具有改变的生长特性的植物及其生产方法

专利名称：具有改变的生长特性的植物及其生产方法
具有改变的生长特性的植物及其生产方法本申请是申请日为2003年12月24日、中请号为200380107555. 6、发明名称为“具 有改变的生长特性的植物及其生产方法”的发明专利申请的分案申请。本申请涉及一种改变植物的生长特性的方法。更为具体地说，本发明涉及通过改 变编码锌指蛋白的核酸的表达和/或通过改变植物中锌指蛋白的水平和/活性，来改变植 物的生长特性的方法，该锌指蛋白具有两个C2H2型的锌指结构域(2xC2H2)。本发明还涉及 具有编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达改变和/或2xC2H2锌指蛋白水平和/或活性改变 的植物，该植物具有相对于相应的野生型植物发生改变的生长特性。基于不断增长的世界人口，提高农业效率仍然是农业研究的一个主要目标。种植 和园艺提高的传统方式采用选择育种技术来识别具有令人满意的特性的植物。然而，这种 选择育种技术具有几个缺点，即，这些技术通常是劳动密集型的，因此导致经常含有异源性 遗传组分的植物，可能不总是具有从亲本植物传承的令人满意的性质。分子生物学的进步 已经允许人类以特定和可控制的途径来改变动物和植物的胚质。植物的遗传工程学使分离 和操纵遗传材料(通常以DNA或RNA的形式)以及随后将遗传材料导入植物成为可能。这 种技术已经导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺学性质的植物的产生。一种具有特 殊经济利益的特性或生长性质为较高的产量。产量通常被定义为来自农作物的具有经济价 值的可测量的产品。这可以用数量或质量的术语来定义。其它重要的生长特性除了别的以 外，包括改良的作物结构、改良的生长率等等。影响一个或更多的上述生长特性的能力将在多个领域具有许多应用，例如产量提 高、作物育种、生产观赏植物、树木的培植、园艺、林学、生产藻类或作物(例如用作生物反 应器、生产例如医药品、抗体或疫苗等产品、或有机废料的生物转化、或在高产藻类或植物 的情形下用作燃料)等领域。术语“锌指蛋白”形容一种蛋白质中的核酸结合结构域，围绕四面体结构协调的锌 原子折叠(Miller等1985. EMB0，4，1609-1614)。与锌原子相协调的氨基酸为半胱氨酸或组 氨酸残基，然而锌指结构域的序列和长度存在多样性。锌指蛋白可以含有几个同样或不同 类型的锌指结构域。通过锌指结构域与其它结构域的结合，自然界中可以遇见更多的多样 性。例如，发现一些锌指蛋白与环指结构或卷曲螺旋结构域结合，从而形成所谓的三重结构 域。有数种类型的锌指类型，例如C2H2，C2HC，C2C2。已知C2H2为经典的锌指结构域。通 常有两个用来区分锌指蛋白的标准，首先为锌指的类型，其次为蛋白质中锌指的数目。已 经描述了具有一个单独C2H2结构域锌指蛋白的特征，例如来自鼠耳芥属(Arabidopsis) Superman和来自玉米的Ramosa I。一种被充分表征的具有3个C2H2结构域的锌指蛋白为 玉米的Indeterminate蛋白1。尽管对该基因的首次报道(Colasanti等人，Cell. 1998May 15 ；93 (4) 593-603)仅仅提及两种锌指结构域的存在，一个采用pFAM结构域研究的更为精 密的分析，揭示了 3个C2H2锌指结构域的存在。另外已知只有2个C2H2结构域的锌指蛋 白，例如ZATlO (STZ)和SC0F-1。这一具有2个C2H2结构域的植物锌指蛋白的亚群已经与 植物多种应激反应相联系(Sakamoto 等，Gene 248(1-2)23-32(2000))。STZ 和 SCOF-1 都 已经被用于提高对非生物刺激耐受能力。已经报道当STZ过表达提高了酵母的耐盐能力
5(Lippuner 等，J Biol Chem. 271 (22) 12859-12866 (1996))，已经报道在 CaMV 35 S 启动子 控制下的SCOF-I基因的过表达提高了鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的耐寒能力(Kim 等，Plant J. 25(3)247-259(2001))。对锌指蛋白编码基因表达改变(无论锌指基因表达突 变、过表达或其它情形)的植物的报道描述了有异常生长特性的植物，其中没有(除了表达 SC0F-1的转基因植物的耐受寒冷刺激的能力)农作物所需要的，或描述了只有特定刺激条 件下才能测量的效应。现在已经发现改变植物中2xC2H2锌指基因的表达和/或改变植物中2xC2H2锌指 蛋白的水平和/或活性使植物具有改良的生长特性。特别是已经发现在植物中引入2xC2H2 锌指核酸赋予植物改良的生长特性，例如与野生型植物相比，提高产量、改良叶子结构、改 变周期时间。因此，根据本发明的一个实施方案，提供了改良植物的生长特性方法，包括改变植 物中编码2xC2H2锌指蛋白核酸的表达和/或改变植物中2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活 性。这里所用的术语“改变”用来指位置和/或时间的提高、减少和/或改变。改变编 码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达或改变2xC2H2锌指蛋白本身的水平和/或活性，包括在 特定的细胞或组织中，与相应的野生型植物中2xC2H2锌指蛋白基因或蛋白的表达、水平和 /或活性相比较时，改变基因的表达和/或基因产物，即多肽的水平和/或活性。改变的基 因表达可以由改变内源性2xC2H2锌指基因的表达产生和/或可以由改变预先引入植物的 2xC2H2锌指基因的表达而产生。类似地，改变2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性可以由于 改变内源性2xC2H2锌指核酸/基因的表达和/或可以由于改变预先引入植物的2xC2H2锌 指核酸/基因的表达。可以通过例如化学方法和/或重组方法来达到改变基因/核酸的表 达和/或改变基因产物/蛋白的水平和/或活性的效果。因此本发明提供了改良植物生长特性的方法，包括通过重组方法和/或化学方法 来改变2xC2H2锌指蛋白基因或蛋白的表达、水平和/或活性。可以方便地通过化学方法达到改变编码2xC2H2锌指蛋白核酸的表达和/或改 变2xC2H2锌指蛋白本身的水平和/或活性的效果，即通过外源性应用一种或多种能改变 2xC2H2锌指蛋白活性和/或能够改变2xC2H2锌指基因(该基因可以是一种导入植物的内 源性基因或转基因)的表达的化合物或成分。这里定义的术语“外源性应用”一词用来表 示将合适的化合物或成分与植物接触或给予植物。该化合物或成分可以以适合植物摄入的 方式外源性地应用于植物(例如通过施用到土壤中通过根来吸收，或在一些植物中直接施 用于叶子，如通过喷雾)。外源性应用可能在野生型植物或预先用2xC2H2锌指核酸/基因 或其它转基因转化的转基因植物中进行。适合外源性应用的化合物或成分包括2xC2H2锌指蛋白或2xC2H2锌指核酸。可选 地，能够改变直接或间接活化或灭活2xC2H2锌指蛋白的因子的水平的化合物或成分的外 源性应用也将适合于本发明的实施。另外还包括能够识别或模拟2xC2H2锌指蛋白功能的 抗体。这些抗体可以包括“植物抗体”、单链抗体、IgG抗体和重链camel抗体，以及它们的 片段。另外或作为选择，取得的效果也可以通过外源性应用2xC2H2锌指基因/基因产物 的相互作用蛋白或活化剂或抑制剂而达到。另外或作为选择，该化合物或成分可以是诱导
6突变的物质，例如选自N-亚硝基-N-乙脲(N-nitroso-N-ethylurea)、吖丙啶、甲磺酸乙酯 (ethyl methanesulphonate)和硫酸二乙酯中的一种或多种化学物质。突变形成也可以通 过暴露于离子放射，例如X线或Y线或紫外光来实现。引入突变和检测突变效果的方法 (例如通过监测基因表达和/或蛋白活性)是现有技术中熟知的。另外或作为选择，根据本发明的一个优选实施方案，改变编码2xC2H2锌指蛋白核 酸的表达和/或改变2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性可以通过重组方法实现。这种重 组方法可以包括直接或间接途径来改变核酸的表达和/或蛋白的水平和/或活性。例如，一种间接途径可以包括向植物中引入能够改变目的基因(编码2xC2H2锌指 蛋白的基因)表达的核酸和/或能够改变目的蛋白(2xC2H2锌指蛋白)水平和/或活性的 的核酸。这些能被引入植物中的核酸的例子包括编码与2XC2H2锌指基因启动子结合或与 2XC2H2锌指蛋白相互作用的转录因子或活化剂或抑制剂的核酸。检测这些类型的相互作用 的方法和分离编码这种相互作用者的核酸的方法包括酵母单杂交或酵母双杂交筛查，其中 2xC2H2锌指基因/蛋白用作诱饵。这种转录调节因子的一个例子是L0S2，被描述为STZ基 因的转录调节子。因此，本发明的方法也可以用L0S2操作，其中2xC2H2锌指基因的表达可 以被升高或通过降低植物中L0S2的表达而进一步增高。还包括一种改变2xC2H2锌指基因的表达和/或改变2xC2H2锌指蛋白的水平和/ 或活性的间接途径，即提供抑制或刺激驱动天然2xC2H2锌指基因或转基因表达的调控序 列。这种调控序列可以被引入植物，例如，被引入植物的调控序列可以是能够驱动内源性 2xC2H2锌指基因表达的启动子。一个进一步的改变植物中2xC2H2锌指基因的表达和/或改变2xC2H2锌指蛋白的 水平和/或活性的间接途径包括改变植物中能够与锌指蛋白相互作用的因子的水平。这种 因子可以包括2xC2H2锌指蛋白的配体。因此，本发明也提供改变植物生长特性的方法，包 括改变编码2xC2H2锌指蛋白的天然配体的蛋白的基因的表达。进一步的，本发明也提供改 变植物生长特性的方法，包括改变编码2xC2H2锌指蛋白的天然靶标/底物的蛋白的基因的 表达。这种靶标/底物的例子包括被锌指结构域结合的DNA序列(stretches)。另一方面，一个直接和优选的途径包括向植物中引入编码2xC2H2锌指蛋白的核 酸或其片段，或能够与之杂交的序列，该核酸优选编码2xC2H2锌指蛋白或同源物、衍生物 或其活性片段。该核酸可以被引入植物，例如通过转化。因此，提供了一种改变植物生长特性的方法，包括向植物中引入2xC2H2锌指核酸 或其片段。2xC2H2锌指核酸可以从任何来源获得(直接或间接(如果随后进行修正))，只要 该序列在植物中表达时，导致2xC2H2锌指蛋白编码核酸/基因表达的改变和/或2xC2H2 锌指蛋白水平和/或活性的改变。2xC2H2锌指基因或蛋白可以是野生型，即，本身或内源性 核酸或多肽。可选地，它可以是一种来自同种或异种物种的蛋白或核酸。那么该核酸/基 因可以被作为转基因引入植物，例如通过转化。该核酸可以从细菌、酵母或真菌中分离，或来源于植物、藻类、昆虫或动物(包括 人类)。与其天然的形式相比，通过精密的人工操作，该核酸的组成和/或基因组环境可以 随后被充分地改变。该核酸优选来自植物，无论来自与其导入的植物相同的品种，或来自不 同的植物品种。进一步优选的，该核酸来自双子叶植物，优选来十字花科(Brassicaceae)，进一步优选来自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。更加优选该核酸与SEQ ID NOl所代表 的核酸或SEQ ID NO 1的一部分基本类似，或能够与其杂交的核酸，或编码与SEQ ID NO 2 所代表的氨基酸序列基本类似的氨基酸序列的核酸序列，或其同源物、衍生物或活性片段。有利地，根据本发明的方法也可以用变体2xC2H2锌指核酸或变体2xC2H2锌指氨 基酸来实行，其中优选的变异体核酸为SEQ ID NO 1的变体，其中变体氨基酸为SEQ ID NO 2的变体。适合本发明操作的变体序列的例子包括(i) 2xC2H2锌指核酸/基因的功能片段；(ii)能够与2xC2H2锌指核酸/基因杂交的序列；(iii)2xC2H2锌指核酸/基因的可变剪接变体；(iv) 2xC2H2锌指核酸/基因的等位基因变体；(v)2xC2H2锌指蛋白的同源物、衍生物和活性片段。上述提到的变体也可以表述为与2xC2H2锌指核酸/基因，特别是与编码2xC2H2 锌指的SED ID NO 1的核酸“基本类似”，或与2xC2H2氨基酸/蛋白，特别是SED ID NO 2 基本类似。术语“基本类似”也包括以互补物、DNA、RNA、cDNA或基因组DNA形式的SEQ ID NO 1的变体。编码2xC2H2锌指蛋白或2xC2H2锌指蛋白变体的变体核酸可以被全部或部分 合成，可以为双链核酸或单链核酸。该术语也包括由于遗传密码的简并性的变体；基因或蛋 白的家族成员；以及被一个或多个插入序列中断的变体。一个变体2xC2H2锌指核酸的例子为2xC2H2锌指基因的功能片段。简便地，根据 本发明的方法也可以用编码2xC2H2锌指蛋白的DNA或核酸来进行操作。功能片段指来源 于或制备于原始(较大)的DNA分子的DNA片段，该DNA片段在植物中表达时，赋予植物改 良的生长特性。该片段可以包括许多基因，含有或没有附加的调控元件或可以包括间隔序 列。该片段可以通过在核酸中生成一个或多个缺失和/或截短而形成。现有技术中熟知向 核酸引入截短和缺失的技术。通过用要测验功能的部分简单地替代实际实施例所采用的序 列，可以按照实施例部分的描述的方法容易地确定适合本发明的方法的片段。另一个2xC2H2锌指核酸变体的例子为能够与2xC2H2锌指核酸杂交的序列，例如， 与 SEQ ID NO 1，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，41，43，45，47或49 的任意一个杂交。本发明的方法也可以方便地采用这些变体施行。通过例如用杂交序列简 单地替代实际实施例所采用的序列，可以按照实施例部分描述的方法容易地确定适合用于 本发明方法的杂交序列。这里定义的术语“杂交”是基本同源性互补核苷酸序列相互退火的过程。杂交过 程可以完全在溶液中进行，即，互补核酸都在溶液中。依赖于这一过程的分子生物学工具包 括聚合酶链反应(PCR ；以及所有以此为基础的方法)、差减杂交、随机引物延伸、核酸酶Sl 作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNAs差异显示、以及DNA序列确定。杂交过程的发生也 可以其中一个互补核酸固定于基质，例如磁珠、琼脂糖珠子或其它树脂。依赖于这一过程的 分子生物学工具包括分离聚腺苷酸(A+)mRNA。此外，杂交过程的发生可以其中一个互补核 酸固定于固体支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜，或者用如照相平版的方式固定，例如硅玻 璃支持物(后者已知为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)。依赖于这一过程的分子生物学工 具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、克隆杂交、斑点杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了允许 杂交的发生，核酸分子通常被加热或用化学方法变性从而由双链熔解为两条单链和/或从
