专利名称：β天花粉蛋白的快速纯化及其结晶技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到β天花粉蛋白的快速纯化及其结晶技术。
背景技术：
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物括楼(Trichosantheskirilowii)的块根——中药天花粉原生材料中分离纯化得到的一种碱性蛋白质。天花粉蛋白的化学本质是一种分子量为27kDa的不含糖的单链多肽、属于1型核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，具有RNA N-糖苷酶活性以及多种酶学和药理活性(潘克桢等人.，Structure-FunctionRelationship of Trichosanthin，Pure and Appl.Chem.66，57-64，1994；Shaw PC，et al，Resent advances in trichosanthin，Toxicon，45，683-689，2005)。1989年，McGrath等人发现天花粉蛋白能抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)在急性感染的T淋巴细胞和慢性感染的巨噬细胞中复制(McGrath et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，862844-2848，1989)，不久，美国FDA批准天花粉蛋白进行临床试验。天花粉蛋白的引产活性，抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒活性引起了广泛的重视。
中国科学家首先分离纯化并结晶了天花粉蛋白(王亚辉等人，天花粉蛋白的纯化及其性质的初步研究，动物学报，22，117-143，1976；金善炜等人，天花粉蛋白的化学I结晶天花粉蛋白的制备及其物理化学性质，化学学报，39，917-925，1981；中国科学院福建物质结构研究所等，天花粉蛋白的晶体培养及其晶胞基本参数，科学通报，176-178，1977；王家槐等人，一种新晶型天花粉蛋白晶体，科学通报，943-944，1985)，而国外，Maraganore等人1987年才首次报道分离到天花粉蛋白(Maraganore etal.J.Biol.Chem.262，116280，1987)。同时，从天花粉块根种陆续报道分离出括楼蛋白(金善炜等人，化学快报15 160-168 1997)，TAP29(Lee-Huang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 6570-6574 1991)和αβγ-Trichosanthin(Narayanna etal.，Plant Science 162 79-85 2002)。这些工作表明，这些蛋白都属于1型核糖体失活蛋白，具有RNA-N糖苷酶活性，以及抗肿瘤、抗病毒，特别是抗艾滋病毒活性。
现有技术是按照金善炜的方法，用丙酮分级沉淀的方法，经冷冻干燥制备精制天花粉蛋白，精制天花粉蛋白在巴比妥缓冲液中，以NaNO3为沉淀剂长出单斜晶体(C2空间群，a＝75.60埃，b＝75.44埃，c＝88.36埃，β＝99.50°；及P21空间群，a＝73.4埃，b＝74.7埃，c＝87.9埃，β＝97.7°)；在柠檬酸缓冲液中，以KCl为沉淀剂，长出正交晶体(P212121空间群，a＝38.305埃，b＝76.225埃，c＝79.213埃)。上海金山制药厂生产的天花粉蛋白注射液商品，就是结晶天花粉蛋白溶液。
金善炜等人从压榨去汁的天花粉块根中，经生理盐水抽提、硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥后，经Sephadex G-75分离，再经阳离子交换剂梯度洗脱获得括楼蛋白(trichobitacin)，质谱(ES-MS)测定的分子量为27228，氨基酸组成和部分顺序与天花粉蛋白相似。Narayanan等人从天花粉块根中，经PBS抽提，冷冻干燥后，经阳离子交换剂梯度洗脱获得天花粉蛋白粗品(冻干粉)，然后再上Mono-S柱少量分离出α β γ天花粉蛋白，β天花粉蛋白在分子量(26kDa)，氨基酸组成和部分顺序与天花粉蛋白相似。Lee-Huang等人从天花粉块根中经PBS抽提，透析，阳离子交换剂梯度洗脱后，透析并浓缩后经Sephadex G-75分离获得TAP29，它在分子量(29kDa)和部分氨基酸顺序上与天花粉蛋白有差异。
