7任一项的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液、TBE或TAE。9. 权利要求1-8任一项的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液。10. 权利要求1-9任一项的方法，其中所述有机溶剂选自氯仿、二甲苯和甲苯。11. 权利要求1-10任一项的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。12. 权利要求1-11任一项的方法，其中所述聚合物被所述有机溶剂完全溶解。13. 权利要求1-11任一项的方法，其中所述聚合物被所述有机溶剂至少部分溶解。14. 权利要求1-13任一项的方法，其中从所述聚合物的内表面提取所述核酸。15. 权利要求1-14任一项的方法，其中至少90%的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚 合物内的核酸被提取。16. 权利要求1-15任一项的方法，其中所述核酸的来源是微生物。17. 权利要求16的方法，其中所述微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。18. 权利要求17的方法，其中所述细菌是变异链球菌（Streptococcusmutans)、口 腔链球菌（Streptococcusoralis)、内氏放线菌（Actinomycesnaeslundii)、血链球菌 (Streptococcussanguinis)、牙銀P卜啉单胞菌（Porphyromomasgingivalis)、中间P卜啉 单胞菌（Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌（Bacteroidesforsythus)、Tanneraella forsythia、直肠弯曲杆菌（Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌（Eubacteriumnodatum)、 微小消化链球菌（Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌（Streptococcus intermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺方定体(Treponema denticola)、乳芽胞杆菌属（Lactobacillus)、嗤蚀艾肯菌（Eikenell