8单链核酸中去除发卡结构或其它的二级结构。例如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成的条件 影响着杂交的严格性。杂交的高度严格性条件包括较高的温度和/或低盐浓度(包括NaCl 和柠檬酸Na(Na3-Citrate)的盐)和/或杂交缓冲液中甲酰胺的存在和/或降低杂交缓冲 液中例如SDS(去垢剂)的化合物的浓度和/或从杂交缓冲液中排除葡聚糖硫酸酯或聚乙 二醇(提高分子拥挤度)等化合物。常规的杂交条件参见，例如Sambrook(2001)分子克 隆实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约，但熟练技术人员将认识到根据核 酸序列的已知或期望的同源性和/或长度可以设计许多不同的杂交条件。特别优选足够低 的杂交严格度条件(至少在第一种情形)来分离与本发明先前定义的核酸异源的核酸。低 严格度条件的例子为4-6xSSC/0. 1-0. 5% w/v SDS, 37-45°C, 2-3小时。根据杂交中涉及核 酸的来源和浓度，可以采用可选的严格度条件，例如中等严格度条件。中等严格度条件的例 子包括l-4x SSC/0. 25% w/v SDS,彡45°C，2_3小时。高严格度条件的例子包括0. 1到2x SSC/0. l%w/v SDS，60°C，1_3小时。熟练技术人员将知道杂交及冲洗期间可以改变的多种 参数，以维持或改变严格度条件。起始严格度条件可以较低，并逐渐增高，直到提供杂交的 核酸，如上文所定义的。导致异质性的因素包括等位性、遗传密码简并和优选密码子应用的 不同等。另一个在本发明的方法的实践中可应用的2xC2H2锌指核酸变体为一种编码 2xC2H2锌指蛋白的核酸序列的可变剪接变体。这里应用的术语“可变剪接变体”包括核酸 序列的变体，其中选择的内含子和/或外显子已经被切除、替代或加入。这种剪接变体可以 在自然界中发现或人工制造。现有技术中熟知制造该剪接变体的方法。通过用剪接变体简 单地替代实际实施例所采用的序列，可以按照实施例部分描述的方法容易地确定适合用于 本发明方法的剪接变体。另一个在本发明方法的实践中可应用的2xC2H2锌指核酸变体为一种编码2xC2H2 锌指蛋白的核酸的等位基因变体。自然界中存在等位基因变体，本发明的方法所包含的等 位基因变体为这些天然等位基因的应用。等位基因变体也包括单核苷酸多态性(SNPs)，以 及小插入/缺失多态性(INDELs)。INDELs的大小通常小于lOObp。在多数有机体的自然发 生的多态系中，SNPs和INDELs组成了最大一组的序列变体。适合用于本发明方法的等位 基因变体可以容易地被确定，例如按照实施例部分描述的方法，通过用等位基因变体简单 地替代实际实施例所采用的序列。本发明提供了改良植物生长特性的方法，包括改变植物中的可变剪接变体的表达 或植物中编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的等位基因变体的表达和/或通过改变植物中可变 剪接变体或等位基因变体编码的2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性。本发明的方法的实践中可采用的变体2xC2H2锌指蛋白的例子为2xC2H2锌指蛋白 的同源物、衍生物或其功能片段。2xC2H2锌指蛋白的“同源物”包括相对于未改变的目的蛋白具有氨基酸替换、缺 失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，且具有与它们衍生自的未改变蛋白类似的生 物学和功能活性。为生产这种同源物，蛋白质的氨基酸可以被其他具有类似性质(例如类 似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α-螺旋结构或β-片层结构的倾向性)的氨基 酸替代。现有技术中熟知保守的替代目录(参见如Creighton(1984)蛋白质，W. H. Freeman and Company)。本发明的方法中应用的同源物具有以渐增的顺序的优选的至少30%，31%，32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 % , 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 52 %, 54 %, 56 %, 58 %, 60 %, 62 %, 64 %, 66 %, 68 %, 70 %, 72 %, 74 %, 76 %, 78 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % 的与未改变蛋 白质的序列一致性或相似性。一致性的比例可以通过用现有技术中已知的序列对比程序计算。例如，一致 性的比例可以用GAP程序，或needle (EMBOSS软件包)或stretcher (EMBOSS软件包) 或align X程序计算，作为载体NTI系列5. 5软件包的模块，采用标准参数(例如缺口 罚分 5(GAP penalty 5)，缺口开放罚分 15 (GAP opening penalty 15)，缺口延伸罚分 6. 6 (GAPextension penalty 6.6))。根据本发明的另一个具体实施例，用于本发明方法的核酸序列为编码SEQ ID NO 2的蛋白的同源物的核酸。搜索和识别2xC2H2锌指蛋白同源物的方法，例如STZ锌指同源物，完全在本领域 熟练技术人员所掌握的技术范围内。这种方法，包括用本发明提供的序列，例如SEQ ID NO 2(或SEQ ID NO 1)，优选用计算机可读形式，筛查序列数据库。该序列信息可以在公共数据 库中得至IJ，包括但并不限于 Genbank(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/web/Genbank)，欧洲 分子生物学实验室核酸数据库(EMBL) (http:/w. ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或 其版本或MIPS数据库(http://mips. gsf. de/)。现有技术中已知不同检索算法和序列排列 和对比的软件。这种方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP采用Needleman 和Wunsch(J. Mol. Biol. 48 =443-453,1970)的算法来发现将匹配数目最大化和缺口最小化 的两个完整序列的比对。BLAST算法计算序列一致性的比例并对两个序列间的相似性进行 统计分析。涉及BLAST的一套程序具有5个不同的执行工具3个为核苷酸序列查询设计 (BLASTN、BLASTX、和 TBLASTX)，两个为蛋白质序列查询设计(BLASTP 和 TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology :76_80,1994 ；Birren 等，GenomeAnalysis, 1 :543,1997)。公众 可以通过美国国立生物技术信息中心获得进行BLAST分析的软件。当对比核酸序列时，寻找有用的SEQ ID NO USEQ ID NO 2或SEQID NO 10到SEQ ID NO 50的任意之一的同源物的默认的blast参数为，G(Cost to open a gap) 5,E (Cost to extend a gap default) 2、q (不匹配罚分)_3、r (一次匹配的奖分)l、e (期望值(E)) 10. 0, W(字段大小)11、V(单线描述的数值)100和B(待显示的比对数)100。当对比蛋白质序列 时，默认的参数优选为G 11、E 1、6值10.0、1 3、V 100和B 100。上述为了计算序列一致性和搜索同源物的对比序列的分析，优选用全长序列或在 序列的保守区域内。因此这些分析可以基于一定区域的基础上，例如保守结构域、基序或
品.ο 对这种结构域或基序(例如SEQ ID NO 5，6，7，8和9所代表的基序和盒)的识别， 也在本领域熟练技术人员的技术领域内，并涉及例如计算机可读形式的本发明的蛋白质、 对比软件程序的应用和蛋白质结构域、保守基序和盒的公开信息的应用。蛋白质结构域信 息在 PR0D0M(http//www. biochem. ucl. ac. uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html)、 PIR(http: //pir. georgetown. edu/)或 pFAM(http: //pfam. wustl. edu/)数据库中可以获 得。为了识别锌指结构域，例如2xC2H2锌指结构域，优选pFAM。为搜索基序而设计的序列 分析程序可以用于识别上述的片段、区域和保守结构域。优选的计算机程序包括但并不限
10于MEME、SIGNALSCAN、和GENESCAN。MEME算法(版本3. 0)可以在GCG软件包中找到；或在 因特网址http://www. sdsc. edu/MEME/meme中。SIGNALSCAN版本4. 0的信息可以在因特网 址http://biosci. cbs. umn. edu/software/sigscan. html 获得。GENESCAN可以在因特网址 http://gnomic. Stanford. edu/GENESCANW. html 找到。目前，锌指基序被细分为40多个不同种类，可以在Sanger学院的蛋白质家族Pfam 数据库中找至丨J (http://www. Sanger, ac. uk/Software/Pfam/browse/Z. shtml)。C2H2锌指(Zf_C2H2)基序为典型的锌指蛋白结构域。它首先在Xenopus转录因子 11IA (TFIIIA)中被识别(Miller等1985)。该结构域的长度通常为25到30个氨基酸残基。 下列模式描述了锌指蛋白I-C-X(1-5)-C-X3-15-12-H-X(3-6)-[H/C]，其中X可以为任意 氨基酸，括号内的数字表示残基的数目。标注了 *的位置为那些对锌指稳定折叠很重要的 位点。最终的位置可以是组氨酸或半胱氨酸，仍然为C2H2锌指结构域。按照最近发表的锌 指结构域设计的观点，把一个或多个半胱氨酸或组氨酸替换掉也变得可行，而仍然保留了 C2H2结构域的原始功能。分隔第二个Cys和第一个His的残基主要为极性和碱性的。典型 的C2H2锌指由两个短β链、其后为α螺旋组成。锌指基序的DNA结合由α螺旋的氨基末 端部分介导，该螺旋结合DNA结合锌指的大沟。已经表明C2H2结构域与RNA、DNA和蛋白质 相互作用。保守半胱氨酸和组氨酸残基构成的锌离子的四面体调和(tetracoordination) 确定了基序的保守三级结构。通常发现保守疏水性残基位于_2和4的位置的氨基酸，在第 二个半胱氨酸后(参与锌结合)，并在第一个组氨酸前的位置3上(参与锌结合)。在植物 多锌指蛋白中，C2H2结构域的间距通常为大约15到大约65个氨基酸。因此，植物锌指蛋白以通过邻近锌指间的不同长度的长间隔为特征。而且，它们以 位于每个锌指的推定为DNA接触表面内的高度保守的6个氨基酸的序列为特征。这种保守 序列的2种形式最常在植物C2H2锌指中发现，QALGGH(SEQ ID NO 5)和NNM/WQMH(SEQ ID NO 6)。尽管QALGGH序列高度保守，一些变体或所谓的“改变型”自然发生，其中一个或两 个氨基酸可以具有不同的形式，最典型地+1 “Q”可以为“G”、“K”或“R”(这些氨基酸共有 同样的折叠样特性)，+2 “A”可以为“S”(两者共有为小氨基酸的特性)或+3 “L”可以为 “F”(这两种氨基酸都为疏水性)。这里采用的QALGGH基序包括所有这些变体。在NNM/ WQMH基序的位置3多为“M”或“W”。因此，本发明提供了上述的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白包含QALGGH基序， 另外，本发明提供了上述的，所谓的2xC2H2锌指蛋白含有NNM/WQMH基序。根据本发明的一个实施方案，2个C2H2结构域为同一类型。更为优选地，2个C2H2 锌指结构域都有同样的保守GALGGH或NNM/WQMH基序。根据另一个实施方案，每个C2H2锌 指结构域有一个不同的保守基序。根据一个实施方案，本发明的方法中应用的2xC2H2蛋白以EAR基序为特征，是 ERF-相关的两性分子抑制基序。该基序已经在两个无关类型的转录因子中被识别，即AP2 型的ERF转录因子和锌指转录因子。在后一类型中，EAR基序通常位于蛋白质的C-末端。 EAR基序的模式具有保守序列hDLNh (X) P (SEQ ID NO 7)，其中“h”为疏水性残基(A，C，F， G，H，I，K，L，M，R，T，V，W, Y中的任一个)，最通常为L/F/I，“X”的位置可以为一个(任意 氨基酸)或没有氨基酸。