发明内容
本发明的目的是基于上述现有技术基础，从天花粉蛋白注射液和天花粉蛋白晶体中经高分辨率的阳离子交换柱层析分离出2个等位蛋白，根据含量的多少和习惯，分别命名为α天花粉蛋白和β天花粉蛋白，根据β天花粉蛋白在离子交换柱上的层析行为，本发明同时提供从天花粉原生材料制备β天花粉蛋白的方法及其晶体生长技术。该蛋白在柠檬酸缓冲液中以2M KCl为沉淀剂结晶条件下，生长成正交晶体，经X-射线衍射和用同步辐射数据分析，该晶体属于P212121空间群，晶胞参数为a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。与原来的天花粉蛋白的正交晶体晶胞参数不同。
上海金山制药厂生产的天花粉蛋白注射液，在SDS-PAGE中表现为一条带，分子量为27kDa，在FPLC上，用MonoS HR5/5柱(购自Pharmacia公司)分析，当条件设置为A液为10mM磷酸盐缓冲液pH7.5，B液为A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加样，A液洗柱5ml，0-50％B液线性梯度洗脱10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。天花粉蛋白在洗脱液达8.67ml即NaCl浓度为0.183M时出峰(见图1)。
但我们注意到，在该峰之前有一个约为8.5ml的肩峰。于是我们降缓洗脱梯度，其他条件不变，仅将洗脱梯度设置为0-10％B液线性梯度洗脱10ml，先前条件的肩峰就在11.29ml处出峰，主要的成分在12.07ml处出峰。11.29ml峰就是β天花粉蛋白，12.07ml峰就是α天花粉蛋白，两者峰面积比为1∶4.5(见图2)。
用丙酮分级沉淀后经冷冻干燥得到的精制天花粉蛋白，在0.75M柠檬酸缓冲液中，以2M KCl为沉淀剂，长成天花粉蛋白晶体，将该蛋白晶体洗净后，捣碎，溶解，离心后上样Mono-S柱，条件设置为A液为10mM磷酸盐缓冲液pH7.5，B液为A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加样，A液洗柱5ml，0-10％B液线性梯度洗脱10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。(同上述一样，但由于配置的A液，B液浓度略有差别，故出峰时间稍有变化)，在10.91ml和11.84ml时出峰，10.91ml峰就是β天花粉蛋白，11.84ml峰就是α天花粉蛋白，两者峰面积比为1∶7.6(见图3)。
基于上述2项工作，本发明还提供了从天花粉原生材料制备β天花粉蛋白的技术，本发明的技术方案是天花粉原生材料去皮洗净，切碎，加5mM，pH4.5醋酸缓冲液，抽提，匀浆，加50％冰醋酸调pH4.0，然后在4℃条件下，16000×g离心30min，上清液加样到20mM，pH4.5醋酸缓冲液平衡的强阳离子交换树脂(S-Sepharose Fast Flow或SP-Sepharose Fast Flow)的柱上，柱长要求在20cm以上，280nm实时检测，用20mM，pH4.5醋酸缓冲液洗至基线，再用20mM，pH6.5磷酸缓冲液洗至基线，然后用15-20倍柱床体积缓冲液缓梯度洗脱，一般会出3个峰(见图4)。收集第2峰，用50％冰醋酸调pH4.0，加两倍体积的醋酸缓冲液，再用阳离子交换树脂进行梯度洗脱，主要的峰就是β天花粉蛋白(见图5)。
本发明所分离纯化的β天花粉蛋白，在SDS-PAGE上呈现一条带，分子量为27kDa，在强阳离子预装柱Mono-S柱(购自Pharmacia公司)表现为一个峰(见图6)，在凝胶过滤预装柱Superdex-75(购自Pharmacia公司)上表现为一个峰(见图7)。经质谱(ES-MS)分析，β天花粉蛋白分子量为27163.0和27102.0。相同条件下测得α天花粉蛋白的分子量为27173.0和27103.0，可以认为二者的分子量是相同的。
