专利名称：核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物纳米前药的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及纳米高分子前药领域，尤其涉及核苷磷
酰化偶联壳聚糖衍生物纳米前药的制备方法和应用。
背景技术：
前体药物(prodrug)，也称前药或药物前体，是指经过生物体内转化后才具有药理 作用的化合物。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物 质，可增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用。 前体药物分为载体前体药物和生物前体药物，其中高分子载体前体药物是将药物
分子通过化学键连接在高分子链上，利用对载体高分子材料和偶联化学键的选择和控制，
可实现药物在体内的控制释放，以增强药物的有效利用率、降低药物的毒副作用、减少给药
频率。为了实现对目标组织或器官的靶向，往往需要在高分子链上偶联相应的靶向基团。 核苷类似物作为抗肿瘤和抗病毒药物，往往存在较大的毒副作用，如齐多夫定
(叠氮胸苷，AZT)，司他夫定(2'，3'-二脱氢-3'-脱氧胸苷，d4T)和拉米夫定(Lamivudine，
3TC)等，为合成胸腺嘧啶核苷的类似物，能阻断前病毒DNA合成，抑制HIV等病毒的复制，但
存在骨髓抑制、全血细胞减少而致继发感染加重、易产生耐药性等副作用。 为提高核苷药物的利用率和疗效以及降低毒副作用，国内外研究者采用了多种改
进方法。天然高分子壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，且具有黏膜粘附性和
透皮促进作用等多种生物活性，是一种多糖类药用高分子载体，可与药物分子偶联，得到高
分子载体药物，降低药物的毒副作用。中国专利200710029738. 0给出一种核苷磷酰化偶联
壳聚糖衍生物及其制备方法与应用，将具有抗肿瘤和抗病毒的核苷类药物与可作为载体的
壳聚糖偶联起来，从而优化了核苷类药物的体内运输系统。 纳米给药系统是粒径10 500nm之间的固状胶态粒子，包括纳米粒子和纳米胶 囊，药物等活性组分通过溶解、包裹作用位于粒子内部，或者通过吸附、附着作用位于粒子 表面，具有提高药物的稳定性，实现药物控释及被动靶向输送等优点。 采用共价交联法、去溶剂法和离子交联法等方法制备壳聚糖纳米粒子，负载药物 及生物活性物质，如多肽、蛋白质和基因等，可实现其靶向输运和控制释放，但往往会发生 药物的爆释。 此外，纳米高分子药物微粒的制备受到多种因素的影B向，包括制备方法、工艺条 件、高分子和药物性质等，这些因素的选择优化将影响最终纳米药物微粒的靶向性以及释 放性能。 目前尚未见有将核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物制备成纳米粒子的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物的纳米前药粒子的
制备方法，从而实现核苷类药物的靶向性、可控性释放。
3
本发明的另一个目的是提供上述方法制备所得核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物纳
米前药在制备抗肿瘤药物、抗艾滋病药物或抗病毒药物中的应用。 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的 本发明根据核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物的特点，经过试验研究以及参数优化，
给出一种核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物纳米前药粒子的制备方法，该方法包括如下步骤 (1)将核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物溶解于稀酸中； (2)将聚阴离子物质完全溶解于去离子水中，配成聚阴离子溶液； (3)将步骤(1)制备所得溶液缓慢加入步骤(2)制备的聚阴离子溶液中，室温搅
拌； (4)将步骤(3)得到的溶液经离心、洗涤、冷冻干燥后，得到核苷磷酰化偶联壳聚 糖纳米前药粒子。 上述步骤(1)中，核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物已经在中国专利200710029738. 0
中给出相关描述及制备方法，该核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物的结构式如式(I)所示。
<formula>formula see original document page 4</formula>
C I ) 其中 !^为司他夫定(2'，3'-二脱氢-3'-脱氧胸苷，d4T)、齐多夫定(叠氮胸苷，AZT)、 拉米夫定(3TC)、双脱氧胞苷(DDC)、双脱氧肌苷(ddl)、氟代胸腺嘧啶核苷(FLT)、依曲西他 平(FTC)或克拉夫定(CLV); R2为异丙基、乙基、正辛烷基、或环己烷基； 式(I)中，5'-磷酸化核苷药物分子以磷酰键方式偶联在壳聚糖大分子上。