EAR基序的特有的性质为亲水性和疏水性残基的交替，天门冬氨 酸(D)残基为两性残基。Ohta等(The plant cell, 2001,13, pl959_1968)，该文献作为参考文献在此引用，先前描述了存在于2xC2H2锌指蛋白的EAR基序。因此，本发明提供了上述的方法，其中2xC2H2锌指蛋白含有EAR基序。根据一个 实施方案，EAR基序位于蛋白质的C末端，优选位于第二锌指结构域和C末端之间。根据另一实施方案，本发明的方法所采用的锌指蛋白具有两个锌指结构域和 一个核定位信号(B盒)。一个类似B盒(Basic盒)的碱性氨基酸簇由Chua等描述 (ΕΜΒ0 1992-11,241-9)，被假定为蛋白的核定位信号。这些已经在2xC2H2蛋白中被识别 (Sakamoto等，Gene 248(2000)23-32)。该簇富含赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基。定义最常 见的2xC2H2基因中的B盒的形式的共有序列为KR(S)KRXR(SEQ ID NO 8)，其中位于第3个 位置的“S”可缺失或存在。然而其他的变体可能自然发生，仍然保留富含碱性氨基酸的带 电荷区域的特性。碱性盒的位置最常位于蛋白质的N末端，但也可以发生在其它部位。由 于B盒的碱性性质，已经预测它也能够参与DNA结合。相应地，本发明提供了上述的方法，其中2xC2H2锌指蛋白进一步包括B-盒。根据 一个实施方式，B-盒子位于锌指蛋白的N端区域。用于本发明的方法的蛋白优选具有位于 N末端和第一个锌指结构域之间的B盒。根据另外一个实施方式，用于本发明的方法的锌指蛋白具有两个C2H2锌指结构 域和一个L盒。称为L-盒子的保守基序，功能仍然未知，已经在2xC2H2蛋白中识别出来， 且先前被Sakamoto等人描述(Gene248 (2000) 23-32)。L-盒通常位于N末端，在B-盒和第 一 C2H2锌指之间。L-盒以序列EXEXXAXCLXXL(SEQ ID NO 9)为代表，该区域可能涉及蛋 白-蛋白的相互作用。缺少L盒的锌指蛋白可能在类似位置具有富含丝氨酸的区域，该区 域推测为蛋白_蛋白相互作用的位点。因此，本发明提供了上述的方法，其中2xC2H2蛋白含有L-盒。可用于本发明的方法的特定的锌指同源物具有一个或多个保守基序，如SEQ ID NO 5，6，7，8和9所描述的，或与这些基序具有80%—致性的基序或具有氨基酸保守替代的 基序。如SEQ ID NO 2所列举的2xC2H2蛋白含有SEQ ID NO 5，7，8和9中所列举的所有 盒子。所有其平行进化同源物(paralogues)和直向同源物(orthologues)也含有所有这 些盒子。SEQ ID NO 2中所列的和从鼠耳芥中分离的可用于本发明的方法中的构建体和方 法的2xC2H2蛋白同源物，也在其它的植物物种被识别出来。两种特殊类型的同源物，直向同源物(orthologues)和平行进化同源物 (paralogues)是用来描述基因的遗传关系的进化概念。术语“平行进化同源物”涉及在物 种的基因组内导致平行进化同源基因的基因副本。术语种直向同源物(orthologues)涉及 在不同的有机体中根据遗传关系确定的同源性基因。这里采用的术语“同源物”也包括了 对本发明的方法有用的蛋白的平行进化同源物和直向同源物。其它植物物种的直向同源物(orthologues)可以通过进行一个所谓的相互blast 搜索而容易地找到。直向同源基因可以采用诸如BLAST的程序，通过用目的基因或蛋白质 (SEQ ID NO 1或2)查询一个或多个基因数据库而被识别。从搜索中得到的最高级别的目 标基因接着再进行BLAST分析，只有那些与查询序列(SEQ ID NO 1或2)再次匹配的目标基 因被保留为真正的直向同源基因。例如，为了找到水稻的鼠耳芥基因的直向同源物，可以对 水稻数据库进行BLASTN或TBLASTX分析，例如(但并不限于)在NCBI网站(http://www.
12ncbi. nlm. nih. gov)可获得的稻(Oryza Sativa) Nipponbare数据库，或水稻的基因组序列 (变种indica或japonica)。下一步，得到的水稻序列被用来用鼠耳芥属数据库进行反向 BLAST分析。当得到的序列用ClustalW分析并在邻近关系树状图中显示时，结果可以被进 一步精确。该方法可以被用来识别来自其它许多不同物种的直向同源物。其它物种中最接近的同源物(蛋白SEQ ID NO 2的直向同源物)，包括那些来自 多种双子叶和单子叶植物的，例如来自Datiscaglomerata(AFl 19050_1，AAD26942, SEQ ID NO 10 和 11)，来自大豆(T09602，SC0F-1，SEQ ID NO 12 和 13)，紫苜蓿(Medicago sativa) (CAB77055. 1，SEQ ID NO 14 和 15)，来自烟草(T01985，SEQ ID NO 16 和 17)，来自稻 (AF332876_1, AAKO1713. 1，SEQ ID NO 18 禾Π 19)，来自矮牵牛花(ΒΑΑ05079. 1，SEQ ID NO 20 禾口 21)，来自小麦(S39045 和 BAA03901，WZF1，SEQ ID NO 22 和 23)，来自辣椒(Capsicum annum) (SEQ ID NO 24 和 25)，来自 turnip (T14408，T14409)和来自甘蔗(CA279020)。同一物种的近同源物(来自鼠耳芥的SEQ ID NO 2的蛋白的平行进化同源物)在 下面描述。MIPS数据库包含鼠耳芥基因组序列，同时具有编码蛋白质的预测和功能注释。用 SEQ ID NO 1的STZ基因(MI PS登录号Atlg27730)，搜索该数据库，表明在鼠耳芥属基因 组中有2个编码SEQ ID NO 2的非常接近的同源物的基因，At5g43170(NM_123683，SEQ ID NO 32和33)和At5g04340(NM_120516SEQ ID NO 28和29)，和3个其它高度相似的基因 At3gl9580(NM_l12848, SEQ ID NO 26 和 27)，At5g67450(NM_126145，SEQ ID NO 34 和 35) 和At3g49930(NM_114853，SEQ ID NO 30-31)。这些基因散布在3条染色体1、3和5中。类 似的，矮牵牛花中的许多直向同源物的平方进化同源物已经被分离并测序。来自同一物种 的平行进化同源物可以方便地应用于本发明的方法。而且，一些SEQ ID NO 2的STZ蛋白的家族成员已经在鼠耳芥属中发现。SEQ ID NO 1和2的STZ基因和蛋白先前已经被公开在数据库中，MIPS登录号为Atlg27730或Genbank 的登录号为NP_174094. 1，X95573或CAA64820。另外，从鼠耳芥属其它组织或不同的发育阶 段分离出的一些其它cDNA，s已经被公开，编码与SEQ ID NO 2同样的蛋白。这些序列以登 录号 AY 034998，NM_102538, AC12375, X95573, AY063006, X98671, X98670，或 AF250336 保 存在Genbank中。这些分离物阐明了 STZ基因在不同植物组织中的不同发育阶段的差异性 表达。尽管编码的蛋白质保持一致，这些不同cDNA’ s的不同调控反应在它们的5’ UTR和 3，UTR区域的差异上。来自SEQ ID NO 1的同一基因家族的成员或SEQ ID NO 1的任何直 向同源物的同一家族的成员可以方便地应用于本发明的方法。其它可用于本发明的方法的接近的同源物为保存在公共数据库中的序列，登录号 如下，这些序列作为参考在此引用，从矮牵牛花中分离的同源物BAA21923. 1，BAA21922. 1， BAA21926. 1,BAA21925. 1,BAA19110. 1,BAA19926. 1,BAA21924. 1，BAA19111. 1,BAA21921. 1， BAA19114. 1,BAA05076. 1,BAA05079. 1，CAA43111. 1,BAA21920. 1,BAA21919. 1,BAA05077. 1， BAA05078. 1，BAA20137. 1 ；从鼠耳芥属中分离的同源物CAA67229. 1，BAC43454. 1， NP_196054.1，AAM67193. 1，ΝΡ_199131·1，ΝΡ_188592. 1，ΝΡ_201546·1，ΝΡ_190562.1， ΝΡ_182037.1， BAC43008.1， Q8VWG3, CAC86393.1， CAC86168.1， CAC86167.1， CAC86166.1， CAB67667. LCACO1747. 1,CAB90936. 1,CAB90935. 1, CAB80245. 1,CAB41188. LCAA18741. 1， CAA67234. LCAA67236. LCAA67231. LCAA67230. LCAA67228. LCAA67235. LCAA67233. 1，
13CAA67232. 1,CAA67229. 1,CAA64820. 1 以及从稻中分离的同源物BAB16855. 1,AA006972. 1， CAC09475. 1，BAB63718. 1，P0683F02.21，BAB67885. 1，P0031D11. 19，BAB64114. 1， AAKO1713. 1，AF332876_1, AAL76091. 1，BAB67879. 1，P0031D11.12 和 BAC15513. 1。可以用上述定义的所有同源物、平行进化同源物，和直向同源物构建种系发生 树。可以用VNTi (版本5.0)程序的clustal W进行多重序列对比，例如，用缺口开放罚 分10和缺口延伸罚分5。为构津种系发牛树，可以采用在httD://evolution. genetics. Washington, edu/phylip. html 可获得的 Phylic 软件包。SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO 2 附 近的序列簇，识别适合于本发明的方法应用的基因和蛋白。当用参数缺口罚分 5(Gap penalty 5)和缺口延伸罚分 6 (Gap extension penalty 6)，采用程序Needle时，SEQ ID NO 2的序列和它的稻直向同源物AF332876 (SEQ ID NO 19) 具有36%的序列一致性，因此，对本发明的方法特别有用的同源物为与SEQ ID NO 2所列的 2xC2H2锌指蛋白具有36%或更高的序列一致性的同源物，或者与其它物种的SEQ ID NO 2 的最接近种直向同源物具有36%或更高的序列一致性。可用于本发明的方法实践的优选的同源物为植物同源物，S卩，从植物核酸中得到 的蛋白质。该核酸更加优选来自双子叶植物，更加优选来自十字花科(Brassicaceae)家 族，更加优选来自鼠耳芥。可用于本发明的方法的2xC2H2锌指蛋白属于与鼠耳芥耐盐锌指蛋白(STZ)同样 的基因家族。或是其同源物。名称ZATlO也可用于识别鼠耳芥的STZ锌指蛋白。另一个对本发明的方法有用的锌指蛋白的变体为替换变体。术语蛋白质的“替换 变体”指那些氨基酸序列中至少一个残基被去除且一个不同的残基插入该位置的变体。氨 基酸的替换通常为单个残基，但可以根据位于多肽的功能限制而分簇；插入将通常以大约 1-10个氨基残基的顺序，缺失在1-20个残基的范围内。氨基酸替换优选包括保守氨基酸的 替换。C2H2锌指蛋白的特定的替换变体为一个或多个保守半胱氨酸和/或组氨酸残基被替 代的替换变体，而仍然保留同样的锌指功能。为保留同样的功能，保守组氨酸残基或半胱氨 酸残基附近的残基也可以被替换。蛋白质的“插入变体”为那些所述蛋白质的预先确定的位置插入了一个或多个氨 基酸残基的蛋白质。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合以及序列内单个或多个氨基 酸的插入。通常在氨基酸序列内的插入将比氨基或羧基端的融合小，以1到10个残基的顺 序。氨基端或羧基端融合蛋白或肽的例子包括在酵母双杂交系统采用的转录活化子的结合 结构域或活性结构域、噬菌体包膜蛋白，(组氨酸)6-标签，谷胱甘肽S转移酶标签，蛋白A， 麦芽糖结合蛋白，双氢叶酸还原酶，标签· 100抗原表位，c-myc表位，FLAG "表位，IacZ, CMP(钙调蛋白(calmodulin)结合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。蛋白的“缺失变体”以从蛋白中去除一个或多个氨基酸为特征。蛋白的氨基酸变体 可以容易地用现有技术中已知的肽合成技术制成，例如固相肽合成以及类似的技术，或通 过重组DNA操作。现有技术中熟知操作DNA序列来产生蛋白的替换、插入或缺失变体的方 法。例如，在DNA中预先确定的位点产生突变的技术为本领域技术人员熟知，包括M13诱变， T7-Gen 体夕卜诱变(USB, Cleveland, OH)，QuickChange 定点诱变(Stratagene, San Diego, CA)，PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。术语“衍生物”指肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，与2xC2H2蛋白天然形式的氨基酸序列，例如SEQ ID NO 2所列的锌指蛋白相比，可以含有天然或非天然发生氨基酸残基的替 换、缺失或添加。2xC2H2锌指蛋白的“衍生物”包含肽、寡肽，多肽，蛋白和酶，其中可以含有 天然产生的改变，糖基化，酰基化或与多肽的天然形式的氨基酸序列相比非天然发生的氨 基酸残基。与其来源的氨基酸序列相比，衍生物也可以包括一个或多个非氨基酸的取代，例 如，报告分子或其它配体，与氨基酸序列共价或非共价结合，例如，结合报告分子促进其缺 失，以及相对于天然发生蛋白的氨基酸序列非天然发生的氨基酸残基。