本发明所制备的β天花粉蛋白采用悬滴法技术，母液浓度为20mg/ml，在0.075M，pH 5.4柠檬酸缓冲液中，以2M KCl为沉淀剂，就可以长出β天花粉蛋白正交晶体。经X-射线衍射分析或同步辐射衍射分析，晶体属于P212121空间群，其晶胞参数为a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃，与以前报道的结晶天花粉的晶型(晶胞参数)皆不同(P212121空间群，a＝38.305埃，b＝76.225埃，c＝79.213埃；C2空间群，a＝75.60埃，b＝75.44埃，c＝88.36埃，β＝99.50°；及P21空间群，a＝73.4埃，b＝74.7埃，c＝87.9埃，β＝97.7°)。我们已收集到一套1.6埃的数据。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果1.本发明证实天花粉蛋白注射液和天花粉蛋白晶体中含有两个等位蛋白α天花粉蛋白和β天花粉蛋白，他们在分子量、氨基酸组成和顺序上均相同，都具有N-糖苷酶活性和抗HIV活性，仅在高灵敏度、高分辨率层析技术上出峰时间稍有差异，生成的蛋白质晶体的晶胞参数不同。
2.本发明采用2步阳离子交换树脂洗脱技术，不经丙酮或硫酸铵分级沉淀及透析，冷冻干燥等步骤，避免了许多引起蛋白变性的繁琐操作，可以从天花粉蛋白原生材料中快速分离出β天花粉蛋白。
3.本发明优选用于分离纯化的缓冲液浓度、pH值，洗脱梯度，提高了分离效果。
4.本发明所得出的β天花粉蛋白，在柠檬酸缓冲液中以2M KCl为沉淀剂可以培养出β天花粉蛋白晶体，晶体属于P212121空间群，其晶胞参数为a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。为该蛋白的结构和功能研究提供了重要的结构数据。
现在对附图作简要说明图1.天花粉蛋白注射液在Mono-S HR5/5柱上洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，天花粉蛋白在洗脱液达8.76ml处即在0.188 M NaCl(pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液)时出峰，图中折线为盐浓度，满标为1MNaCl。
图2.天花粉蛋白注射液在Mono-S HR5/5柱上洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，β天花粉蛋白在洗脱液达11.29ml处即在0.629 MNaCl(pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液)时出峰，α天花粉蛋白在12.07ml处出峰，图中折线为盐浓度，满标为1M NaCl。
图3.天花粉蛋白晶体在Mono-S HR5/5柱上洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，β天花粉蛋白在洗脱液达10.91ml处即在0.591MNaCl(pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液)时出峰，α天花粉蛋白在11.84ml处出峰，图中折线为盐浓度，满标为1M NaCl。
图4.β天花粉蛋白在S-Sepharose Fast Flow柱上洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为AU，即A280检测值，图中虚线为在20mM，pH6.5磷酸缓冲液条件下，NaCl浓度的线性梯度线，β天花粉蛋白约在0.1M NaCl处出峰，α天花粉蛋白约在0.15M NaCl处出峰。
图5.β天花粉蛋白在S-Sepharose Fast Flow柱上再洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为AU，即A280检测值，图中虚线为在10mM，pH7.5磷酸缓冲液条件下，NaCl浓度的线性梯度线，β天花粉蛋白约在0.175M NaCl处出峰。
图6.β天花粉蛋白在Mono-S HR5/5柱上洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，β天花粉蛋白在洗脱液达10.91ml处即在0.0591M NaCl(pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液)时出峰，α天花粉蛋白在11.89ml处出峰。图中折线为盐浓度，满标为1M NaCl。
图7.天花粉蛋白在Supedex-75柱上洗脱图。横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，β天花粉蛋白在洗脱液达13.34ml处出峰。
具体实施例方式