上述步骤(1)中，稀酸主要是起助溶的作用，所述稀酸为稀甲酸、稀乙酸、稀盐酸、 稀硝酸、稀磷酸或稀柠檬酸中的任意一种或一种以上的混合。 上述步骤(1)中，核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物溶解于稀酸后，制备所得核苷磷 酰化偶联壳聚糖衍生物酸液的浓度为0. 01% 1%，该浓度为核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生 物占核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物酸液总质量的百分比浓度。 上述步骤(2)中，聚阴离子物质选择无毒，可生物降解的，如三聚磷酸盐、海藻酸 盐、透明质酸盐，或酸性壳聚糖衍生物；所述酸性壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖或壳聚糖硫 酸酯。离子溶液中，聚阴离子的浓度与步骤(1)中核苷磷酰 化偶联壳聚糖衍生物酸液的浓度相同，其浓度范围为0. 01 % 1 % 。 上述步骤(3)中，步骤(1)制备的核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物酸液与步骤(2)
制备的聚阴离子溶液的体积比为2 : 1 3 : 1。 上述步骤(3)中，室温搅拌后，整个体系pH优选4 6 。 上述步骤(4)中，将步骤(3)所得溶液进行离心，该离心处理中离心速度要求尽量 高，优选20000rpm。 上述步骤(4)中，洗涤时优选先用浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钠乙醇水溶 液，或者浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钾乙醇水溶液，然后再用去离子水洗涤；所述浓 度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钠乙醇水溶液或浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钾乙醇 水溶液，是指以氢氧化钠或氢氧化钾为溶质，乙醇水混合液为溶剂的溶液，溶液中溶质的浓 度为O. 05 0. 5mol/L;所述乙醇水混合液中，乙醇与水的体积比为80 : 20 99 : 1。
上述步骤(4)中，冷冻干燥时的温度尽量低，可控制在-80°C 。
采用上述方法可将各种抗病毒、抗肿瘤的核苷类药物，在磷酰化偶联壳聚糖后，制 备成纳米前药颗粒，以壳聚糖作为载体，同时结合纳米粒子的靶向性及可控性，将核苷类药 物输送到体内，从而实现核苷类药物在体内的控制释放，且降低了核苷类药物的毒副作用， 减少了给药频率。因此本发明的方法可用于制备抗肿瘤、抗艾滋病或抗病毒的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 1.本发明人根据核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物的特点，对其制备方法、工艺条件、 高分子和药物性质等因素进行考虑，通过试验摸索和优化，得到本发明的制备方法，可将核 苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物制备成纳米前药，且制备条件温和，工艺简单，绿色环保；
2.采用本发明的方法制备核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物纳米前药，可实现核苷磷 酸酯的控制释放，避免发生核苷药物的爆释，并且靶向到达特定的目标器官或组织，从而可 以改进核苷药物的生物利用度及药代动力学，降低毒副作用，提高抗病毒及抗肿瘤效果，可 应用在抗艾滋病、抗肿瘤和抗病毒药物制剂中。
图1为实施例1制备所得d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药的透射电 镜图； 图2为实施例1制备所得d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药在pH = 1. 1缓冲溶液中的药物体外释放曲线图；
其中，1为d4T磷酸异丙酯，2为d4T ; 图3为实施例1制备所得d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药在pH = 7. 4缓冲溶液中的药物体外释放曲线图；
其中，l为d4T磷酸异丙酯。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。
实施例1 d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药的制备 本实施例以d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物为原料，制备其纳米前药粒子，
