HCl/pH 8,优选 40mM 的 Tris-HCl/pH. 8。
[0114] 溶解后，可进行稀释步骤，例如稀释度为5倍或4倍或3倍或优选2倍。用于稀释 的优选溶剂是低电导率的缓冲液或更优选就是水。低电导率是指至少低于2mS/cm的电导 率，更优选低于lmS/cm。一种合适的缓冲系统是例如10mM Tris或更低浓度且pH值大于7 的Tris/HCl。也可以使用其它具有相同低电导率和pH值的缓冲液。
[0115] 第一重新折叠步骤（氧化性重新折叠）
[0116] 还原性半胱氨酸的氧化和二硫键的形成对于G-CSF的正确折叠是必要的。经典的 方法是在一对氧化/还原剂的存在下进行氧化（Rudolph 1990, Rudolph 1996,参见背景技 术）。已出版了许多体外重新折叠技术。基于这些重新折叠方案，本发明人已经得出一些 一般原则，其对在包涵体中表达的含二硫键的蛋白质来说是普遍的。因为蛋白质是在还原 和未折叠的状态下，该重新折叠程序的机理主要是通过在成对半胱氨酸的巯基基团之间形 成天然二硫键而将多肽链氧化折叠成天然构象。在典型的重新折叠过程中，增溶剂（离液 剂或去污剂）的浓度起初降低到低于变性浓度，这通常是通过步进式稀释或透析或通过凝 胶色谱法，例如用葡聚糖凝胶G-25来实现。诸如CuS04等的氧化剂或诸如谷胱甘肽氧化还 原剂（GSH/GSSG)的氧化还原体系的存在促进重新折叠温育期间二硫键的形成。通常的温 育在室温下进行几个小时到几天。也描述了各种附加的添加剂，其可以任选地用于增加蛋 白的溶解性和/或防止聚集。聚集，特别是部分折叠中间体的聚集，是重新折叠过程中的主 要问题，最好通过低于临界蛋白浓度的稀释来阻止（Rudolph 1990, Rudolph 1996)。对于 G-CSF，现有技术还教导了通过CuS04与肌氨酰的组合进行氧化。重新折叠在氧化剂和增溶 剂的存在下进行（Zsebo 1986、W08701132、W08910932、Lu 1992、Heidari 2001)。
[0117] 本发明人发现，在增溶剂，如肌氨酰的存在下，G-CSF的折叠并不能完全达到。因 此这种氧化和折叠步骤仅产生部分重新折叠的G-CSF。本发明人发现，完全除去增溶剂，接 着在没有增溶剂的条件下进行第二重新折叠步骤能提高产量。本发明人还设计了用于除去 增溶剂的优化方法（见下文）。其它也可导致不完全折叠的污染物也被除去。
[0118] 任何合适的氧化剂都可以使用，如氧气或空气流（鼓泡）、GSSG (谷胱甘肽-0X)、金 属离子（Cu2+、Fe2+、Zn2+……）、过氧化氢（H20 2)。在优选的实施方案中，氧化剂是CuS04。除 CuS04外，其他的铜盐都可以使用（如CuCl 2)。
[0119] 以有效量使用增溶剂。本领域技术人员可以容易地确定和优化有效量，即实现有 效溶解G-CSF的量。测定溶解的G-CSF量的方法在下文进一步描述（例如，参见实施例 13. 3)〇
[0120] 在第一重新折叠步骤中增溶剂的优选浓度为0.2-2. 0 % (w/v)，更优选为 0. 2%-1% (w/v)，最优选是约0. 5% (w/v)或0. 5% (w/v)。在优选的实施方案中，如果使 用肌氨酰，肌氨酰的浓度低于1% (w/v)，优选0. 5% (w/v)。
[0121] 本发明人进一步观察到，长时间氧化可能导致RP-HPLC色谱图上出现2-3个额外 的峰。这些额外的峰可能是由于G-CSF的甲硫氨酸残基氧化。这种氧化形式是不需要的产 品相关物质，通过合适的色谱法去除他们是困难的。
[0122] 在一些实施方案中，氧化性重新折叠（即氧化和第一重新折叠步骤）进行1-30小 时，或2-25小时，或6-25小时，或10-25小时，或12-25小时，或14-25小时，或16-25小时， 或18-22小时，或19-21，或20-24小时。在一些实施方案中，G-CSF的氧化和部分重新折叠 进行2多于小时，优选地为多于12小时，优选为多于20小时，最优选20-24小时。
[0123] 在优选的实施方案中，氧化性重新折叠步骤（即氧化和第一重新折叠步骤）在碱 性pH进行，例如pH在7至10,或7至9,或7. 5到8. 5,或者7. 8到8. 2的范围内。在优选 的实施方案中，pH为约8或8。在一些实施方案中，第一重新折叠步骤的pH值大于7,优选 pH 8〇
[0124] 氧化性重新折叠步骤也可以用已经（部分）纯化的G-CSF进行。在一些实施方案 中，用于氧化性重新折叠的G-CSF的纯度大于50%，优选纯度为约60% -70%，甚至更高。
