带有DARPin的双特异性嵌合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及双特异性嵌合蛋白，其包括经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，以及与所述DARPin相连的IgG抗体，scFv-Fc抗体片段，或其组合；用其治疗或预防癌症的方法，以及相关的方法和组合物。KCLRF-BP-002202009.10.06
【专利说明】带有DARPin的双特异性嵌合蛋白
[0001] 发明背景
[0002] 1.发明领域
[0003] 本文涉及含有经设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin)的双特异性嵌合蛋白，以及相 关的方法和组合物。
[0004] 2.相关技术的描述
[0005] 在活细胞中，各种蛋白彼此相互作用，参与各种致病机制。如果有至少两种这样的 致病蛋白被同时抑制，相比于仅有单一蛋白被抑制的情况而言，就有更大的可能性来治疗 和预防疾病。为此，研发了多种能抑制至少两种蛋白的抗体。
[0006] 尽管研发出数种双特异性抗体，其中大多数不能在商业上用作抗体药物，因为它 们的疗效未经临床验证或者观察到了多种副作用。此外，所研发的双特异性抗体在稳定性 和产量方面有不足，这对于商业应用而言也是障碍。早期研发的具有IgG形式的双特异性 抗体难以分离和纯化，因为在生产过程中轻链和重链随机组合，导致大规模生产中的诸多 问题。而且，在非IgG的双特异性抗体的情形中，与蛋白折叠、药效学等无关的作为药物的 稳定性也没有得到验证。
[0007] 因此，需要研发在活体内稳定性增强、且作为药物有改进特性的双特异性抗体。
【发明内容】
[0008] 本申请提供了双特异性嵌合蛋白（双特异性抗体偶联物），其包括抗体（例如IgG 抗体）和/或抗体片段（例如ScFv-Fc抗体片段）、以及与其相连的经设计的锚蛋白重复蛋 白（DARPin)，本发明还提供了包含所述抗体和可药用载体的药物组合物。所述的双特异性 嵌合蛋白或双特异性抗体偶联物可以用作双特异性抗体。
[0009] 本申请还提供了制备所述双特异性嵌合蛋白的方法，其通过将DARPin与抗体（例 如IgG抗体）和/或抗体片段（例如ScFv-Fc抗体片段）相连来实现，或通过在细胞中表 达编码所述双特异性嵌合蛋白的核酸来实现。
[0010] 本申请还提供了用于治疗或预防癌症的所述双特异性嵌合蛋白，或者所述双特异 性嵌合蛋白在治疗或预防癌症方面的用途。
[0011] 此外，本申请还提供了用于增强双特异性嵌合蛋白的抗癌效力的DARPin，或者 DARPin用于增强双特异性嵌合蛋白的抗癌效力的用途，是与未连接DARPin的抗体或抗体 片段相比。
[0012] 本申请还提供了相关的组合物和方法，可以从下文的详述中更清楚地了解。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1图示了根据一个实施方案用抗EGFRDARPin制备多种双特异性抗体偶联物的 过程。
[0014] 图2图示了根据一个实施方案用抗EGFRDARPin制备多种双特异性抗体偶联物的 过程。
[0015] 图3图示了根据一个实施方案制备抗c-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白的过程。
[0016] 图4图示了根据一个实施方案的抗C-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白在溶液中展 示的稳定性特性。
[0017] 图5图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白与EGF在 竞争性ELISA试验中的竞争。
[0018] 图6图示了根据一个实施方案的抗-C-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白在A431 细胞中抑制EGFR磷酸化的程度。
[0019] 图7图示了根据一个实施方案的抗-C-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对SNU5 细胞增殖的抑制程度。
[0020] 图8图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对MKN45 细胞增殖的抑制程度。
[0021] 图9图示了根据一个实施方案的抗-C-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对H1993 细胞增殖的抑制程度。
[0022] 图10图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对A431 细胞增殖的抑制程度。
[0023] 图11的荧光图像显示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合 蛋白对c-Met和EGFR的内在化。
[0024] 图12图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白的 c-Met(上图）和EGFR(下图）表达量。