另一个可用于本发明的方法的2xC2H2锌指蛋白的变体为锌指蛋白的活性片段。 2xC2H2锌指蛋白的活性片段包括蛋白质的至少5个连续的氨基酸残基，该残基保留了与天 然发生的蛋白质类似的生物学和/或功能活性。例如，包括2xC2H2锌指蛋白的至少10个 连续氨基酸残基的有用的片段，其它优选片段为起始自第2或第3或更远的内部的蛋氨酸 残基的2xC2H2锌指蛋白的片段。这些片段源于蛋白质翻译，自内部的ATG密码子开始。用 于实践本发明的方法的2xC2H2锌指蛋白的功能片段可以具有一个、两个或没有C2H2结构 域，而不影响它在本发明的方法中的功能。根据本发明的优选的性质，涉及编码2xC2H2锌指蛋白的核酸表达的提高或增加。 达到提高或增加基因表达或基因产物的方法现有技术中已经有许多文件记载，包括例如通 过强启动子驱动的过表达，运用转录增强子或翻译增强子。这里采用的术语“过表达”一词 表示原始野生型表达水平增加的任意形式的表达。考虑到它所可操作地连接的启动子，优 选将核酸引入植物和/或在植物中过表达的核酸为有义方向。SED ID NO 1所示的核酸序 列优选在植物中过表达，然而，必须清楚本发明的应用并非局限于SEQ ID NO 1所示的核酸 的应用，也不局限于编码SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸序列，而其它编码SED IDNO 1 或SED ID NO 2的同源物、衍生物或活性片段的核酸序列均可应用于本发明的方法中。核 酸或蛋白的例子在SEQ ID NO 10到SEQ ID N050中提供。可选地或另外，植物细胞中增加的2xC2H2编码基因的表达或提高的2xC2H2蛋白 的水平和/或活性可通过诱变而达到。例如这些突变可能是造成2xC2H2基因的调控改变 的原因，导致基因相对于野生型基因更多地表达。突变也可以导致蛋白构象的改变，导致 2xC2H2蛋白更多的活性和/或更高的水平。改变基因的表达(通过直接或间接方法)包括改变基因的转录水平。改变转录水 平可能足够诱发一定的表型效应，例如通过共抑制机理。这里引入转基因的总体效应是，细 胞中的与引入的转基因有同源性的天然基因编码的蛋白质具有较小的活性，因此根据本发 明的另一个实施方式，提供了改变植物生长特性的方法，包括降低编码2xC2H2锌指蛋白的 基因的表达或降低2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性。降低细胞中蛋白的表达、水平和/ 或活性的例子在现有技术中已经有许多文件说明，包括，例如通过反义技术，RNAi技术，小 干扰RNAs (siRNAs)和微RNA(miRNA)下调表达。另一个下调基因表达或基因沉默的方法包括采用核酶，如Atkins等人1994(W0 94/00012)，Lenee 等人 1995 (W0 95/03404)，Lutziger 等人 2000 (W0 00/00619), Prinsen 等人 1997 (W0 97/3865)以及 Scott 等人 1997 (W0 97/38116)所描述的。基因沉默也可以通过插入突变而达到(例如，T-DNA插入或转座子插入)，或通过 Angell 和 Baulcombe 1998 (W0 98/36083)，Lowe 等人 1989 (W0 98/53083)，Lederer 等人 1999 (W0 99/15682)或Wang等人1999 (W0 99/53050)所描述的基因沉默策略.
内源性基因的表达也可以下调，如果它含有突变。为了得到具有改良的生长特性 的植物，这样的突变或突变基因可以被分离并引入同样或不同的植物物种。这种突变体的 例子为2xC2H2锌指基因显性失活突变体。以基因表达沉默为目的的遗传构建体可以包括2xC2H2锌指核酸，例如相对于启 动子序列的有义和/或反义方向的SEQ ID NO 1所示的核酸序列(或其中一个或多个部分 或能够与其杂交的序列)。正向或反向重复形式的内源基因的至少一部分有义或反义拷贝 也可以在本发明的方法中利用。植物的生长特性也可以通过向植物中引入SEQ ID NO 1所 示的核酸序列的反义形式的至少一部分而改变。根据本发明的另一实施方式，提供了用来促进用于本发明的方法的2xC2H2锌指 核酸序列的导入和/或促进其表达的遗传构建体和载体。因此根据本发明，提供了一种构 建体，包含(i)能够改变编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达和/或改变2xC2H2锌指蛋白的 水平和/或活性的核酸；(ii)能够驱动(i)所述核酸序列的一个或多个控制序列；以及可选地(iii)转录终止序列。用于本发明的方法的构建体可以用本领域技术人员熟知的重组DNA技术建立。该 基因构建体可以插入载体，载体可以购买得到，适合于转化入植物并适合目的基因在转化 细胞的表达。遗传构建体优选为植物表达载体。根据(i)的核酸可以为这里前文描述的任意核酸。优选的核酸为SEQ ID NO 1所 示的核酸或其前文定义的变体，或者编码SEQ ID NO 2所示的序列的核酸序列或其前文定 义的变体。例如，这种变体编码 SEQID NO 11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37， 39，42，44，46，48和50所示的任一蛋白质。术语“调控序列”和“控制序列”这里可互换使用和在广泛的情形下使用，指能够 使它们所操作性连接的序列有效表达的调节核酸。被前述术语包括的术语为启动子，“启 动子”包括来源于经典的真核基因组基因的转录调节序列(包括精确的转录起始所必需的 TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及附加的调控元件(即，上游活化序列，增强子，沉 默子)，该序列根据发育和/或外部刺激而改变基因的表达，或以组织特异性的方式表达。 在该术语范围内也包含经典的原核基因的转录调控序列，在该情形下，它可以包括一个-35 盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调控元件”也包含赋予、活化或增强细胞、组织 或器官中核酸分子表达的合成融合分子或衍生物，这里采用的术语“操作性连接”指在启动 子序列和目的基因之间的功能性连接，从而使启动子序列能够起始目的基因的转录。目的 基因优选以有义方向与启动子连接。根据预期的结果，任意类型的启动子可以方便地用来驱动核酸序列的表达。EP03075331. 3中描述了可用于本发明的启动子，其启动子和序列在这里作为参考 文献引入。优选启动子的其它例子列于表I (a)到(C)，其启动子或衍生物可用于本发明的方 法和/或制造构建体。相应地，本发明也提供了基因构建体，含有⑴的核酸，例如，2xC2H2 核酸，和表I (a)到(c)或来自EP 03075331. 3的启动子的至少一部分，优选地，其中所述部 分为操作性连接。
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根据另一实施方式，(i)的核酸与一个组成性启动子可操作性地连接。这里定义 的术语“组成性”指持续地充分表达的启动子。而且，组成性启动子优选普遍存在的启动 子，在多于一个，优选在植物的大多或所有组织充分地表达。优选应用于本发明的方法或克 隆入本发明的遗传构建体的组成型启动子为植物启动子，优选为组成型启动子，例如GOS 2 启动子或具有相似强度和/或相似表达模式的启动子。优选采用来源于植物核酸的植物启 动子。可选地，可采用在植物中可操作的启动子，例如来源于植物病原体的启动子。根据本发明的另一个实施方式，(i)的核酸与一个植物启动子，优选组织特异性的 启动子操作性地连接，这里采用的术语“组织特异性”指在至少一种组织或器官中优势表 达的启动子，例如，组织特异性启动子为种子特异性的启动子，如pWS18 (Joshee等，Plant CellPhysiol. 1998Jan ；39(1) =64-72.)或具有类似强度和/或类似表达模式的启动子。具有相似强度和/或相似表达模式的启动子可以通过将该启动子与报告基因连 接并检测报告基因在不同的植物组织中的功能来寻找。一个适合的报告基因为β葡糖醛 酸糖苷酶，用比色GUS着色来显现植物组织中的β葡糖醛酸糖苷酶活性为本领域技术人员 熟知。表I (a)用于本发明的花优选启动子。这些启动子的序列在引用文献中描述，而 这里作为参考将该序列引入。
基因表达参考文献AtPRP4花http://salus. medium, edu/mmg/ti erney/htmlchalene 合酶(chsA)花Van der Meer，等，Plant Mol. Biol.15,95-109，1990.LAT52花药Twell 等 Mol. Gen Genet. 217 240-245(1989)apetala-3花表1(b)用于本发明的种子优选启动子，这些启动子的序列在引用文献中描述， 而这里作为参考文献将该序列引入。
~ ΜΓ^Ι参考文献种子特异性基因种子Simon 等，Plant Mol. Biol. 5 :191， 1985 ；Scofield,等，J. Biol. Chem. 262 -.12202,1987. ；Baszczynski, 等，Plant Mol. Biol. 14 :633，1990.巴西坚果白蛋白种子Pearson 等，Plant Mol. Biol. 18 235-245，1992.豆球蛋白种子Ellis 等，Plant Mol. Biol. 10 203-214，1988.谷蛋白(稻)种子Takaiwa 等，Mol. Gen. Genet. 208 15-22，1986 ；Takaiwa,等，FEBS Letts. 221 43-47,1987.玉米蛋白种子Matzke 等 Plant Mol Biol, 14(3) 323-321990napA种子Stalberg 等，Plantal99 :515_519， 1996.小麦LMW和HMW谷蛋白1胚乳Mol Gen Genet 216 :81_90，1989 ；NAR 17 461-2,1989小麦SPA种子Albani 等，Plant Cell,9 :171-184, 1997小麦α，β，γ-麦醇溶蛋白胚乳EMBO 3 :1409-15，1984大麦Itrl启动子胚乳大麦Bi，C，D，大麦醇溶蛋 白胚乳Theor Appl Gen 98 :1253-62，1999 ； Plant J 4:343-55,1993 ；Mol Gen Genet 250 :750-60,1996大麦DOF胚乳Mena The Plant Journal, 116(1) :53-62,1998Β1ζ2胚乳EP99106056. 7
18合成启动子胚乳Vicente-Carbajosa 等，Plant J. 13 629-640,1998.稻谷醇溶蛋白NRP33胚乳Wu 等，Plant Cell Physiology 39(8) 885-889,1998稻α-球蛋白Glb-I胚乳Wu 等，Plant Cell Physiology 39(8) 885-889,1998稻 OSHl胚Sato 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93 :8117-8122,1996稻α _球蛋白REB/0HP-1胚乳Nakase 等 Plant Mol. Biol. 33 513-522,1997稻ADP-葡萄糖PP胚乳Trans Res 6 157-68,1997玉米ESR基因家族胚乳Plant J 12 :235_46，1997高粱Y-高粱醇溶蛋白胚乳PMB 32 1029-35,1996KNOX胚Postma-Haarsma 等，Plant Mol. Biol. 39 :257-71,1999稻油脂蛋白胚和糊粉Wu et at, J.Biochem. ,123 :386, 1998太阳花油脂蛋白种子(胚和 干种子)Cummins 等，Plant Mol. Biol. 19 873-876，1992表1(c)可用于本发明的组成型启动子，这些启动子的序列在引用文献中描述， 而这里作为参考文献将该序列引入。
基因表达参考文献肌动蛋白(Actin)组成型McElroy 等，Plant Cell,2 163-171,1990
19 可选地，一个或多个终止子序列也可以用于导入植物的构建体中。术语“终止子” 包括一个控制序列，其是一个在转录单位末端的DNA序列，它给予初级转录本和转录终止 的3’端处理和聚腺苷酸化的信号。其它的调控元件可以包括转录以及翻译增强子。本领 域技术人员已知适合应用于本发明的终止子和增强子序列。本领域技术人员可以知道并容 易得到这种序列。本发明的基因构建体可以进一步包括复制序列的源点，其是在特定细胞类型 中保持和/或复制所必需的。一个例子是当一个基因构建体在细菌细胞中作为游离体 (episomal)遗传元件(如，质粒或cosmid分子)需要保持的时候。优选的复制源点包括， 但并不限于fl-ori和colEl.该遗传构建体可以可选地包括选择标志基因，这里采用的术语“选择标志基因”包 括赋予它所表达的细胞表型的任意基因，以协助识别和/或选择用本发明的遗传构建体转 染或转化的细胞。合适的标志物可以选自导致抗生素或除草剂抗性的标志物。含有重组DNA 的细胞因此将能够在杀灭未转化细胞浓度的抗生素和除草剂存在的情况下存活。选择性标 志基因的例子包括导致对抗生素抗性的基团(如编码新霉素磷酸转移酶的nptll，能够磷 酸化新霉素和卡那霉素，或编码潮霉素磷酸转移酶的hpt，能够磷酸化潮霉素)，对除草剂 产生抗性的基因(例如bar，提供对Basta抗性；aroA或gox，提供对草甘膦抗性)，或提供 新陈代谢特性的基因(如manA，允许植物利用甘露糖作为唯一的碳来源)。可见的标志基因 导致颜色的形成(例如β葡糖醛酸糖苷酶，GUS)，发光(例如萤光素酶)或荧光(绿色荧 光蛋白，GFP，和其衍生物)。合适的选择标志基因的其它例子包括氨苄青霉素抗性(Ampr)， 四环素抗性基因(Tcr)，细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)，膦丝菌素(phosphinothricin)抗 性基因，以及氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因等等。