具体制备步骤如下所示 (1)称取0. 03克d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物(d4T质量分数为17% )溶 于60毫升2 %的乙酸溶液中，配制浓度为0. 05 %的溶液； (2)称取0. 01克三聚磷酸钠溶解于20毫升去离子水中，配成浓度为0. 05%的溶 液； (3)常温下磁力搅拌下，将步骤(1)制备的溶液以lmL/min的速度加入至步骤(2) 制备的溶液中，保持并控制pH为4 6之间直至反应结束；步骤(1)制备的溶液与步骤(2) 制备的溶液的体积比为3 : 1 ; (4)经20000rpm离心30min，沉淀先用0. lmol/L的NaOH乙醇水溶液(乙醇与水 的体积比为80 : 20)，然后去离子水清洗，于-S(TC下预冷冻，冷冻干燥24h后得到d4T磷 酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米微粒，其直径分布于100 200nm之间，如图1所示。
采用HPLC技术对本实施例制备的d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药 进行体外药物释放试验，如下所示 1. 37t:下纳米前药微粒在pH = 1. 1缓冲溶液中的药物体外释放，如图2所示，表 现出缓慢的释放行为，6小时内只有不超过3%的核苷药物释放； 2. 37t:下纳米前药微粒在pH = 7. 4缓冲溶液中的药物体外释放，如图3所示，表 现出缓慢的释放行为，24小时内只有不超过3%的核苷药物释放； 上述核苷药物释放主要都是以d4T磷酸酯形式，表明核苷纳米前药微粒进入体内
后，只有在靶向输送到目标组织或器官后才释放核苷药物。 实施例2AZT磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药的制备 本实施例以AZT磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物为原料，制备其纳米前药粒子，
具体制备步骤如下所示 (1)称取0. 03克AZT磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物(AZT质量分数为12% )溶 于30毫升2 %的乙酸溶液中，配制浓度为0. 1 %的溶液； (2)称取0. 01克海藻酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0. 1%的溶液；
(3)常温下磁力搅拌下，将步骤(1)制备的溶液以lmL/min的速度加入至步骤(2) 制备的溶液中，保持并控制pH为4 6之间直至反应结束；步骤(1)制备的溶液与步骤(2) 制备的溶液的体积比为3 : 1 ; (4)经20000rpm离心30min，沉淀先用0. lmol/L的NaOH乙醇水溶液(乙醇与水
的体积比为90 : 10)，然后去离子水清洗，于-S(TC下预冷冻，冷冻干燥24h后得到AZT磷
酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米微粒，其直径分布于100 200nm之间。 实施例3 3TC磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药的制备 本实施例以3TC磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物为原料，制备其纳米前药粒子，
具体制备步骤如下所示 (1)称取0.003克3TC磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物(3TC质量分数为13% ) 溶于30毫升2%的甲酸溶液中，配制浓度为0. 01 %的溶液； (2)称取0. 001克三聚磷酸钠溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0. 01%的溶液； (3)常温下磁力搅拌下，将步骤(1)制备的溶液以lmL/min的速度加入至步骤(2) 制备的溶液中，保持并控制pH为4 6之间直至反应结束；步骤(1)制备的溶液与步骤(2) 制备的溶液的体积比为3 : 1 ; (4)经20000rpm离心30min，沉淀先用0. lmol/L的KOH乙醇水溶液(乙醇与水的
体积比为80 : 20)，然后去离子水清洗，于-8(TC下预冷冻，冷冻干燥24h后得到3TC磷酰
化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米微粒，其直径分布于100 200nm之间。 实施例4 d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米前药的制备 本实施例以d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物为原料，制备其纳米前药粒子，
