胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白 可在来源于原核生物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于哺乳动 物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于人的宿主细胞中表达。在 一些实施方案中，所述重组表达的多肽可与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。在 一些实施方案中，重组表达的多肽对于宿主细胞可以是外来的，即对于在宿主细胞中正常 表达的肽是异源的。或者，在一些实施方案中，重组表达的多肽可以是嵌合的，因为多肽的 部分包含与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分对于宿主 细胞是外来的。
[0063] 替代酶：如本文中所用，术语"替代酶"是指可用于至少部分地替代待治疗的疾病 中的有缺陷或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语"替代酶"是指可用于至少部分 地替代待治疗的溶酶体贮积症中的有缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案 中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中积累的材料或者能够挽救或改善一种或多种溶酶体 贮积病症状。适合于本发明的替代酶包括野生型溶酶体酶或经修饰的溶酶体酶并且可使用 重组的和合成的方法来产生或从自然来源纯化而来。替代酶可以是重组的、合成的、基因活 化的或天然的酶。
[0064] 载体：如本文中所用，"载体"指能够运输与其缔合的另一核酸的核酸分子。在一 些实施例中，载体能够在宿主细胞例如真核和/或原核细胞中染色体外复制和/或表达与 其连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为"表达载体"。
[0065] 发明详沐
[0066] 本发明除其它事项以外提供了使用共表达I2S和FGE蛋白的细胞产生具有提高的 效能和活性的重组I2S蛋白的方法和组合物。在一些实施方案中，根据本发明的细胞经工 程化同时过表达重组I2S和FGE蛋白。根据本发明的细胞适应于各种细胞培养条件。在一 些实施方案中，本发明的细胞适应于大规模无血清悬浮培养。
[0067] 在以下小节中进一步详细地描述了本发明的各个方面。小节的使用并不意味着限 制本发明。每一个小节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则"或" 的使用表示"和/或"。
[0068] 艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)
[0069] 如本文中所用，I2S蛋白是可取代天然存在的艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的 至少部分活性或挽救一个或多个与I2S缺乏相关的表型或症状的任何蛋白质或蛋白质的 部分。如本文中所用，术语"I2S酶"和"I2S蛋白"以及语法等同物可互换使用。
[0070] 通常情况下，人I2S蛋白作为前体形式产生。人I2S的前体形式包含信号肽（全 长前体的氨基酸残基1-25)、原肽（全长前体的氨基酸残基26-33)和一条链（全长前体的 残基34-550)，所述链可被进一步加工成42kDa的链（全长前体的残基的34-455)和14kDa 的链（全长前体的残基446-550)。通常情况下，前体形式也称为全长前体或全长I2S蛋白， 其含有550个氨基酸。已除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列（SEQIDNO:1)和典型野生 型或天然存在的人I2S蛋白的全长前体的氨基酸序列（SEQIDN0:2)示于表1中。信号肽 加以下划线。此外，人I2S蛋白同种型a和b前体的氨基酸序列也分别提供于表1中的SEQ IDNO:3 和 4。
[0071]表1.人艾杜糖-2-硫酸酯酶
【主权项】
1. 一种细胞，其包含 第一核酸，其编码包含与SEQ ID N0:1具有至少70%的同一性的氨基酸序列的艾杜 糖-2-硫酸醋酶（12巧蛋白；和 第二核酸，其编码包含与SEQ ID NO:5具有至少70%的同一性的氨基酸序列的甲酷甘 氨酸生成酶（FG巧蛋白， 其中所述第一和/或所述第二核酸是外源性的，并且其中一旦在细胞培养条件下培 养后，所述细胞产生包含至少约70 %的对应于SEQ ID NO: 1的切巧9的半脱氨酸残基至 Ca -甲酷甘氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白。
2. -种细胞，其包含 第一核酸，其编码包含与SEQ ID N0:1具有至少70%的同一性的氨基酸序列的艾杜 糖-2-硫酸醋酶（12巧蛋白；和 第二核酸，其编码包含与SEQ ID N0:5具有至少70%的同一性的氨基酸序列的甲酷甘 氨酸生成酶（FG巧蛋白， 其中所述第一和/或所述第二核酸是外源性的，并且其中一旦在细胞培养条件下培 养后，所述细胞产生包含至少约60 %的对应于SEQ ID NO: 1的切巧9的半脱氨酸残基至 C曰-甲酷甘氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白并且比生产率为大于约30皮克/细胞/日。