本发明还包括通过本发明的方法得到的植物。本发明因此提供本发明的方法所得 到的植物，该植物具有改良的生物学特性，具有改变的2XC2H2锌指蛋白水平和/或活性和 /或改变的编码2xC2H2锌指蛋白的核酸序列的表达。因此，本发明一方面，提供一种生产植物的方法，具有改良的生物学特性，包括将 能够改变2xC2H2锌指蛋白活性和/或能够改变2xC2H2锌指基因表达的核酸导入植物中， 根据本发明的另一实施方式，提供了一种生产具有改良的生长特性的转基因植物的方法， 包括向植物中导入和表达2xC2H2核酸。更加具体的，本发明提供了一种生产具有改良生长特性的转基因植物的方法，该 方法包括(i)向植物或植物细胞中导入2xC2H2锌指核酸；(iii)在促进植物生长的条件下培养植物细胞。生长特性可以为这里下文定义的任意特性。2xC2H2锌指核酸包括所有的这里前述的变体核酸以及包括所有的编码这里前述 的变体蛋白质的核酸。在促进植物生长的条件下培养植物细胞，可以包括或不包括再生和 /或生长成熟。蛋白本身和/或核酸本身可以被直接导入植物细胞或植物本身(包括导入植物的 组织、器官或任意其它部位)。根据本发明的一个优选性质，核酸优选通过转化导入植物。这里涉及的术语“转化”包括将外源性多核苷酸转移到宿主细胞中，而不考虑用来 转移的方法。能够继发无性生殖的植物组织，无论通过器官形成或胚芽形成，可以用本发明 的基因构建体来转化，整株植物从那里再生。选择的特定组织将根据可利用的无性繁殖系 统而变化，且最好适合于被转化的特定物种。代表性的目标组织包括叶片、花粉、胚、子叶、 胚轴、雌配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如，顶点分生组织，叶腋芽，以及根分生组 织)，和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和胚轴分生组织)。多核苷酸可以被瞬时或 稳定导入宿主细胞并可以非整合保持，例如，作为质粒。可选地，它可以整合入宿主基因组， 获得的转化植物细胞可以用来使转化植物以本领域技术人员已知的方式再生。目前植物物种的转化是一种相当公式化的技术，可以方便的采用几种转化方法的 任意一种来将目的核酸(例如，2XC2H2核酸)导入一种合适的原种细胞(ancestor cell)。 转化方法包括运用脂质体、电穿孔、增加自由DNA摄入的化学物质、向植物中直接注射DNA、 粒子枪轰击、用病毒或花粉转化或显微发射。对于原体质体可以选自钙/聚乙二醇方法 (Krens,F. Α.等，1882，Nature 296,72-74 ；NegrutiuI.等，June 1987，Plant Mol. Biol. 8， 363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R. D.等，1985Bio/Technol 3,1099-1102)；向植 物材料微注射(Crossway A.等，1986，Mol. Gen Genet 202,179-185) ；DNA 或 RNA-包被粒 子轰击(Klein Τ. Μ.等，1987，Nature 327，70)用(非整合化)病毒及类似物感染。一种 优选的转化方法为农杆菌属(Argobacterium)介导的转化方法。表达2xC2H2基因的转基因稻植物优选通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的 转化，采用任何一种已知的稻转化方法，例如下列文献任一篇所描述的方法公开的欧 洲专利申请 EP1198985A1, Aldemita 和 Hodges (Planta，199，612-617，1996) ； Chan 等人 (PlantMol. Biol. 22(3)491-506，1993) ；Hiei 等人(Plant J. 6 (2) 271-282，1994)；这些公 开作为参考在这里引用，如同完全列举一样。在玉米转化的情形下，优选的方法为Ishida等人(Nat. Biotechnol. 1996Jun ； 14 (6) :745_50)或 Frame 等人(Plant Physiol. 2002May ； 129(1) 13-22)描述的，这些公开作为参考在这里引用，如同完全列举一样。通常转化后，筛选植物细胞或细胞组一个或多个标志物的存在，该标志物通过植 物可表达的基因与目的基因共转移而编码，接着转化材料再生为完整的植株。DNA转移和再生后，可以测定推定被转化植物的目的基因的存在、拷贝数和/或 基因组组成例如运用Southern分析。可选地或附加地，新导入的DNA表达水平可以用 Northern和/或Western分析，两种技术都为本领域普通技术人员所熟知。产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或传统培育技术。例如， 第一代(或Tl)转化植物可以自花受精产生纯合子的第二代(或T2)转化子，T2植物进一 步通过传统培育技术繁殖。产生的转化生物体可以采取多种形式。例如它们可以是转化细胞和非转化细胞的 嵌合体；无性繁殖转化体(例如，所有的转化细胞含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接 体(例如，在植物中，将转化的根茎嫁接到未转化的接穗上)。本发明无疑延伸至这里描述的任意方法所产生的任意植物细胞或植物及其所有 的植物部分和繁殖体。本发明进一步延伸，包含了由任意的前述方法产生的初级转化和转 染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求为后代表现出与通过本发明的方法在 亲本中产生的同样的基因型和表型特征。本发明也包括具有改变的表达和/或2xC2H2锌 指蛋白的水平和/或活性的宿主细胞。这种宿主细胞包含上述的基因构建体。根据本发明 优选的宿主细胞来源于植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫或动物。本发明也扩展到植物的 可收获部分，例如但并不限于种子、叶、果实、花、花瓣、雄蕊、茎培养、茎、根茎、根、块茎、鳞 茎或棉纤维。这里采用的术语“植物”包括整株植物、植物的原种(ancestor)和后代和植 物部分，包括种子、新芽、茎、根(包括块茎)、以及植物细胞、组织和器官。术语“植 物”也包括悬浮培养基、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉、以及小 孢子。本发明的方法中特别有用的植物包括所有属于Viridiplantae超家族的所有 植物，特别是单子叶植物和双子叶植物包括，饲料或草料豆类、装饰植物、食品农作物、 树木或灌木，从包括下列的植物中选择金合欢属(Acacia spp.)，槭属(Acer spp.)， 猕猴桃属(Actinidia spp.)，七叶树属(Aesculus spp.)，新西兰贝壳杉(Agathis australis), Albizia amara, Alsophila tricolor,须芒草属(Andropogon spp.),落花 生属(Arachis spp·)，模柳(Areca catechu)，Astelia fragrans，Astragalus cider, Baikiaea pluri juga, WA^M (Betula spp. ), ^Ι^ Μ (Brassica spp. ), 7KH (Bruguiera gymnorrhiza), Burkea africana, j^W (Butea frondosa), Cadaba farinosa, M^ttiM (Calliandra spp,), ^ (Camellia sinensis),(Canna indica),(Capsicum spp.)，决明属(Cassia spp. ), Centroemapubescens, 7K/RM (ChaenomeIes spp·)，肉|圭 (Cinnamomum cassia),小果咖啡(Coffea arabica)，Colophospermum mopane,绣球小
(Coronillia varia), Cotoneaster serotina, |JL| M (Crataegsu spp.)，H属 (Cucumis spp·)，丰白7^属(Cupressus spp. ), Cyatheadealbata, Im^ (Cydonia oblonga), H ^ W (Cryptomeriajaponica), ^^ M (Cymbopogon spp. ), Cynthea dealbata, Im 梓(Cydonia oblonga), Dalbergia monetaria,大叶骨碎补(Davalliadivaricata)，
22山虫马虫皇属(Desmodium spp.)，粗糖虫丰壳蔽(Dicksonia squarosa)，Diheteropogon amplectens，Dioclea spp，德扁显属(Dolichos spp.), Dorycnium rectum，Echinochloa
Pyramidal is, Ehrartia spp.， ^^ (Eleusine coracana), Eragrestis spp.，束Il ■属
(Erythrina spp.)， ^ 属(Eucalyptus spp.)， Euclea schimperi, Eulalia villosa, 养麦属(Fagopyrum spp.)，南美稔(Feijoa sellowiana)，草莓属(Fragaria spp.)，千 斤拔属(Flemingia spp)，Freycinetia banksii，Geraniun thunbergii，银杏(Ginkgo biloba)，Glycine javanica，墨西哥 丁香属(Gliricidia spp)，陆地棉(Gossypium hirsutum)，银禅属(Grevillea spp.)，Guibourtia coleosperma，岩黄蔑属(Hedysarum spp.)，牛鞭草(Hemarthiaaltissima)，黄茅(Heteropogon contortus)，大麦(Hordeum vulgare)，红苟茅(Hyparrhenia rufa)，小连翅(Hypericum erectum)，Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, ^ ^ M (Iris spp.)， Leptarrhena Pyrolifolia,古月 fe -J1 属(Lespediza spp.)，Lettuca spp.，IS ☆ (Leucaena leucocephala)，Loudetia simplex, Lotonus bainesii，百脉根属(Lotus spp.), Macrotyloma axillare，苹果属 (Malus spp.)，木署(Manihot esculenta)，紫苜猜(Medicago sativa)，水杉(Metasequoia glyptostroboides)，大蕉(Musa sap i en turn)，烟草属(Nicotianum spp.)，马户食草属 (Onobrychis spp.)， Ornithopus spp.，禾§ 属(Oryza spp.)， Peltophorum africanum, 狼尾草属(Pennisetum spp.)，Persea gratissima，碧冬前属(Petunia spp.)，菜豆 属(Phaseolus spp.)，模榔竹(Phoenix canariensis)，Phormium cookianum，石楠属 (Photinia spp·)，白云杉(Picea glauca)，松属(Pinus spp·)，豌豆(Pisum sativum)，新 Μ^^ Χ ^ (Podocarpus totara) ,Pogonarthria fleckii,Pogonarthriasquarrosa, (Populus spp·)，瓜叶牧豆树(Prosopis cineraria)，花方萁松(Pseudotsuga menziesii)， Pterolobium stellatum，西洋梨(Pyrus communis)，栎属(Quercus spp.), Rhaphiolepsis umbellata,(Rhopalostylis sapida), Rhus natalensis, l^rillil^ (Ribes
grossularia)，荼薦子属(Ribes spp·)，剌槐(Robinia pseudoacacia)，蔷藏属(Rosa spp.)，悬钩子属(Rubus spp.)，柳属(Salix spp.)，Schyzachyrium sanguineum，金松 (Sciadopitysverticillata)，北美红杉(Sequoia sempervirens)，巨杉(Sequoiadendron giganteum), (Sorghum bicolor)，疲菜属(spinacia spp.), sporobolus f imbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis，葫戸荼属(Tadehagi spp)，落习习杉 (Taxodium distichum)，阿拉伯黄背草(Themeda triandra)，车轴草属(Trifolium spp.)， 小麦属(Triticum spp.)，异叶铁杉(Tsuga heterophylla)，越桔属(Vaccinium spp.)，里予 豌豆属(Vicia spp.)，葡萄(Vitisvinifera)，锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)，马蹄 莲(Zantedeschia aethiopica)，玉蜀黍(Zea mays)，觅属(amaranth)，卓月鲜蓟、戸舆、莲椰 菜、抱子甘蓝、甘蓝、cmola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、小扁 豆、含油种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖甘蔗、向日葵、番茄、南 瓜和荼、树木和藻类等。根据本发明的优选实施例，植物为一种农作物，例如大豆、向日葵、 canola、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。根据本发明的另一优选实施方式，该植物 为一种单子叶植物，例如甘蔗，更优选为谷类，最优选的植物为选自包括稻、玉米、小麦、大 麦、粟、裸麦或燕麦的组。 在本发明的一个具体实施方式
