专利名称：来源于八棱丝瓜的核糖体失活蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的核糖体失活蛋白及其制备和应用。
在本文中，核糖体失活蛋白可被定义为至少具有下列活性之一的蛋白质RNA-N糖苷酶活性，引产蛋白活性，抗病毒特别是抗HIV的活性。该蛋白是寡聚的单肽链的简单蛋白或糖蛋白。
来源于高等植物的核糖体失活蛋白基于它们的分子结构主要分为两类，类型I蛋白仅有单肽链和致核糖体失活活性，该蛋白典型的例子是来自葫芦科的天花粉蛋白(Trichosanthin简称TCS)，苦瓜子蛋白(Momorcharin简称MOM)，丝瓜子蛋白(Luffin)，来自石竹科的肥皂草素(Saporin)。类型II蛋白具有二条肽链，A链具致核糖体失活活性，B链具凝集素类活性。该类蛋白的典型代表是蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白。虽然两种类型蛋白所含肽链数不同，但它们都通过裂解核糖体内28S rRNA的4324位腺嘌呤的N-糖苷键，而使真核生物细胞核糖体60S亚基失活(Endo and Tsurugi 1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F.et al.1988，Nucl.Acid Res.161349-1357)。
已经从葫芦科，石竹科，商陆科，大戟科植物的不同组织分离到许多种核糖体失活蛋白。从葫芦科植物的瓜蒌块根中分离出天花粉蛋白和TAP29，从瓜蒌种子中分离出Trichokilin，从苦瓜子种子中分离出α-Momorcharin和β-Momorcharin(简称α，β-MOM)，从丝瓜(Luffa cylindrica)中分离出Luffin-a，b。目前Trichosanthin，α，β-Momorcharin和Luffin-a，b已经测定了完整的氨基酸顺序。
H.W.Yeung et al也曾从八棱丝瓜中分离出一种Luffaculin(H.W.Yeunget al.Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，15-19)，但他们所获得的八棱瓜蛋白产率低(120mg/Kg种子)活性低(只相当于Luffin的1/9)。
本发明的目的在于寻找一种产率更高，而且纯度更高的新的核糖体失活蛋白。
本发明从八棱丝瓜种子中分离出2种核糖体失活蛋白，SDS-PAGE显示它们的分子量为28KD，等电点PI＞9。蛙卵活性测试(熊用周等，中国科学B辑，587-594，1992)表明它们具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成活性。其中一种Luffaculin 1的N端5个氨基酸顺序已被测定为Asp-Val-Ser-Phe-Ser-，并比较了它与同属的Luffa cylindrica种子中分离的Luffin-a，b的头几个氨基酸顺序以及TCS、α，β-MOM的头几个氨基酸顺序皆有不同，见附录。
本发明采用简化、温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、硫酸铵沉淀、CM-纤维素梯度洗脱、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素再次梯度洗脱。本发明的方法比现在技术采用脱壳、有机试剂脱脂更简化、更温和。同时在第一次CM-纤维素梯度洗脱后增加了DEAE-纤维素过滤和CM-纤维素再次层析，获得了高产率、高纯度和高活性的蛋白。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作引产药物并用于治疗滋养层细胞有关的肿瘤、恶性肿瘤疾病，如绒癌等，也可以作为天花粉蛋白的替代药物，用于克服反复使用产生的免疫反应。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作抗病毒，特别是抗HIV的试剂，也可作为天花粉蛋白治疗艾滋病的替代药物，用于克服反复使用产生的免疫反应。
本发明的核糖体失活蛋白可以作为N-糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果(1).可以利用来源丰富的八棱丝瓜种子，采用温和的提取方法，收率高(可达500mg/Kg种子)，而且对细胞体内蛋白质合成活性比Heung获得的蛋白高出8-9倍(蛙卵活性测试)。
(2).已经检测了八棱瓜蛋白1的N端5个氨基酸顺序为DVSFS，与现有已知的核糖体失活蛋白的N端顺序均不同，因此可以作为这类引产、抗病毒蛋白的替代品以克服核糖体失活蛋白(如TCS)反复使用产生的免疫反应。
现在对附图作图面说明
图1.显示对Luffaculin 1和2进行纯化的阳离子交换色谱。
图2.显示对Luffaculin 1进行再纯化的阳离子交换色谱。
图3.显示对Luffaculin 1进行纯度鉴定的毛细管色谱。
图4.显示图1的Luffaculin 1和2的SDS-PAGE图。
图5.显示图2的Luffaculin 1的SDS-PAGE图。