[0025] 图13图示了根据一个实施方案制备抗HER2/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白的过程。
[0026] 图14图示了根据一个实施方案的抗HER2/抗EGFR双特异性嵌合蛋白展示的稳定 性特性。
[0027] 图15图示了根据一个实施方案的抗HER2/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对MKN45 细胞增殖的抑制程度。
[0028] 图16的荧光图像显示了根据一个实施方案的抗HER2/抗-EGFR双特异性嵌合蛋 白对HER2和EGFR的内在化。
[0029] 图17图示了根据一个实施方案制备抗HER3/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白的过程。
[0030] 图18图示了根据一个实施方案的抗HER3/抗EGFR双特异性嵌合蛋白展示的稳定 性特性
[0031] 图19图示了根据一个实施方案制备抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin双特异 性嵌合蛋白的过程。
[0032] 图20图示了根据一个实施方案的抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin双特异性 嵌合蛋白展示的稳定性特性。
[0033] 图2IA至2IG展示了各种DARPin的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0034] 已研发出多种类型和形式的双特异性抗体，且由于这些抗体结合至少两种抗原的 能力，可预期其与早已存在的单克隆抗体相比具有出色的治疗效果。本文通过将DARPin与 IgG抗体或其片段结合提供了双特异性嵌合蛋白。
[0035] DARPin(经设计的锚蛋白重复蛋白；见第5章"DesignedAnkyrinRepeat Proteins(DARPins):FromResearchtoTherapy",MethodsinEnzymology,vol503:101~ 134(2012)^"EfficientSelectionofDARPinswithSub-nanomolarAffinitiesusing SRPPhageDisplay"，J.Mol.Biol. (2008) 382, 1211-1227,其全部公开内容引入本文作为 参考）是指具有对靶蛋白的高特异性和高结合亲和力的抗体模拟蛋白，其通过基因工程制 备。DARPin起源于天然的锚蛋白，且具有包含至少2个锚蛋白重复基元（例如，包含至少 3、4或5个锚蛋白重复基元）的结构。根据重复基元的数量，DARPin可具有任何适宜的分 子量。例如，包含3、4、或5个锚蛋白重复基元的DARPin可分别具有约10kDa、约14kDa、或 约18kDa的分子量。
[0036] DARPin包括提供结构的核心部分和位于该核心外且结合靶标的靶结合部分。该结 构性核心包括保守的氨基酸序列而该靶结合部分包括根据靶标而相区别的氨基酸序列。
[0037] 下表中总结了DARPin的实例且图21A-21G图释了其核苷酸序列：
[0038]
【权利要求】
1. 一种双特异性嵌合蛋白，包含： 设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin)，和 与DARPin连接的IgG抗体、scFv-Fc抗体片段、或其组合。
2. 依照权利要求1的双特异性嵌合蛋白，其中所述DARPin是抗EGFR DARPin。
3. 依照权利要求1的双特异性嵌合蛋白，包含： 抗 EGFR DARPin，和 与所述DARPin连接的抗c-Met IgG抗体、抗c-Met scFv-Fc抗体片段、或其组合。
4. 依照权利要求2或3的双特异性嵌合蛋白，其中所述抗EGFR DARPin包含SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、或 SEQ ID NO: 112 的一种或多种，任选地，其中任 一种重复2至10次。
5. 依照权利要求3或4的特异性嵌合蛋白，其中所述抗c-Met抗体或抗体片段包含： 选自下组的至少一种重链互补决定区（⑶R):(a)⑶R-H1，其包含SEQ ID N0:4的氨基 酸序列；(b)CDR_H2,其包含，SEQ ID NO:5的氨基酸序列，SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或具 有SEQ ID N0:2的8-19个连续氨基酸且包含SEQ ID N0:2第3位到第10位氨基酸残基的 氨基酸序列；和（c)CDR_H3,其包含，SEQ ID N0:6的氨基酸序列，SEQ ID N0:85的氨基酸序 列，或具有SEQ ID NO: 85的6-13个连续氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸残基的氨基酸序列； 选自下组的至少一种轻链互补决定区：（a)⑶R-L1，包含SEQ ID N0:7的氨基酸序列， 〇3)0?-12，包含5￡〇10勵:8的氨基酸序列，和（(3)0)1?-13，其包含，5￡〇10勵:9的氨基酸 序列，SEQ ID NO: 86的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 89的9-17个连续氨基酸且包含SEQ ID N0:89第1位到第9位氨基酸残基的氨基酸序列；或者所述至少一种重链互补决定区和 所述至少一种轻链互补决定区的组合。