中，一种植物物种的蛋白(例如鼠耳芥)被导入另
23一植物品种(例如稻)。本发明显示通过向单子叶植物中导入双子叶植物的2xC2H2锌指基 因，植物的生长特性得到了改善。根据本发明的一个特定实施方式，提供了上述的方法，其中植物为单子叶植物，更 为优选该植物为稻或玉米。有利地，本发明方法的操作可导致植物具有改善的生长特性。这里采用的术语“生长特性”优选指产量、植物结构、周期时间的任一种或更多种， 但并不仅限于此。术语“产量”指收获物的量，对农作物，产量也表示每亩生产的收获物的量。根据 农作物，植物的收获部分可能为植物的不同组织，例如种子(如为获取种子而种植的稻、高 粱或玉米)；总地上生物量(如，用作饲料的玉米)、根(如甜菜)、果实(如番茄)、棉纤维， 或具有经济价值的植物的任意其它部分。“产量”也包括植物的产量稳定性，指一年接着 一年，人们可以从植物的后代获得同样的产量，而没有太多的外部因素的干涉，例如气候条 件。“产量”也包括产量潜能，作为可获得的最大的产量。产量可能依赖一些产量要素，这些要素的参数为本领域的技术人员熟知。例如饲 养员清楚的知道他们打算提高的农作物的特定的产量要素以及相应的参数。例如，玉米的关键产量要素包括每公顷或亩的植物数量，每株植物的抽穗数量，每 穗的行数(种子)，每行的谷粒数，每千粒重量。对于饲料谷物的常用参数为地上生物量和
能量容量。稻的关键产量要素为每公顷或每亩的植物数量、每株植物的散穗数目、每散穗的 小穗数目、种子饱满率(饱满种子的数目)以及每千粒重量。优选的提高稻产量的方法包 括提高每散穗花的数目以及提高种子饱满数。提高种子的总数的参数可以与提高花的数目 相联系。“产量”进一步包括典型的生物量要素，如植物的地上部分以及根系统。通常的生 物量参数为面积以及干重，特定的地上生物量参数进一步包括地上面积以及植物高度。根 系统的特定参数包括根比率，根长度和渗透深度，根分支，根须密度，根抗拉伸力以及通气 组织形成。本发明的植物以提高的饱满种子的数量，增加的总种子重量，增加的种子总数量 和增加的收获指数为特征。因此本发明的方法在谷类例如稻和玉米的应用中特别有利。相 应地，本发明的一个特定实施方式涉及一种提高玉米的产量的方法，包括改变编码2xC2H2 锌指蛋白核酸的表达。本发明的植物以提高的千粒重为特点，因此，种子大小或种子体积和/或种子容 量和/或种子组成被本发明的方法改变。本发明的方法提供的种子可以具有更多的营养价 值，更多的淀粉和/或油，可能是由于它们的尺寸的增大。本发明的植物以更大的地上面积为特点，因此本发明的方法在农作物绿色组织的 生长和/或它们地上生物量的生长的应用特别有利。本发明的方法对草、草料农作物(例 如饲料玉米、苜蓿、medicago等等)、树木、甘蔗等特别有用。本发明的方法所获得的产量的提高，可作为一个或多个上述的产量要素和/或参 数提高的结果而得到。这里采用的术语“结构”包括植物的外观或形态学，包括其任一种或多种的结构特征或组合结构特征。这种结构特征包括植物的任意细胞、组织或器官或细胞、组织或器官的 组的形状、大小、数量、位置、质地、排列或模式，包括根、叶、芽、茎、叶柄、毛状体、花、花瓣、 柱头、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、种子、胚、胚乳、种子表皮、糊粉、须根、形成层、木材、心材、薄 壁组织、通气组织、筛分子、韧皮部或者脉管组织等等。可以被本发明的方法改变的特定的 结构特性为增加的植物高度、增加的茎或杆或分蘖枝或花序或花梗的数目或大小、增加的 开花数目或大小、增加的如雄花穗和抽穗的分枝或改变的开花特性。可以被本发明的方法 该改变的优选的结构特性为叶子的结构。这里采用的术语“叶子结构”包括典型的叶子的 特征，例如长度、宽度、厚度、细胞数、细胞大小和绿色度。典型地，本发明的植物表现出增加的叶片面积和/或增加的叶片宽度。这种特性 特别重要，因为它使得植物的叶片外形最优化，使用于光合作用的面积最大化。为了这一目 的，优选叶子加宽，但叶子也可以加长或变小或变圆。这些效果可以导致更健康的植物。可 选地，该特性增加植物的美学特性，例如绿色和更强壮的叶子。这里采用的植物的“周期时间”表示植物达到其最大总面积的90%的时间。该参 数为植物生长持续时间的标志。延长的植物生长仅在本发明的部分植物中表现出来，可能 受转化事件的选择或驱动2xC2H2核酸的启动子的选择的控制，例如当采用种子优先表达 的启动子的时候，就不表现出这种性状。其它可以被本发明的方法提高的“生长特性”为生长率、初期活力、改变的Tmid、 T90或A42或改变的生长曲线。实施例所列的数据清楚的表明了这里上面定义的一个或多个生长特性可以在一 种植物中组合。或者，根据选择的转化事件和/或根据采用的启动子，可以表现或缺失或更 多或更少的显现出一个或多个这些生长特性。本发明的方法也可以用于赋予植物对应激的耐受能力。特别是STZ型的2xC2H2 可以用于赋予植物对盐压力的耐受力和/或对干旱的耐受力，根据一个特定的具体实施方 式，一种组织优选的启动子，例如种子优选的启动子可用于这些方法。本发明也涉及采用编码锌指蛋白的核酸序列及其同源物、衍生物和活性片段来改 变植物的生长特性，优选提高产量，进一步优选提高种子的产量。本发明也涉及采用编码 2xC2H2锌指蛋白的核酸序列及其同源物、衍生物和活性片段和2xC2H2锌指蛋白本身和其 同源物、衍生物和活性片段作为生长调节剂。SEQ ID NO 1所代表的序列及其部分和SEQ ID NO 2，及其同源物、衍生物和活性片段均可用于改变植物的生长特性，如这里前文所述的。 因此该序列可以用作生长调节剂，例如除草剂或生长刺激剂。本发明也提供了含有SEQ ID NO 2所示的蛋白质，或其同源物、衍生物和活性片段的组合物，用作生长调节剂。这里用的 生长调节剂表示能够提高产量的调节剂，因此也指产量调节剂。特别是，本发明提供一种产量调节组合物，含有编码2xC2H2蛋白的核酸，和/或含 有2xC2H2蛋白，和/或含有这里前文定义的构建体。这种产量调节组合物进一步包含产量 调节组合物中常用的添加剂，例如溶剂或载体。相反地，本发明的序列也可以为农用化学品化合物的目的靶标，例如除草剂或生 长刺激剂。相应地，本发明包含将编码2xC2H2蛋白的核酸、2xC2H2蛋白和/或权力要求20 到22所定义的构建体用作农用化学品，例如除草剂或生长刺激剂的靶标。根据本发明的方法也可以通过在植物中共表达编码2xC2H2锌指蛋白的基因和
25至少一种其它与编码2xC2H2锌指蛋白的基因协同的基因来实行。这种基因可以是编码 2xC2H2锌指蛋白的靶蛋白的基因。共表达可以通过在植物中可表达的载体中在植物可表达 的启动子的控制下克隆基因，用农杆菌属(Agrobacterium)介导的植物转化将表达载体导 入植物细胞来实现。因此，根据本发明的方法可以导致植物具有改变的生长特性，特别是这 里前文所述的提高产量，并与其它经济上有利的特性联合，例如进一步提高产量的特性，对 多种应激的耐受能力，改变多种结构特征和/或生物化学和/或生理学特性。由于本发明的植物具有极好的生长特性和高产量，它们适合于酶、医药品或农用 化学品的生产。它们也适合生产食品或饲料产品。本发明无疑延伸至从这些植物中分离的酶、医药品或农用化学品以及食品或饲料
女口
广 PFt ο另外，编码2xC2H2蛋白的核酸，2xC2H2蛋白和/或本发明的构建体可以用于培植 程序，以生产产量提高的植物。特别地，在特别常规的培植程序中，例如在标志物辅助饲养中，上述的等位基因变 体的运用也包含在本发明内；这可以是它们在本发明的方法中另外的应用。这种培植程序 有时要求通过对植物进行突变处理向植物中引入等位基因变体。一种合适的诱导突变的方 法为EMS诱变。接着通过例如PCR的方法来识别等位基因变体，之后为选择步骤，来选择讨 论序列的更好的等位基因变体，该变体可以引起植物中生长特性的改变。选择通常通过监 控含有不同的待检测序列的等位基因变体的植物的生长表现进行，例如，SEQ ID NO 1。监 控生长表现可以在温室或田野中进行。另外可选择的步骤包括将其中识别了优良等位基因 变体的植物与其它植物杂交，这可以被用于将感兴趣表型特性结合起来。根据另一类型的培植程序，识别一种DNA标志物，该标志物通常可以与能改变植 物中编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达的基因遗传连锁，该基因可以为编码2xC2H2锌 指蛋白本身的基因或其它可以直接或间接影响编码2xC2H2锌指蛋白的基因的表达和/或 2xC2H2锌指蛋白本身活性的基因。接着，该DNA标志物可用于培植程序来选择具有改变的 生长特性的植物。根据本发明的方法也可以向植物中导入染色体(自然的或人工的)的至少一部分 (例如细菌人工染色体(BAC))，该染色体含有编码2xC2H2锌指蛋白的至少一个基因，可选 地，与一个或多个相关基因家族成员同时导入。因此，根据本发明的另一个方面，提供了一 个通过在植物中表达含有至少一个编码2xC2H2锌指蛋白的基因的染色体的至少一部分来 改变植物的生长特性的方法。本发明将参考下列附图进行描述

图1用于在植物中在G0S2启动子的调控下表达2xC2H2锌指蛋白的表达载体的图 谱。⑶S1536为鼠耳芥耐盐锌指(STZ)蛋白cDNA的内在密码子。锌指蛋白表达盒具有G0S2 启动子和一个位于Ti质粒的左边界(LB重复)和右边界(RB重复)范围内的双终止子序 列(T-zein和T-rbcS-deltaGA)。在这些T边界范围内也克隆了可筛查的标记物以及可选 择的标记物，每个标记物均在组成型启动子(Prom)的控制下，其后是终止子序列(多聚腺 苷酸和t-NOS)。而且，该载体也含有一个细菌复制的复制起点(pBR322(0ri+b0m))和用于 细菌选择的可选择标志物(Sm/SpR)。图2A显示了用在G0S2启动子的控制下的STZ锌指转基因转化的阳性Tl系的数
26字图像，图2B显示了相应的空接合子(nullizygote)植物的数字图像。图3列出了用于本发明的方法的序列。SEQ ID NO 1是从鼠耳芥中分离的STZ编 码核酸；起始和终止密码子用黑体字突出显示。SEQ ID N02为SEQ ID NO 1编码的STZ蛋 白序列。在STZ蛋白中，标注了核定位信号，也称为KRS基序或B盒(黑体字，斜体字，下划 线)，以及L盒(黑体字，下划线)，EAR基序(黑体字，斜体字)，以及两个含有QALGGH基序 (黑体字和加框)的C2H2锌指结构域。SEQ ID NO 10到SEQ ID N025提供了其它植物物 种中的鼠耳芥的多种直向同源物(orthologs)序列。SEQ ID NO 26到SEQ ID NO 35提供 了 STZ蛋白的多种平行进化同源物(paralogs)序列(来自鼠耳芥属)。SEQ ID NO 36到 SEQ IDNO 50提供了本发明方法中所采用的相关2xC2H2基因和蛋白序列。图4是在温室㈧或田野⑶中生长的T3植物的照片。照片显示了 STZ转化植 物后代的产量增加(特别是地上生物量和植物高度)。图5显示了在种子优选的WSI18启动子(PR00151)的调控下，在稻中表达鼠耳芥 STZ基因(⑶S1536)的二元载体。该载体含有来源于Ti质粒的T-DNA，被左边界(LB重复， LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58))限定。锌指蛋白表达盒具有一个WSI18(PR00151)启动子和双终止子序列(T-zein和 T-rbcS-deltaGA)，位于Ti质粒的左边界(LB重复)和右边界(RB重复)的范围内。在这 些T边界范围内也克隆了可筛查的标记物以及可选择的标记物，每个标记物均在组成型启 动子(Prom)的调控下，其后是终止子序列(多聚腺苷酸和t-N0S)。而且，该载体也含有一 个细菌复制的复制起点(pBR322(0ri+b0m))和用于细菌选择的可选择标志物(Sm/SpR)。实施例本发明将只为说明目的而参考下列实施例加以描述。DNA 操作除非另外说明，重组DNA技术根据Sambrook (2001)分子克隆实验室手册，第 三版，冷泉港实验室出版社，CSH,纽约，或第1和2卷的Ausubel等人(1988)，Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols 中MiffiiS的t示}^Mi乍禾呈;！5; ^ 。 植物分子工作的标准的材料和方法在Plant Molecular Biology Labfase (1993)中描述， 作者 R. D. D. Croy，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和 Blackwell Scientific Publications(UK)出版。实施例1 基因克隆从鼠耳芥 (Arabidopsis thaliana)籽苗cDNA文库 (Invitrogen, Paisley, UK)通过PCR扩增编码STZ蛋白的基因。从籽苗中提取的RNA反转录后，cDNAs 被克隆入PCMV Sport 6. O0平均插入文库的大小为1. 5kb，克隆的原始数目为 1.59X 107cfu。原始滴度确度为9.6X105cfu/ml，在第一次eXlO^cfu/ml扩增后。提 取质粒后，在50μ1 PCR混合物中使用200ng模板。PCR扩增所用的引物序列包括 Gateway重组的attB的位点(用黑体字表示)，为PRM3204 (正向，起始密码子为斜体