[0125] 氧化性重新折叠优选在不冷却的条件下进行，优选在室温下，优选在18-30°C，优 选在20-28 °C，优选在20-26 °C，优选在20-24 °C，优选在21-23 °C，最优选在约22 °C或22 °C 下进行。
[0126] 氧化性重新折叠可在持续的气流下进行。
[0127] 基于各种优化实验，用于氧化性重新折叠（氧化和第一重新折叠步骤）的最优选 条件显示于表1的"第一重新折叠"栏下。
[0128] 氧化性重新折叠步骤可以通过加入终止剂，例如EDTA来停止。在一些实施方案 中，氧化反应是通过加入EDTA终止，优选最终浓度为约1禮，但也可使用其他浓度。EDTA去 除Cu2+(假定CuS04用作氧化剂），从而停止氧化。除EDTA外其它Cu 2+络合剂和/或其他 浓度都可以使用。依据氧化剂，可使用其它螯合剂，例如terdentat-配体，例如N-甲基吡 啶（picolinoyl)-乙二胺，甘氨酸-2-比啶基甲基胺，N°-(2-卩比啶基甲基）-甘氨酰胺和 N°-(2-吡啶基甲基）-甘氨酸-乙基胺。
[0129] 如上文所讨论，本发明的发明人已经发现肌氨酰的存在阻止绝大部分G-CSF变为 完全重新折叠。本发明人认为，这可能部分是由于在增溶剂的存在下重新折叠更慢。然而， 如上文所讨论，温育时间不能随意的延长，因为更长的温育时间可使得产品质量达到不可 接受的水平。
[0130] 本发明人惊奇地发现，重新折叠可以通过完全去除增溶剂和氧化剂后的第二次温 育而优化和完成，出人意料地导致可溶的、纯的、具有生物学活性的G-CSF的产量提高。
[0131] 除去增溶剂和氧化剂并去除其它污染物。
[0132] 在一个中间纯化步骤中，氧化和部分重新折叠的G-CSF进行了进一步纯化。重要 的是，在执行第二重新折叠步骤之前，增溶剂必须被完全除去。氧化剂和污染物/杂质也进 一步被部分除去。
[0133] 现有技术中描述了几个通过透析/超滤或色谱方法去除增溶剂和氧化剂的程序。 然而，发明人已经发现，通过单批次吸附步骤，不能实现完全去除如肌氨酰的增溶剂。在由 本发明人进行的实验中，肌氨酰的浓度在该步骤后保持在〇. 01-0. 〇4mg/ml (表III)，发现 这对正确折叠的G-CSF的产量有负面影响。
[0134] 为提高可溶性活性G-CSF的产量，必须完全去除增溶剂，即低于本文所描述的检 测方法的可检测水平。例如，残余增溶剂的浓度可通过HPLC测量并通过UV检测。本发明 人进行的试验中的检测极限为〇. 〇lmg/ml。Burgess，R. R. 1996中更详细地描述了该方法 (Purification of over produced E.coli RNA polymerase 〇 factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sarkosyl. Methods Enzymol. 273 :145-149)〇
[0135] 可以使用任何适当的去除方法。例如，可以通过离子交换树脂吸附，和/或酸沉 淀，和/或离子交换色谱法来实现充分的去除。应用任何一种根据本发明的技术或这些技 术的组合，导致增溶剂，如肌氨酰的浓度不会干扰或抑制第二重新折叠步骤中的重新折叠， 优选的浓度低于0. 〇lmg/ml，优选低于检测极限。这些纯化步骤可以以任何顺序和/或以 任何组合的方式应用，只要其使得增溶剂的完全去除。也可使用其他合适的纯化方法。本 发明描述的方法因此包括完全除去增溶剂的步骤，即增溶剂的去除程度足以使得任何残余 量不会干扰或抑制第二重新折叠步骤。因此第二重新折叠步骤在不存在增溶剂的条件下进 行，即增溶剂存在的量不足以干扰第二重新折叠步骤，即增溶剂低于检测极限。
[0136] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种方法，其中增溶剂由下列一个或多个步 骤除去：
[0137] i)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而结合阴离子交换树脂材料，并通过过滤 除去树脂材料，和/或
[0138] ii)在增溶剂结合到树脂上而G-CSF保留在流过物中，或者相反，G-CSF结合到树 脂而增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