6. 依照权利要求5的双特异性嵌合蛋白，其中 所述〇?-111包含5￡0 10勵：1、5￡0 10勵：22、5￡0 10勵：23、或5￡0 10勵：24的氨 基酸序列， 所述〇?-112包含5￡0 10勵:2、5￡0 10勵:25、或5￡0 10勵:26的氨基酸序列， 所述〇?-113包含5￡0 10勵：3、5￡0 10勵：27、5￡0 10勵：28、或5￡0 10勵:85的氨 基酸序列；和 所述 CDR-L1 包含 SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、或 SEQ ID NO:106 的氨基酸序列， 所述〇?-12包含5￡0 10勵：11、5￡0 10勵：34、5￡0 10勵：35、或5￡0 10勵：36的氨 基酸序列，和 所述 CDR-L3 包含 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:86、或 SEQ ID NO:89 的氨基酸序列。
7. 依照权利要求5的双特异性嵌合蛋白，其中所述抗c-Met抗体或抗体片段包含： 重链，包含以下：SEQ ID N0:62的氨基酸序列，从SEQ ID N0:62的第18位至第462位 的氨基酸序列，SEQ ID N0:64的氨基酸序列，从SEQ ID N0:64的第18位至第461位的氨 基酸序列，SEQ ID N0:66的氨基酸序列，或从SEQ ID N0:66的第18位至第460位的氨基 酸序列；和 轻链，包含以下：SEQ ID N0:68的氨基酸序列，从SEQ ID N0:68的第21位至第240位 的氨基酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列，从SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨 基酸序列，或SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。
8. -种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求2至7中任一项的双特异 性嵌合蛋白。
9. 一种制备双特异性嵌合蛋白的方法，包括： 将i)DARPin和ii) IgG抗体、scFv-Fc抗体片段或其组合连接；或 在细胞中表达编码所述双特异性嵌合蛋白的核酸。 10?权利要求 9 的方法，其中所述 DARPin 包含 SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:110、SEQ ID NO: 111、或SEQ ID NO: 112的一种或多种，任选地，其中任一种重复2至10次。
11. 权利要求9或10的方法，其中所述抗体或抗体片段是抗c-Met抗体或其抗体片段。
12. 权利要求11的方法，其中所述抗c-Met抗体或抗体片段包含： 选自下组的至少一种重链互补决定区（⑶R):(a)⑶R-H1，包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列；(b)CDR-H2,其包含，SEQ ID N0:5的氨基酸序列，SEQ ID N0:2的氨基酸序列，或具有 SEQ ID NO: 2的8-19个连续氨基酸且包含SEQ ID NO: 2第3位到第10位氨基酸残基的氨 基酸序列；和（c)⑶R-H3,其包含，SEQ ID NO:6的氨基酸序列，SEQ ID NO:85的氨基酸序 列，或具有SEQ ID NO: 85的6-13个连续氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸残基的氨基酸序列； 选自下组的至少一种轻链互补决定区：(a)⑶R-L1，包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列， 〇3)0?-12，包含5￡〇10勵:8的氨基酸序列，和（(3)0)1?-13，其包含，5￡〇10勵:9的氨基酸 序列，SEQ ID NO: 86的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 89的9-17个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:89第1位到第9位氨基酸残基的氨基酸序列；或 所述至少一种重链互补决定区和所述至少一种轻链互补决定区的组合。
13. 权利要求11或12的方法，其中所述双特异性嵌合蛋白的抗癌功效相比于没有所述 DARPin与其连接的所述抗c-Met抗体或抗体片段增强。
14. 编码权利要求1至7中任一项的双特异性嵌合蛋白的核酸，任选地在载体中。
15. 包含权利要求14的核酸的细胞。
【文档编号】C07K19/00GK104341529SQ201410363385
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2013年7月26日
【发明者】郑光镐, 李承炫, 高荣晙, 金罠京, 黄载雄, 赵美英, 李政昱, 林柏玮 申请人:三星电子株式会社