字)5， GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA]r6GCGCTCGAGGCTC3，
(SEQ ID NO 3)和PRM3205(反向，互补的终止密码子为斜体字)5， GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATTTCC mAAGTTGAAGTTTGA 3，
(SEQ ID NO 4)。
用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进行PCR反应。PCR片段(CDS1536)被扩 增并用标准方法纯化。接着进行Gateway操作程序的第一步，BP反应，其中PCR片段在体 内用pDONR质粒重组以产生根据Gateway的术语学的“进入克隆(entry clone) ρ3359。 PDONR从Invitrogen购买，作为Gateway技术的一部分。实施例2 用pG0S2: AtSTZ进行稻转化的载体构建随后进入克隆p3359被用于与一个用于稻转化的目的载体(destination vector)p0640LR反应。该载体在T-DNA界限的范围内含有作为功能元件的植物筛选标 记物，用于LR与目的序列在体内重组的Gateway盒已经克隆入供体载体。锌指蛋白组成 性表达的稻G0S2启动子位于该Gateway盒的上游(De Pater等，Plant J. 2 (6) 837-844， 1992)。重组步骤后，得到的具有表达盒CD4398(图1)的表达载体被转化入农杆菌属 (Agrobacterium)菌株LBA4404，并随后导入植物中。培育转化的稻植物，然后按照实施例 3描述的方法确定不同的参数。实施例3 用pG0S2: AtSTZ(CD4398)转化的TO、Tl和T2转基因稻植物的评估大约产生15到20株独立的TO转化子。将初级TO转化子从组织培养室转移到温 室，以培育和收获Tl种子。其中保留Tl后代按转基因的存在/缺乏分离为3 1的6事 件(event)。对每个事件，通过PCR筛选含有转基因(杂合子和纯合子)的大约10个Tl籽 苗，以及缺乏转基因(空接合子)的大约10个Tl籽苗。基于Tl评估的结果，选择三个事 件，为进一步在T2代中定性，一种事件为一些参数十分肯定(positive)，第二种事件为一 些参数比较肯定，但并不显著，第三种事件为中性的。对从Tl阳性植物中收集的种子(杂 合子和纯合子)，通过检测标志物的表达而筛查。对每一选择的事件，选择杂合子种子进行 T2评估。每个种子中相同数目的阳性和阴性被移植，以进行温室中的评估(S卩，对每个事件 的40株植物进行栽培，其中大约20株转基因阳性，大约20株为阴性)。因此，三种事件的 总数达到120株植物，以对T2代进行评估。Tl和T2植物被转移至温室并评估植物生长参数以及种子的参数，如下文将要描 述的。(I)表型特征的统计分析双因素ANOVA(离差分析)作为植物表型性状的总体评估统计模型。对所有用目 的基因转化的所有植物，对所有检测的参数进行F检验。进行F检验来检测所有的转化结 果的基因的效果并检验基因总的效果或“综合基因效果”。通过f检验值确定的有意义的数 据，表明了“基因”效果，表示观察到的表型不仅由基因的存在或位置引起。在F检验的情 况下，综合基因效果的显著性的阀值设置为5%概率水平。为检测每一事件内基因的效应，S卩，株系特异性(line-specific)效应，采用从转 基因植物以及相应的空载植物(null plant)中获得的数据在每一个结果内进行t检验。 "Null植物”或“Null分离株”为用与转基因植物同样的方式处理的植物，但其中转基因被 分离。Null植物也可以被描述为纯合子阴性转化植物。T检验的显著性的阀值设为10%概 率水平。在转化事件的一个种群内，一些事件可能在该t检验阀值之下或之上。这基于基因 可能只在基因组的特定位置时才有效应的假设，该位置依赖性效应的发生率并非罕见。这 种基因效应也可以指“基因的株系性效应(line effect) ”，ρ值通过比较t_分布与t值， 或者比较f分布与F值而得到。代表零假设(零假设为“转基因没有任何效应”)概率的P值是正确的。(II)棺物牛长测量选择的植物在温室中栽培，每株植物都接受到独特的条形码标记以将表型数据和 相应植物清楚地联系起来。选择的植物在IOcm直径的罐的土壤中栽培，在下列环境设置 光周期=11. 5h，光照强度=30，000Iux或更大，日间温度=28°C或更高，夜间温度=22°C， 现对湿度=60-70%。转基因植物和相应的空接合子在随机位置并行培育。从播种期直到 成熟期(生物量没有更大增长的时期)，植物每周通过数字成像室(图2A和2B中显示了图 片的例子)。每次从至少6个不同角度拍摄每株植物的每个时间点数字图像(2048X1536 像素，16百万颜色)。下述的参数采用图像分析软件从数字图像自动生成。(a)地上面积植物地上面积通过计算从背景中区分的地上部分的像素总数来确定。该数值为不 同角度在同一时间点拍摄的照片的平均值，并校准转化为平方mm表示的物理表面值。试验 表明用这种方式测定的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关联。为进行T2评估而选择的植物株的最大地上面积值的结果概括于表1。与空接合子 相比，表现最好的植物株显示出34%的生物量的增长。当对所有T2事件的所有植物进行F检验时，显然转基因植物的地上面积表现出显 著的增长，平均增长约为18%。在田地条件下培育的STZ转化植物也表现出显著增长的地 上生物量(见图4)。表1 :STZ转基因T2植物的地上面积。每行相应于一个事件，确定转基因(TR)和 空载植物(null)的平均最大地上面积(以mm2表示)。显示了每一事件的转基因种群和空 接合子差别的绝对值(dif.)以及两个种群差别的百分比(％dif)。P代表每个事件的t检 验的概率。最后一行表示了从所有事件计算的平均值。这里通过F检验产生ρ值。 (b)植物高度测量植物的高度通过罐上部的边缘的水平线与植物地上部分的最高像素之间的距离 确定。该值为同一时间点从6个不同角度拍摄的照片的平均值，并通过标准化转化为用mm 表示的物理距离。试验表明用这种途径检测的植物高度与用直尺手工测量的植物高度相 关。当在营养生长期的末期测量时，植物高度的增长在STZ转化植物中清楚地显示出 来(见图4A)。当在田野中栽培时，该参数也在收获时的STZ转化植物中表现出来(见图 4B)。
(c)总面积周期时间测量植物按完整的细胞周期每周进行照相，植物的最大总面积按上述提到的方法确 定。总面积周期时间为植物达到其最大总面积的90%的时间。该参数为植物生长周期持续 时间的指示。只在一些转基因株系中具有周期时间的效应，这些少数株系表现出延长的生长期。(III)对种子相关参数的测量收获、装袋、并用条形码标记成熟的初级圆锥花序，然后在烤箱中37°C干燥3天。 圆锥花序接着被脱粒，并收集所有种子。用吹风装置将饱满的壳与空壳分离。分离后，将种 子用可商业化购买得到计数器计数。将空壳丢弃，饱满的壳在分析天平上称重，对种子的横 截面积用数字成像进行测量。该操作步骤导致一组下面描述的种子相关参数。(a)每株植物的饱满种子总数通过对分离步骤后保留的饱满壳的计数来确定饱满种子的数目。每株植物饱满种子的总数总结于表2。T检验显示了两种事件转基因植物产生比 空接合子多106%和130%的饱满种子。表2 =STZ转基因T2植物的饱满种子的总数。每行相应于一个事件，确定转基因 (TR)和空载植物(null)的平均饱满种子数目。显示了每一事件的转基因种群和空接合子 差别的绝对值(dif.)以及两个种群差别的百分比(％ dif)。P代表每个事件的t检验的概 率。最后一行表示了从所有事件计算的平均数。这里通过F检验产生ρ值。 (b)每株植物的总种子重量通过称量从植物收获的饱满壳的重量来测量总种子重量。STZ转化植物的总种子重量值概括于表3。与空接合子相比，STZ转基因植物产生 显著增加的种子重量。转基因植物种子重量的差别可以高达138%或更高。表3 :STZ转基因T2植物的每株植物的总种子重量。每行相应于一个事件，确定转 基因(TR)和空载植物(null)的平均总种子重量。显示了每一事件的转基因种群和空接合 子差别的绝对值(dif.)以及两个种群差别的百分比(％ dif)。P代表每个事件的t检验的 概率。最后一行表示了从所有事件计算的平均数。这里通过F检验产生ρ值。
30 (c)收获指数本发明的收获指数定义为总种子产量和地上面积(mm2)的比例，乘以因子106。STZ转基因植物的收获指数值总结于表4。STZ转基因植物的收获指数具有显著增 加。与相应空接合子相比，转基因植物的收获指数的增加可能高达66%。表4 =STZ转基因T2植物的收获指数。每行相应于一个事件，确定转基因(TR)和 空载植物(null)的平均收获指数。显示了每一事件的转基因种群和空接合子差别的绝对 值(dif.)以及两个种群差别的百分比(％ dif)。P代表每个事件的t检验的概率。最后一 行表示了从所有事件计算的平均值。这里通过F检验产生ρ值。 (d)植物的千粒重(TKW)千粒重(TKW)是从计算的饱满种子的数目以及他们的总重量推断的参数。STZ转基因植物的每千粒重量值列于表5。STZ转基因植物具有增加的千粒重。与 相应的空接合子相比，转基因植物TKW的增加可以高达6%。表5 =STZ转基因T2植物的千粒重。每行相应于一个事件，确定转基因(TR)和 空载植物(null)的平均千粒重。显示了每一事件的转基因种群和空接合子差别的绝对值 (dif.)以及两个种群差别的百分比(％dif)。P代表每个事件的t检验的概率。最后一行 表示了从所有事件计算的平均值。这里通过F检验产生ρ值。 (e)种子总数每株植物的种子总数通过计算从植物收获的壳测量。每株植物的种子总数总结于表6。STZ转化植物的种子总数增加。与相应的空接 合子相比，转基因植物种子总数的增加可以高达68%。表6 =STZ转基因T2植物的种子总数。每行相应于一个事件，确定转基因(TR)和 空载植物(null)的平均种子总数。显示了每一事件的转基因种群和空接合子差别的绝对 值(dif.)以及两个种群差别的百分比(％ dif)。P代表每个事件的t检验的概率。最后一 行表示了从所有事件计算的平均值。这里通过F检验产生ρ值。 结论可以作出结论，当与对照非转基因植物相比时，STZ转基因植物中植物生长增强， 这在如地上面积的参数中表现出来，其增长大于20%。这一效应可归结于STZ基因在转基 因植物中的表达。另外，在一些转化事件中，STZ转基因中植物生长的长度被改变。因为在 那些发生这些效应的转化事件中，在检测的条件下，营养生长期平均延长了 4到6天。另外，STZ转基因植物中产量提高。一些种子参数反应了这种产量提高。转基因 植物中收获种子的总数至少比对照植物增加了 100%，因此这些事件表现出差别。这些事件 中转基因植物种子总数也有所增长，增长大于30%。这些转基因植物的种子饱满度大大提 高，饱满种子的数量达到100%以上的差别。转基因植物的种子也变重，或许更大，如从千粒重得到的更高的值所提示的。TKW 参数是稻栽培变种，如nipponbare，以及这里用的生长条件中非常稳定的参数。这表示该参 数不易受影响，使其成为重要的产量参数。因此6% TKff的增长代表显著的产量的增长。收获指数，另一重要的产量参数，在转基因植物中提高了大于50%。总之，基于对STZ转基因植物T1、T2以及更多代的评估，可以作出结论STZ转基因 的存在对植物和/或其器官的大小具有积极效应，对最终的收获产量也有积极效应。
(iii)根部牛长测量转基因植物与其相应的非转基因空分离子在透明的罐中相邻培育。对每个含有特 定启动子2xC2H2组合的构建体，评估平均最少5个独立转化事件的根生长、根发育和根结 构。通常，对每个转化事件，将10株转化植物与10株空接合子植物(nullizygote)进行对 比。在营养生长期间，每周拍摄根的照片。照片经过处理和分析来提取下列描述的根的参 数值。上文描述的统计分析应用于这些数据。a)根部面积从每个根部图像的总像素数计算总根部面积。根的根部面积和干重以及根生物量 的正线性相关先前已经通过类似的试验确定，因此根部面积为根生物量的良好近似值。b)根长度根据图像中所有根的周长计算植物根的总周长。该测量和根长度之间的线性相关 先前已经确立。因此，根的长度从总根部周长来推算。c)根宽度植物的平均根宽度用根面积和根长度之间的比例表示。与对照植物相比，本发明的STZ转基因植物表现出良好的性能。转基因植物的上 面详述的一个或多个根部参数被改变，特别地，转基因植物具有增加的根生物量，例如由于 增加的根部干重或面积，和/或增加的根部长度和/或增加的根部宽度。实施例4 叶片宽度测量。与相应的对照非转基因植物相比，STZ转基因植物的叶子更大更宽。为量化叶片宽 度的增加，在已经达到营养生长期终点的植物中，用直尺在叶子的最宽点测量旗瓣(flag) 叶子的叶片宽度(横轴的长度)，接近长度的一半。结果列于表7，表明当与相应的空接合 子相比时，叶片宽度的增加至少在测量的事件中为大约15%。表7 :STZ转基因T2植株的叶片宽度。确定选择事件的转基因(TR)和null植 物(null)的平均叶片宽度。列举了该事件的转基因群和空接合子之间的绝对值的差别 (dif.)以及两群之间差别的百分比(％dif)。P代表通过F检验产生的概率。 实施例5 用pWSI18: AtSTZ的稻转化的载体的构建pWSI18(PR00151)-AtSTZ(CDS1536)盒的转化载体的构建基本按照实施例2的方 法进行。前述的进入克隆P3359，随后用于与用于稻转化的目的载体P05653进行LR反应。 该目的载体含有一个作为T-DNA边界范围内的功能元件的植物可筛选标记和欲用于LR与 已经克隆入供体载体的目的序列体内重组的Gateway盒。种子优先表达的WSI18启动子 (PR00151)位于该Gateway盒的上游。重组步骤后，获得的具有表达盒⑶4398 (图5)的表 达载体被转化入农杆菌属(Agrobacterium)株LBA4404，随后该载体被转化入稻植物，使转 化的稻植株生长然后检测实施例3中描述的多种参数。