[0139] 在在本发明的一个实施方案中，提供了一种方法，其中所述增溶剂（和其他杂质） 通过下列一个或多个步骤所去除：
[0140] i)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而结合到阴离子交换树脂材料，并通过过 滤除去树脂材料，和/或
[0141] ii)酸沉淀。
[0142] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种方法，其中所述增溶剂（和其他杂质）通 过下列一个或多个步骤所去除：
[0143] i)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而结合到阴离子交换树脂材料，并过滤除 去树脂材料，和/或
[0144] ii)酸沉淀，和/或
[0145] iii)在增溶剂结合到树脂上而G-CSF保留在流过物中，或者相反，G-CSF结合到树 脂而增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
[0146] 在一个优选的实施方案中，增溶剂（和其他杂质）通过顺序应用下列步骤而除 去：
[0147] a)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而使增溶剂结合到阴离子交换树脂材料， 并通过过滤除去树脂材料，
[0148] b)通过降低pH值到低于pH 5而将杂质沉淀，并过滤除去沉淀物，
[0149] c)在残余增溶剂结合到树脂中而G-CSF保留在流过物中的条件下进行阴离子交 换层析，
[0150] d)在G-CSF结合到树脂中而残余增溶剂保留在流过物中的条件下进行阳离子交 换层析，
[0151] e)通过使用pH或盐浓度增加的洗脱缓冲液进行逐步或梯度洗脱而从阳离子交换 树脂上洗脱结合的G-CSF。
[0152] 离子交换树脂吸附
[0153] 离子交换树脂的吸附可用于除去增溶剂。
[0154] 作为除去增溶剂第一步骤，可进行离子交换树脂吸附。适当的方法是本领域所熟 知的。如上所述，对于去除增溶剂，如肌氨酰，一种方法是分批吸附到DOWEX阴离子交换树 脂（Dow Chemicals，美国），优选用 Dowex lX4(TO8910932、Lu 1992、Heidari 2001)。捕捉 了结合的表面活性剂的树脂通过过滤除去。与Dowex树脂非常类似的产品是BioRad公司 的AG树脂（如AG-1X8)，其可以以相同的方式使用。
[0155] 上述方法适用于所有在溶液中带电的增溶剂。许多表面活性剂是两亲性的，其它 的是阴离子或阳离子性的。根据增溶剂的种类和溶液pH值，所述电荷可以是正的或负的。 AEX材料如Dowex或AG-1的选择取决于带负电荷的增溶剂，例如肌氨酰或SDS。与此相反， 根据树脂种类选择的离子交换色谱法，可对带负电或正电的增溶剂均可结合。带负电的增 溶剂将结合AEX树脂而不结合CEX树脂。带正电的试剂则与之相反。例如药剂，如阳离子 脂质体，十六烷基三甲基铵，或精氨酸可以通过阳离子交换层析除去。除了增溶剂外，通过 该方法也将至少部分去除其他污染物。这些其它污染物/杂质可包括过程相关杂质，例如 宿主细胞蛋白（HCP)、DNA/RNA、内毒素（例如LPS)、氧化剂（例如Cu2+)、过程相关的化学物 质（例如EDTA)，以及与产品相关的杂质，例如聚集体。
[0156] 在一些实施方案中，增溶剂是一种在分批模式下吸附到AEX树脂上的阴离子去污 剂或表面活性剂。优选的去污剂或表面活性剂是肌氨酰。在一些实施方案中，肌氨酰吸附 于分析纯（AG)AEX树脂（BioRad公司，美国）中，优选AG 1-X系列的树脂，最优选的树脂是 AG 1-X8。在一些实施方案中，树脂作为一次性的材料使用。
[0157] 在优选的实施方案中，用AG 1-X树脂对增溶剂的批次吸附在碱性pH值的缓冲液 中进行，优选约pH 8。合适的缓冲系统可基于磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、Tris、HEPES、MOPS、 HEPPS、EPFS、CAPS CAPSO、CHES、TES、BES、TAPS、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、甲基甘氨酸、 二羟乙基甘氨酸、乙酰氨基甘氨酸、甘氨酰胺或其它pKa值高于7的生物相容性缓冲物质。 优选的吸附缓冲液是Tris-HCl/pH8,优选20mM的Tris-HCl/pH 8。最优选的为Tris-HCl/ pH 8+lmM EDTA。