3. 根据权利要求1或2所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产 生包含至少约80%的对应于SEQ ID NO: 1的切巧9的半脱氨酸残基至Ca-甲酷甘氨酸 (FGly)的转化的I2S蛋白。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述 细胞产生包含至少约90%的对应于SEQ ID NO: 1的切巧9的半脱氨酸残基至Ca -甲酷甘 氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述 细胞产生包含至少约95%的对应于SEQ ID NO: 1的切巧9的半脱氨酸残基至Ca -甲酷甘 氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述 细胞产生包含至少约97%的对应于SEQ ID NO: 1的切巧9的半脱氨酸残基至Ca -甲酷甘 氨酸（FGly)的转化的I2S蛋白。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和/或所述第二核酸可操作 地连接至hCMV启动子。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一核酸编码具有与SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列的I2S蛋白。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第二核酸编码具有与SEQ ID NO: 5相同的氨基酸序列的FGE蛋白。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一核酸包含与SEQ ID N0:7具 有至少70%的同一性的序列。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一核酸包含SEQ ID N0:7的序 列。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第二核酸包含与SEQ ID N0:8具 有至少70%的同一性的序列。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第二核酸包含与SEQ ID NO:8相 同的序列。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和第二核酸均为外源性的。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和/或第二核酸被整合在 所述细胞的基因组中。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和/或第二核酸存在于一 个或多个染色体外构建体中。
17. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
18. 根据权利要求17所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
19. 根据权利要求17所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
20. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞适应于悬浮培养。
21. -种产生重组艾杜糖-2-硫酸醋酶（12巧蛋白的方法，其包括在使所述重组I2S和 F(iE蛋白在前述权利要求中任一项所述的细胞中共表达的条件下培养所述细胞。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中大规模培养所述细胞。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述大规模是生物反应器工艺。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述生物反应器工艺是灌注工艺。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述生物反应器为选自10L、2(K)L、500L、 1000L、1500L 或 2000L 的规模。
26. 根据权利要求22所述的方法，其中所述大规模是滚瓶工艺。
27. 根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中在无血清培养基中培养所述细胞。
28. 根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中在含血清培养基中培养所述细胞。
29. 根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中悬浮培养所述细胞。
30. 根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中贴壁培养所述细胞。
31. 根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述重组I2S 蛋白的步骤。
32. -种重组艾杜糖-2-硫酸醋酶（12巧蛋白，其通过根据权利要求21-31中任一项所 述的方法产生。
33. -种重组艾杜糖-2-硫酸醋酶（12巧蛋白，其由根据权利要求1-20中任一项所述 的细胞产生。
【专利摘要】本发明除其它事项以外提供了使用共表达I2S和FGE蛋白的细胞产生具有改善的效能和活性的重组I2S蛋白的方法和组合物。在一些实施方案中，将根据本发明的细胞工程化以同时过表达重组I2S和FGE蛋白。根据本发明的细胞适应于各种细胞培养条件。在一些实施方案中，本发明的细胞适应于大规模悬浮无血清培养。
【IPC分类】A61K38-46, C12P21-06, C07K1-00
【公开号】CN104540517
【申请号】CN201380037937
【发明人】F·博尔戈, M·哈特莱因
【申请人】夏尔人类遗传性治疗公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年6月28日
【公告号】CA2877521A1, EP2874649A2, US20140004593, WO2014005019A2, WO2014005019A3