实施例6 用种子优选的表达盒PWSI18: AtSTZ(CD4398)转化的TO和Tl转基因 稻植物的评估含有具有⑶4398表达盒的表达载体的愈伤组织(Calli)和根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)株的制备按照实施例3所述的进行，进行胼愈伤组织转化 和植物再生。大约产生15到20个独立的TO稻转化子，将初级转化子从组织培养室转移到温室 进行培植和收获Tl种子。其中保留Tl代按转基因的存在/缺乏分离为3 1的事件。对 每个这些事件，通过检测标记物的表达筛选大约10个含有转基因(杂合子和纯合子)的Tl 籽苗，以及大约10个缺乏转基因(空接合子)的Tl籽苗。转基因苗与对照空接合子相邻种植，按照前述的方法收获种子并确定千粒重。转化的植物含有表达盒CD8490(种子优选的pWSI18 STZ)，具有正常和健康的外 观，并与对照植物同时收获。当与对照植物相比较时，从转基因植物收获的种子具有增高的 千粒重，如表8中所示，千粒重增长超过10%。表8 :STZ转基因Tl代植物千粒重。确定选择事件的转基因(TR)和null植 物(null)的平均千粒重。列举了选择事件的转基因群和空接合子之间的绝对值的差别 (dif.)以及两者之间差别的百分比(％dif)。P代表通过F检验产生的概率。 实施例7 其它2xC2H2编码基因的克隆、转化和评估。表9中给出了在多种启动子控制下的，含有STZ或其它2xC2H2锌指蛋白的构建体 的一般情况，该构建体为用于本发明的方法而构建。克隆的2xC2H2基因的编码区域(G0I， 目的基因)按照实施例1的操作步骤，通过PCR从cDNA扩增。每个2xC2H2基因的特定引 物在公共数据库的基因序列的起始和终止密码子处设计，登录号在表9中列出。这些克隆 序列这里也与表中所示的SEQ ID NO组合为一体。而且，分离的PCR片段也给予单独的⑶S 号码。然后将具有2xC2H2基因的PCR片段克隆在特定启动子的控制下。对不同的基因进 行不同的组合(参加表9)。制作嵌合(Chimeric)构建体，CD号代表携带了嵌合构建体的 细菌菌株。按照前述的操作程序，通过用嵌合构建体转化植物得到相应的转基因植物。对 转基因事件的评估揭示了与对照的非转基因植物相比，转基因植物产量的提高以及叶子表 面面积的增加和/或营养生长期限的延长。 表10 本发明的方法中与2xC2H2组合应用的启动子的例子 实施例8 发明在玉米中的应用这里所述的本发明的方法也在玉米中采用。为达到这一目的，STZ编码基因，例如 玉米或其它的STZ直向同源物(ortholog)，在玉米中可行的启动子的控制下，在适合于农 杆菌属(Agrobacterium)介导的玉米转化的植物转化载体中克隆。用于玉米转化的方法 文献中已经记载(Ishida 等，Nat Biotechnol. 1996Jun ； 14 (6) :745_50 ；Frame 等，Plant Physiol. 2002May ；129(1) 13-22) 通过这些方法制备的转基因植物在温室中生长，进行Tl种子生产。通过定量实时 PCR和Southern印迹分析来检测转基因的遗传性和拷贝数，通过反转录PCR和Northern分 析确定转基因的表达水平。选择具有转基因的单拷贝插入和具有转基因表达水平改变的转 基因系进行T2种子生产。使后代种子发育，在温室中以非常适合玉米的条件下生长(16:8光周期，26_28°C 日间温度和22-24°C夜间温度)，最好还在水缺乏、氮缺乏以及过量NaCl的条件下。用从同 一母系的零分离种(nullsegregant)以及同一栽培变种的野生型植物作为对照。对自花受 精或交叉受精的后代植物的不同的生物量和发育参数进行评估，包括植物高度，茎/干的 厚度，茎的大小，叶子数目，总地上面积，叶子的绿色，成熟时间，抽丝时间，花期时间，开花 时间，抽穗数目，抽穗长度，抽穗行数，谷粒数目，谷粒大小，谷粒油含量，谷物成熟度，收获 时间。也对这些种系的种子的多种参数进行测定，例如谷粒大小，每株植物的总谷粒产量， 谷粒质量(淀粉含量，蛋白含量和油含量)。
选择与相应的对比系相比最显著地提高的植物系进行进一步的田间测验和标记 辅助培养，目标是将田间有效的转基因品质转移到商品化的种质。在田间对玉米生长和产 量相关参数的检测运用良好确立的操作程序进行。对玉米植物的产量参数进行特定评估， 例如每亩的植物量，每株植物的抽穗量，每穗的行数，每行的种子数和TKW。随后也采用良好 确立的操作程序增强特定的基因座(例如含有转基因的基因座)从一种种质到另一种质的 渐渗。
权利要求
一种相对于相应野生型植物提高植物产量的方法，包括改变植物中编码2xC2H2锌指蛋白的核酸序列的表达和/或改变植物中2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性。
2.一种相对于相应的野生型植物，增大叶表面面积的方法，包括改变植物中编码 2xC2H2锌指蛋白的核酸序列的表达和/或改变植物中2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性。
3.一种相对于相应的野生型植物，延长营养生长期的方法，包括改变植物中编码 2xC2H2锌指蛋白的核酸序列的表达和/或改变植物中2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性。
4.根据权利要求1到3任意一项的方法，其中所述的改变表达、水平和/或活性通过重 组方法和/或化学方法而实现。
5.根据权利要求1到4任意一项的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白包含QALGGH基序。
6.根据权利要求1到4任意一项的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白包含NNM(W)QMH基序。
7.根据权利要求1到6任意一项的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白包含EAR基序。
8.根据权利要求1到7任意一项的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白进一步包含B品.o
9.根据权利要求1到8的任意一项的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白进一步包含L品.o
10.根据权利要求1到9任意一项的方法，其中所述的2xC2H2锌指蛋白来源于双 子叶植物，优选来自十字花科(Brassicaceae)，进一步优选来自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，更加优选核酸为SEQ ID NO 2所示或其同源物、衍生物或活性片段，和/或所述 的核酸为SED ID NO 1所示或其一部分，或能够与之杂交的序列。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的同系物、衍生物或活性片段与SEQID NO 2 的序列具有以渐增的优选顺序，至少30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%， 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 52 %, 54 %, 56 % , 58 %, 60 %, 62 %, 64 %, 66 %, 68 %, 70 %, 72 %, 74 %, 76 %, 78 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88%，90%，92%，94%，96%，98% 的序列一致性。
12.根据权利要求1到11任意一项的方法，其中所述的植物为单子叶植物。
13.根据权利要求1到12任意一项的方法，其中所述的改变表达是通过向植物中引入 能够改变编码2xC2H2锌指蛋白的基因的表达和/或能够改变2xC2H2锌指蛋白的水平和/ 或活性的核酸达到。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的能够改变表达的核酸为编码2xC2H2蛋白的核 酸，例如权利要求5到11的任意一项中所定义的2xC2H2蛋白。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述的向植物中引入的核酸为权利要求14中 所定义的核酸的可变剪接变体。
16.根据权利要求13或15的方法，其中所述的向植物中引入的核酸为权利要求14中 所定义的核酸的等位基因变体。
17.根据权利要求13或16的方法，其中所述的向植物中引入的核酸包括染色体的至少 一部分。
18.根据权利要求1到17的任意一项的方法，其中所述的改变表达包括增加表达。
19.根据权利要求1到18的任意一项的方法，其中所述核酸的表达通过植物启动子来 驱动，优选组成性启动子，例如G0S2启动子。
20.根据权利要求1到18的任意一项的方法，其中所述核酸的表达通过植物启动子来 驱动，优选组织优选的启动子，例如种子优选的启动子。
21.根据权利要求1到20的任意一项的方法，其中所述的提高产量包括提高地上生物量。
22.根据权利要求1到20的任意一项的方法，其中所述的提高产量包括提高种子产量。
23.根据权利要求1到20的任意一项的方法，其中所述的提高产量包括提高根产量。
24.构建体，其包含(i)能够改变编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达和/或能够改变2xC2H2锌指蛋白的 水平和/或活性的核酸；(ii)一个或多个能够驱动(i)中的核酸序列表达的植物调控序列；以及可选地(iii)转录终止序列。
25.根据权利要求24的构建体，其中所述(i)的核酸序列为权利要求14到17任一项 中所定义的核酸。
26.根据权利要求24或25的构建体，其中所述(ii)的调控序列至少为组成性启动子， 例如G0S2启动子。
27.根据权利要求24或25的构建体，其中所述(ii)的调控序列为至少一种组织优选 的启动子，例如种子优选的启动子。
28.含有根据权利要求24到27任意一项的构建体的宿主细胞。
29.生产具有增加的产量、增加的叶表面面积和/或延长的营养生长期的转基因植物 的方法，该方法包括(i)向植物或植物细胞中引入2xC2H2锌指核酸；(ii)在促进植物生长的条件下培养该植物或植物细胞。
30.可根据权利要求1到23和29的任意一项的方法得到的植物，相对于相应的野生型 植物而言，该植物具有增加的产量、改变的叶表面面积和/或延长的营养生长期。
31.具有增加的产量、增加的叶表面面积和/或延长的营养生长期的转基因植物，相对 于相应的野生型植物而言，该植物具有编码2xC2H2锌指蛋白的核酸改变的表达和/或改变 的2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性。
32.如权利要求30或31所定义的植物的一部分，优选可收获部分，植物的繁殖体或后 代，相对于相应的野生型植物而言，该后代具有编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的改变的表达 和/或2xC2H2锌指蛋白改变的水平和/或活性。
33.根据权利要求30到32的任意一项的植物或植物部分，该植物为单子叶植物，优选 为谷类。
34.根据权利要求30到33的任意一项的植物或植物的一部分，选自水稻、玉米、小麦、 大麦、粟、燕麦、黑麦、高梁、大豆、向日葵、canola、甘蔗、苜蓿、豆科植物(leguminosae)(菜 豆、豌豆)、亚麻、羽扇豆(lupinus)、油菜籽、烟草、番茄、马铃薯、南瓜、木瓜、杨树和棉花。
35.编码2xC2H2蛋白的核酸、2xC2H2蛋白和/或权利要求24到27任意一项定义的构 建体在增加植物产量中的应用。
36.一种产量调节组合物，包括编码2xC2H2蛋白的核酸，和/或包括2xC2H2蛋白，和/ 或包括权利要求24到27的任意一项所定义的构建体。
37.编码2xC2H2蛋白的核酸、2xC2H2蛋白和/或权利要求24到27任意一项定义的构 建体在增加叶表面面积中的应用。
38.编码2xC2H2蛋白的核酸、2xC2H2蛋白和/或权利要求24到27任意一项定义的构 建体在延长营养生长中的应用。
39.编码2xC2H2蛋白的核酸、2xC2H2蛋白和/或权利要求24到27任意一项定义的构 建体在作为农用化学品靶标中的应用。
40.编码2xC2H2蛋白的核酸、2xC2H2蛋白和/或权利要求24到27任意一项定义的构 建体在育种工程中的应用。
41.权利30到34的任意一项所定义的植物在生产酶、医药品、农用化学品中的应用。
42.权利30到34的任意一项所定义的植物在生产食品或饲料产品中的应用。
全文摘要
本发明涉及通过改变植物中编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达和/或改变植物中2xC2H2锌指蛋白的水平和/或活性来改变植物的生长特性的方法。本发明也涉及具有改变的生长特性的转基因植物，该植物具有改变的编码2xC2H2锌指蛋白的核酸的表达。通过本发明的方法，提高了农作物植物的产量。
文档编号C07K14/415GK101928712SQ201010233880
公开日2010年12月29日 申请日期2003年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者A·I·桑斯莫里尼诺 申请人:作物培植股份有限公司