[0158] AG 1-X8的优选量为每克肌氨酰10_60g干树脂，最好为20g/g肌氨酰。在一些实 施方案中，初始肌氨酰浓度为〇. 5 %。
[0159] 在优选的实施方案中，离子交换树脂吸附步骤除去了大于90 %，大于95 %，更优 选大于96 %，更优选大于97 %，更优选大于98 %，更优选大于99 %，更优选大于99. 2 %，更 优选大于99. 3%，更优选大于99. 4%，更优选大于99. 5%，更优选大于99. 6%，更优选大于 99. 7 %，更优选大于99. 8 %，更优选大于99. 9 %的增溶剂。在优选的实施方案中，增溶剂是 肌氨酰。在一些实施方案中，该离子交换树脂吸附步骤通过AG1-X8批次吸附除去大于95% 的肌氨酰，更优选至少99%肌氨酰。在一些实施方案中，带有捕获的肌氨酰的AG 1-X8树脂 从溶液中过滤分离。优选的过滤步骤是利用l〇〇pm不锈钢网眼。更优选地，过滤步骤利用 100um的尼龙袋过滤网格。
[0160] 如果离子交换树脂吸附步骤不能使增溶剂充分完全的除去，可以进行进一步的纯 化步骤，例如酸沉淀和/或离子交换层析。
[0161] 酸沉淀
[0162] 任选地，可以进行酸沉淀步骤来去除其他潜在的污染物。令人惊奇的是，本发明人 发现，通过简单的酸沉淀，绝大部分的污染物都可以轻易地除去。已知G-CSF，尤其非格司 亭，在酸性pH下具有最佳溶解性和稳定性，甚至将pH值降低到低于等电点（非格司亭的PI =5. 65)仍保持可溶。污染物的酸沉淀可通过将pH值降低到6. 5至6. 0之间，6. 0和5. 5 之间，5. 5和5. 0之间，5. 0和4. 5之间，在4. 5和4. 0之间，4. 4和3. 5之间，3. 5和3. 0之 间等而进行。
[0163] 尽管存在残留的增溶剂，本发明人发现，加入的尿素可对沉淀过程产生额外的有 益效果。通过降低pH值，有时会发生G-CSF非特异性且不期望的共沉淀，从而导致最终产 量不期望的损失。本发明人已经发现，这一缺点可以通过将亚变性浓度的尿素在pH调节前 加入到溶液中而克服。尿素可有效防止G-CSF的共沉淀。通过用醋酸或醋酸钠缓慢平稳的 降低pH值而优化这一步骤可显示出最好的结果。pH值低于5.0就已经产生效果。相当低 的尿素浓度，即约1M就已足够。
[0164] 在一些实施方案中，酸沉淀前残留肌氨酰的浓度是0. 01到0. 04mg/ml之间。
[0165] 在一些实施方案中，pH值通过加入浓缩的醋酸钠或醋酸而降低。在一些实施方案 中，pH值降低到低于pH 5.0,优选低于4. 8,最优选至pH4. 3-4. 5。在一些实施方案中，在尿 素的存在下进行酸化，优选尿素浓度低于3M，最优选为1M尿素。在一些实施方案中，通过深 层过滤（depth filtration)除去沉淀物。
[0166] 离子交换色谱法
[0167] 离子交换也可用于去除增溶剂。除去增溶剂的步骤可包括一个或多个离子交换步 骤。
[0168] 如果使用离子交换树脂吸附（使用或不使用酸沉淀）没有完全除去增溶剂，可以 使用一个或多个离子交换色谱步骤以完全除去增溶剂。离子交换步骤可包括AEX和/或 CEX，以任意顺序。也可使用任何其他合适的离子交换技术。
[0169] 现有技术中描述了用离子交换色谱法纯化G-CSF。许多工艺都利用AEX和CEX，或 以任意顺序应用两种方法，或一种IEX步骤与其他色谱方法，如HIC，XMAC，SEC或RP-HPLC 相结合（见【背景技术】）。
[0170] 对于肌氨酰，发明人发现，如果AEX批次吸附和酸沉淀后仍然有低浓度的肌氨酰 残留，就可以通过随后的离子交换步骤完全除去。
[0171] 本发明人发现，酸沉淀步骤之后，G-CSF保留在上清液中，pH值低于其PI。在这些 pH值条件下的G-CSF是阳离子性的，其将结合到CEX上而不结合到AEX树脂上。这已由实 验证实。
[0172] 在一些实施方案中，所述离子交换步骤包括AEX而后是CEX。发现AEX可以在非结 合模式（G-CSF在流过物中）中使用，而杂质如残余的增溶剂或DNA结合到树脂上，其促使 发明人开发了两个柱子以AEX、CEX的先后顺序串联连接的串联步骤作为本发明的一个实 施方案。AEX树脂的主要作用是结合残余的肌氨酰，而CEX树脂的主要功能仅仅是缓冲液交 换（为第二次重新折叠做准备）。通过第一个柱的G-CSF随后结合于第二树脂，而蛋白质可