用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞的制作方法
【专利说明】用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞
[0001]相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月29日提交的美国临时专利申请系列号61/666, 719的优 先权；其完整内容在此通过引用并入。
[0003] 序列表
[0004]在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为"2006685-00340_SEQ_LIST"的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大 小为25KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0005] 背景
[0006]粘多糖贮积症II型（MPSII，亨特综合症）是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的 缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖（GAG)硫酸皮肤素和 硫酸乙酰肝素切割末端2-0-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺 陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大， 组织破坏和器官系统功能障碍。
[0007] -般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综 合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的 非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身 体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并 且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积 可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾 的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严 重的、进行性的和限制寿命的。
[0008] 酶替代疗法（ERT)是用于治疗亨特综合症（MPSII)的批准的疗法，其包括向亨特 综合症患者施用外源替代I2S酶。
[0009] 发明概沐
[0010] 本发明除其他事项外提供了用于产生重组I2S蛋白的改进的方法和组合物，所述 重组I2S蛋白允许对于亨特综合症的更有效的酶替代疗法。本发明涵盖这样的发现：可由 经工程化以共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)的哺乳动物细胞产生更具效能 的重组I2S蛋白。出乎意料的是，由这种工程化细胞产生的重组I2S蛋白具有异常高水平 的Ca-甲酰甘氨酸（FGly)转化百分比（例如，大于70%和高达100%)，从而导致重组I2S 蛋白的显著增强的酶活性。此外，已使根据本发明的共表达I2S和FGE蛋白的哺乳动物成 功地适应在大规模悬浮培养中生长。因此，本发明使得能够更高效地大规模生产高效能重 组I2S蛋白。
[0011] 因此，在一个方面，本发明提供了包含第一核酸和第二核酸的细胞，所述第一核酸 编码具有与3￡〇10勵：1具有至少约50%(例如，至少约55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸 酯酶（I2S)蛋白，所述第二核酸编码包含与SEQIDNO:5具有至少约50% (例如，至少约 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的 氨基酸序列的甲酰甘氨酸生成酶（FGE)蛋白，其中第一和/或第二核酸是外源的，并且其中 一旦在细胞培养条件（例如，悬浮或贴壁培养）下培养后，细胞产生包含至少约70% (例 如，至少约 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的对应于5￡0 1〇 NO: 1的Cys59的半胱氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白。
[0012] 在另一个方面，本发明提供了包含第一核酸和第二核酸的细胞，所述第一核酸编 码具有与SEQIDN0:1具有至少约50% (例如，至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸酯酶 (I2S)，所述第二核酸编码包含与SEQIDNO:5具有至少约50% (例如，至少约55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的同一性的氨基酸序列 的甲酰甘氨酸产生酶（FGE)蛋白，其中第一和/或第二核酸是外源性的，并且其中一旦在 细胞培养条件下培养后，细胞产生包含至少约50% (例如，至少约55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的对应于5￡〇10勵：1的 Cys59的半胱氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白，并且比生产率为大于 约 10 皮克 / 细胞 / 日（例如，大于约 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95或100皮克/细胞/日）。
[0013] 在一些实施方案中，第一核酸编码具有与SEQIDNO: 1相同的氨基酸序列的I2S 蛋白。在一些实施方案中，第二核酸编码具有与SEQIDN0:5相同的氨基酸序列的FGE蛋 白。
[0014] 在一些实施方案中，第一和/或第二核酸可操作地连接至hCMV启动子。
[0015] 在一些实施方案中，对第一和/或第二核酸进行密码子优化。在一些实施方案中， 第一核酸具有与SEQIDNO: 7具有至少约50% (例如，至少约55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)的同一性的序列。在具体实施方案中，第一 核酸具有SEQIDNO:7的序列。
[0016] 在一些实施方案中，第二核酸包含与SEQIDNO:8具有至少约50% (例如，至少 约 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% )的同一性 的序列。在一些实施方案中，第二核酸具有与SEQIDN0:8相同的序列。
[0017] 在一些实施方案中，第一和第二核酸均为外源性的（也称为重组的）。在一些实施 方案中，将第一和/或第二核酸整合（例如，稳定地）在细胞的基因组中。在一些实施方案 中，第一和/或第二核酸存在于一个或多个染色体外构建体中。
[0018] 在一些实施方案中，本发明的细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，适合的哺 乳动物细胞为人细胞。在某些实施方案中，适合的哺乳动物细胞为CH0细胞。
[0019] 在一些实施方案中，根据本发明的细胞适应于悬浮培养。在其它实施方案中，根据 本发明的细胞是贴壁的。
[0020] 在其它方面，本发明提供了通过在使得重组I2S和FGE蛋白在细胞中共表达的条 件下，培养本文中不同实施方案中描述的细胞来产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白 的方法。在一些实施方案中，大规模培养细胞。在一些实施方案中，适用于本发明的大规 模为生物反应器工艺。在一些实施方案中，适用于本发明的生物反应器为选自10U200L、 500L、1000L、1500U2000L的规模。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模（例如，生物 反应器）工艺包括灌注工艺。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模（例如，生物反应 器）工艺包括分批培养。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模工艺为滚瓶工艺。在 一些实施方案中，悬浮培养根据本发明的细胞。在其它实施方案中，贴壁培养根据本发明的 细胞。
[0021] 在一些实施方案中，在无血清培养基（例如，无动物、化学成分确定的或无蛋白质 的培养基）中培养根据本发明的细胞。在其它实施方案中，在含血清培养基中培养根据本 发明的细胞。
[0022] 在各个实施方案中，根据本发明的方法还包括纯化重组I2S蛋白的步骤。
[0023] 在另一个方面，本发明提供了由本文中各个实施方案中描述的细胞或方法产生的 重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白。
[0024] 在一些实施方案中，本发明提供了重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的制剂， 其中所述重组I2S蛋白具有与SEQIDNO:l具有至少约50% (例如，至少约55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% )的同一性的氨基酸序列； 并且包含至少约 70% (例如，至少约 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 100% )的对应于SEQIDNO: 1的Cys59的半胱氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转 化。在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有与SEQIDNO: 1相同的氨基酸序列。在一些实 施方案中，重组I2S蛋白具有至少约 20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/ mg、90U/mg或100U/mg的比活性，如使用肝素二糖作为底物通过体外硫酸醋释放活性测定 所测定的。
[0025] 除其它事项以外，本发明还提供了一种包含本文中各个实施方案中描述的重组 I2S蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，以及通过向需要治疗的受试者施用本文中 描述的重组I2S蛋白或包含所述重组I2S蛋白的药物组合物来治疗亨特综合症的方法。
[0026] 如本文中所用，除非另有明确所指，否则术语"I2S蛋白"、"I2S"、"I2S酶"或语法 等同物是指重组I2S蛋白分子的制剂。
[0027] 如本申请中所用，术语"约"和"大致"可作为等同物使用。具有或不具有约/大 致的用于本申请的任何数字旨在涵盖由相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
[0028] 本发明的其他特征、目的和优势在下面的详细描述中显而易见。然而，应当理解， 所述详细描述，虽然表示