下面结合附图通过实施例来进一步描述本发明实施例1.从八棱瓜种子中纯化Luffaculins取200g的八棱瓜种子(购自福建漳州菜籽店)，经粉碎机粉碎后加500ml的0.2MNaCl溶液，置4℃浸泡，匀浆二次，用几层纱布过滤或离心得滤液700ml，加1N HCl调pH3.8静置2h，用滤纸过滤或离心得滤液600ml，加固体硫酸铵至40％饱和度，过滤去掉残渣，上清液续加固体硫酸铵至95％饱和度，静置后离心得硫酸铵沉淀，加10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2 100ml溶解。装入透析袋，然后对5mM磷酸钠缓冲液pH6.5溶液透析24h，其间三次换透析外液。透析后粗提液离心(10,000rpm 15’，4℃)后上CM-纤维素-52柱(Backman产品)(28×2.6cm)(预先用5mM磷酸钠缓冲液pH6.5平衡好)经洗脱2个床体积平衡液后，用0～0.3MNaCl 5mM磷酸钠缓冲液pH6.5作梯度洗脱，洗脱液通过实时测量于280nM吸收率而检验蛋白，见图1。组分73-77即为Luffaculin 1，组分86、87即为Luffaculin 2。SDS-PAGE见附图4，合并组分73-77，装入透析袋，对10mM磷酸钠缓冲液pH7.2透析，透析液加入DEAE-纤维素-52(Backman产品)(预先用10mM磷酸钠缓冲液pH7.2平衡)搅拌后过滤，滤液上CM-纤维素-52(Backman产品)(11×1.6cm)(预先用10mM磷酸钠缓冲液pH7.2平衡)，然后用0～0.5MNaCl于10mM磷酸钠缓冲液pH7.2梯度洗脱，洗脱液通过实时测量于280nM吸收率而检验蛋白，见附图2，组分103和104即为纯化的Luffaculin 1，见附图5。实施例2.Luffaculin 1纯度分折经二次CM-纤维素-52纯化的Luffaculin 1用PF公司的ABI173 MicroBlotte Capillary HPLC System PE-173毛细管色谱仪C18柱，洗脱液A液(0.1％三氟乙酸)，B液(100％乙腈+0.086％三氟乙酸)以15％B-65％B作为梯度洗脱(140分钟)并于210nM检测蛋白，在保留时间84分钟处获得单一蛋白峰，见附图3。毛细管色谱分析表明本发明的提取方法获得的蛋白纯度高，同时还可以从实施例3中可以看出，经二次CM-纤维素-52分离纯化的Luffaculin 1已达N端一致。实施例3.Luffaculin 1N端氨基酸顺序分析经二次CM-纤维素-52纯化的Luffaculin 1用PE公司的AppliedBiosysterns 476A Protein Sequencer分析N端氨基酸顺序，结果如下Asp-Val-Ser-Phe-Ser-实施例4.
本发明的八棱瓜蛋白1和2经蛙卵活性测试表明其活性比Heung获得的蛋白高出8-9倍。该项测试表明本发明的Luffaculin 1和2可以作为TCS、Luffin类高效的引产蛋白和抗病毒蛋白及其替代物。
附录八棱瓜蛋白1与Luffin-a.b、TCS、α，β-MOM，N端氨基酸顺序比较Luffaculin 1DVSFSLuffin-aDVRFSLSGSSLuffin-bANVSFSLSGADTCS DVSFRLSGATα-MOM DVSFRLSGATβ-MOM DVNFDLSTAT
权利要求
1.一种来源于八棱丝瓜的核糖体失活蛋白——八棱瓜蛋白1(Luffaculin 1)，其特征在于N端氨基酸顺序为Asp-Val-Ser-Phe-Ser-，分子量(SDS-PAGE检测)为28KD。
2.根据权利要求1所述的八棱瓜蛋白1，其特征在于，它具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成活性。
3.一种来源于八棱丝瓜的核糖体失活蛋白——八棱瓜蛋白2(Luffaculin 2)，其特征在于，它的分子量(SDS-PAGE检测)为28KD。
4.根据权利要求3所述的八棱瓜蛋白2，其特征在于，它具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成活性。
5.一种来源于八棱丝瓜的核糖体失活蛋白的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、硫酸铵沉淀、CM-纤维素梯度层析、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素二次层析，其特征在于通过DEAE-纤维素过滤和CM-纤维素二次层析。
6.一种来源于八棱丝瓜的核糖体失活蛋白——八棱瓜蛋白，其特征在于，它能作为引产蛋白用于引产，治疗相关肿瘤病、癌症和病毒性感染疾病，特别是艾滋病毒感染。
全文摘要
从葫芦科植物八棱丝瓜种子中分离出2种核糖体失活蛋白—八棱瓜蛋白1和2,其分子量都是28KD(SDS－PAGE检测)。八棱瓜蛋白1的N端5个氨基酸残基为DVSFS。采用了简化的温和的提取方法,获得了高产率,高纯度,高活性的蛋白。该蛋白具有作为引产药物和抗病毒制剂的商业应用,并可作为N－糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究。
文档编号C07K7/06GK1199738SQ9711260
公开日1998年11月25日 申请日期1997年5月16日 优先权日1997年5月16日
发明者陈明晃, 林玉娟, 叶晓明 申请人:中国科学院福建物质结构研究所