具体制备步骤如下所示 (1)称取0. 002克d4T磷酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物(d4T质量分数为17% ) 溶于20毫升2 %的乙酸溶液中，配制浓度为0.01%的溶液； (2)称取0.001克羧甲基壳聚糖溶解于10毫升去离子水中，配成浓度为0.01%的 溶液； (3)常温下磁力搅拌下，将步骤(1)制备的溶液以lmL/min的速度加入至步骤(2) 制备的溶液中，保持并控制pH为4 6之间直至反应结束；步骤(1)制备的溶液与步骤(2) 制备的溶液的体积比为2:1; (4)经20000rpm离心30min，沉淀先用0. lmol/L的NaOH乙醇水溶液(乙醇与水 的体积比为80 : 20)，然后去离子水清洗，于-S(TC下预冷冻，冷冻干燥24h后得到d4T磷 酰化偶联壳聚糖异丙酯衍生物纳米微粒，其直径分布于100 200nm之间。
权利要求
一种核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物纳米前药粒子的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物溶解于稀酸中；(2)将聚阴离子物质溶解于去离子水中，配成聚阴离子溶液；(3)将步骤(1)制备所得溶液缓慢加入步骤(2)制备的聚阴离子溶液中，室温搅拌；(4)将步骤(3)得到的溶液经离心、洗涤、冷冻干燥后，得到核苷磷酰化偶联壳聚糖纳米前药粒子。
2. 根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述稀酸为稀甲酸、稀乙酸、稀盐酸、稀硝酸、稀磷酸或稀柠檬酸中的任意一种或一种以上的混合。
3. 根据权利要求l中所述制备方法，其特征在于步骤(1)中，将核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物溶解于稀酸中，制备所得溶液中核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物占溶液总质量的0. 01% 1%。
4. 根据权利要求l中所述制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述聚阴离子物质为三聚磷酸盐、海藻酸盐、透明质酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖硫酸酯。
5. 根据权利要求l中所述制备方法，其特征在于步骤(2)中，聚阴离子溶液中聚阴离子占溶液总质量的0.01% 1%。
6. 根据权利要求l中所述制备方法，其特征在于步骤(3)中，步骤(1)制备所得溶液与步骤(2)制备所得溶液的体积比为2 : 1 3 : 1。
7. 根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于步骤(3)中，室温搅拌后，整个体系pH为4 6。
8. 根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于步骤(4)中，离心的速度为20000rpm。
9. 根据权利要求l中所述制备方法，其特征在于步骤(4)中，所述洗涤是先用浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钠乙醇水溶液，或浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钾乙醇水溶液洗涤，然后再用去离子水洗涤；所述浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钠乙醇水溶液或浓度为0. 05 0. 5mol/L的氢氧化钠乙醇水溶液，是指以氢氧化钠或氢氧化钾为溶质，以体积比为80 : 20 99 : 1的乙醇水混合液为溶剂，溶质浓度为O. 05 0. 5mol/L。
10. 权利要求1所述制备方法在制备抗肿瘤、抗艾滋病或抗病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物纳米前药的制备方法和应用，该方法包括如下步骤(1)将核苷磷酰化偶联壳聚糖衍生物溶解于稀酸中；(2)将聚阴离子物质溶解于去离子水中，配成聚阴离子溶液；(3)将步骤(1)制备所得溶液缓慢加入步骤(2)制备的溶液中，室温搅拌；(4)将步骤(3)得到的溶液经离心、洗涤、冷冻干燥后，得到核苷磷酰化偶联壳聚糖纳米前药粒子。本发明的制备方法，条件温和，工艺简单，绿色环保。采用本发明的制备方法可实现核苷磷酸酯靶向性及控制释放，避免核苷药物的爆释，改进核苷药物的生物利用度及药代动力学，降低毒副作用，提高抗病毒及抗肿瘤效果，可应用在抗艾滋病、抗肿瘤和抗病毒药物制剂中。
文档编号A61K31/7072GK101703782SQ20091019383
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者乔仁忠, 曾戎, 杨林 申请人:暨南大学