下面结合附图，通过实施例来进一步描述本发明。
实施例1快速分离纯化β天花粉蛋白取去皮洗净的天花粉，加100ml pH4.5，10mM醋酸缓冲液浸泡，在匀浆机上匀浆二次，然后用50％的冰醋酸调pH4.0，再在4℃条件下16000×g，离心30’，收集上清液，上清液加样到1.6×23cm的Sp-Sepharose Fast Flow柱上(该柱已用pH 4.5，20mM醋酸缓冲液平衡)，继续用pH 4.5，20mM醋酸缓冲液洗出一个杂峰后，用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液继续洗柱，又会洗出一个杂峰，然后用0-0.3M NaCl(在pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液中)梯度洗脱，收集第2峰(见图4)。
合并第2峰，加50％冰醋酸调pH4，再加2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，上样到已用相同醋酸缓冲液平衡的Sp-Sepharose Fact Flow柱上，继续用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗柱，再用pH7.5，10mM磷酸缓冲液洗柱，然后用0-0.4M NaCl(在pH7.5，10mM磷酸缓冲液中)梯度洗脱，收集主要的峰，该峰就是β天花粉蛋白(见图5)。
实施例2强阳离子预装柱Mono-S分析本发明制备的β天花粉蛋白在Mono-S HR5/5柱上洗脱图(见图6)A液为10mM磷酸盐缓冲液pH7.5，B液为A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加样，A液洗柱5ml，0-10％B液线性梯度洗脱10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。β天花粉蛋白在洗脱液达10.91ml即NaCl浓度为0.0591M时出一单峰。
实施例3凝胶过滤预装柱Superdex-75分析图7是本发明制备的β天花粉蛋白在Superdex-75柱上洗脱图，洗脱缓冲液为0.1M NH4HCO3，pH8，流速0.4ml/min，β天花粉蛋白在洗脱液达13.34ml时出一单峰。
实施例4β天花粉蛋白的晶体生长本发明制备的β天花粉蛋白作为母液，蛋白浓度20mg/ml，池液用0.075M，pH 5.4柠檬酸缓冲液，2M KCl为沉淀剂，用悬滴法培养蛋白质晶体，2天后可见晶体，1周左右晶体长大，经X-射线衍射分析或同步辐射衍射分析，晶体属于P212121空间群，其晶饱参数为a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。
权利要求
1.一种β天花粉蛋白的快速纯化技术，将天花粉原生材料去皮洗净，切碎，加5mM，pH4.5醋酸缓冲液抽提，匀浆，加50％冰醋酸调pH4.0，然后在4℃条件下，16000×g离心30min，上清液加样到20mM，pH4.5醋酸缓冲液平衡的强阳离子交换树脂的柱上，柱长要求在20cm以上，280nm实时检测，用20mM，pH4.5醋酸缓冲液洗至基线，再用20mM，pH6.5磷酸缓冲液洗至基线，然后用15-20倍柱床体积缓冲液缓梯度洗脱，一般会出3个峰；收集第2峰，用50％冰醋酸调pH4.0，加两倍体积的醋酸缓冲液，再用阳离子交换树脂进行梯度洗脱，即可获得β天花粉蛋白，其特征在于在缓冲液抽提后，经过2步强阳离子交换柱梯度洗脱，就可以得到β天花粉蛋白。
2.一种权利要求1的β天花粉蛋白的晶体生长，其特征在于β天花粉蛋白，在柠檬酸缓冲液中，以2M KCl为沉淀剂时，长成β天花粉蛋白的正交晶体，晶体属于P212121空间群，其晶胞参数为a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。
全文摘要
本发明涉及β天花粉蛋白快速纯化及其结晶技术。天花粉原生材料去皮洗净，切碎，加缓冲液抽提，经阳离子交换树脂2次梯度洗脱，就可以获得β天花粉蛋白。β天花粉蛋白在柠檬酸缓冲液中以2M KCl为沉淀剂，可以长成β天花粉蛋白的正交晶体，晶体属于P文档编号C07K14/415GK101081862SQ200610084960
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者陈明晃 申请人:中国科学院福建物质结构研究所