专利名称：维生素e琥珀酸酯-壳聚糖接枝物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种新型表面活性剂及其制备方法，具体涉及维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物及其制备方法及其在稳定药物纳米混悬剂方面的应用。
背景技术：
纳米混悬剂是一种新的给药剂型，其通过粉碎或者控制结晶生长使药物以纳米尺度分散在水中，形成分散体系。该系统不含基质材料，只含有少量的表面活性剂作为稳定剂，与微球、脂质体、固体脂质纳米粒等相比，具有处方简单、制备方便、载药量高等特点，并且可以减少附加成分所造成的刺激和毒副作用，大大提高患者的顺应性；另外，纳米混悬剂显著增大药物的比表面积，能有效地提高药物的溶出度及生物利用度。作为一种中间剂型， 纳米混悬剂可以进一步制备成适合口服、注射或其他给药途径的药物剂型。然而纳米晶体混悬剂的物理稳定性差，容易聚集或结晶长大，从而影响制剂稳定性和药物的疗效。因此在混悬剂的处方中往往加入抑止结晶长大的辅料，叫结晶抑制剂或稳定剂。壳聚糖(Chitosan，CS)是自然界唯一大量存在的高分子碱性氨基多糖，与合成高分子材料相比，其具有来源广泛、价格低廉、性质稳定，无刺激性，无致敏性，以及生物相容性和生物可降解性良好等优点，近年来广泛用于给药系统的研究中。由于高分子量的壳聚糖在生理PH的条件下难溶于水性环境，因此限制了其作为药物载体的应用，然而壳聚糖的分子量越小，脱乙酰度越大，其溶解度则越大，这就为其应用提供了解决思路。分子量在 5-50 kDa的壳聚糖，保持了阳离子、低毒以及良好生物相容性等优点，并具有较好的水溶性，如果在其主链上引入合适的疏水链段，则可以弥补其分子链中亲脂性的不足，使其有望成为一种新型的优良材料。壳聚糖的主链上的-OH和-NH2反应基团，为其化学修饰提供了可能。由于维生素E琥珀酸酯(VES)良好的脂溶性并且生物相容性良好，将其引入壳聚糖分子主链可改善壳聚糖分子的疏水性，得到一种两亲性的维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物。该接枝物既保留了适当数量的-NH2，又具有一定的亲脂能力，可与药物发生亲和，对药物的纳米混悬剂起到较好的稳定作用。
发明内容
本发明的目的在于制备维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物作为纳米混悬剂的稳定剂，利用其两亲性的表面活性作用，制备得到具有良好稳定性的药物纳米混悬剂。本发明通过对水溶性的壳聚糖进行疏水改性，在其主链上接枝维生素E琥珀酸酯，使其形成具有两亲性的生物可降解的聚合物，用于作为药物纳米混悬剂的稳定剂。维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物通过以壳聚糖为主体，在其-NH2上接枝疏水性维生素E琥珀酸酯而制得，其通式如下
3本发明目的通过以下方案实现
(1)在搅拌条件下，于3小时内将壳聚糖与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液缓慢加入到维生素E琥珀酸酯的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，控制温度20°C -40°C，反应12-96 小时后，将终反应液倾倒至过量的甲醇-氨水(15 1 1 2)溶液中沉淀，过滤得到黄色凝胶，透析纯化，冷冻干燥制得维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物；
(2)以维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物为稳定剂，制备药物的纳米混悬剂将维生素 E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物以0. 1 5mg/ml的浓度范围分散于水中，与药物或其有机溶液混合，冰浴下探头超声处理，得到粒径为10-500nm的纳米混悬剂；
(3)冷冻干燥加入或不加入冻干保护剂，将纳米混悬剂冷冻干燥，制得质量稳定的纳米混悬剂冻干品。所得的冻干品经适当稀释后可迅速重建，粒径略有增加。其中冻干保护剂优选蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇中的一种或任意几种的混合物。所制得的冻干品具有良好的长期稳定性，且有利于药物长期储存和运输。其中，壳聚糖的分子量为IXlO3- IOXlO4 Da，脱乙酰度为70%_99%;维生素E琥珀酸酯的取代度为1%_99%。所述的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其用量分别为壳聚糖的0. 2 2倍。所述的维生素E琥珀酸酯的用量为壳聚糖的0. 5-2倍。本发明的维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物可以用于制备纳米混悬剂，并具有良好的稳定性。所述的纳米混悬剂通过如下方法制备将维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的水分散液与药物粉末或该药物的有机溶液混合，冰浴探头超声处理，得到粒径为10-500nm的纳米混悬剂。维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的水分散液浓度为0. l-10mg/ml。药物的有机溶液中的有机溶剂为能溶解药物并与水混溶的有机溶剂，选自甲醇、乙醇、丙酮，药物的有机溶液的药物浓度为1 mg/ml-200 mg/ml。所述的纳米混悬剂为液体状混悬剂或干纳米混悬剂；干纳米混悬剂为喷雾干燥或冻干的干混悬剂，加入或不加入支持剂。所述的支持剂为蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、 甘露醇中的一种或任意几种的混合物。所述的的药物选自紫杉醇，或其同系物。本发明的优点在于
(1)维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的制备工艺比较简单，可用于放大生产。(2)制备维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的两种材料为天然可生物降解材料或人体所必需的物质，在体内不会产生蓄积和毒副作用，因此具有无毒、生物相容性好的特
点ο(3)采用维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物制备的纳米混悬剂，可供口服或注射用。该制剂低毒，无刺激和过敏反应，可有效提高药物的疗效。(4)本发明制成的干混悬剂具有很好的稳定性，而且有利于药物的运输和储存，提高临床用药的安全性。
图1为维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的合成路线。图2为维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的红外图谱。图3为壳聚糖和维生素E琥珀酸酯-壳聚糖嫁接物的IH NMR谱。图4为以维生素E琥珀酸酯-壳聚糖嫁接物为稳定剂制备的紫杉醇纳米混悬剂的透射电镜图。图5为小鼠尾静脉注射10mg/kg剂量的紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂后的血药浓度曲线.。图6为小鼠尾静脉注射10mg/kg剂量的紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂0. 5小时后的组织分布。图7为小鼠尾静脉注射10mg/kg剂量的紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂1小时后的组织分布。图8为小鼠尾静脉注射10mg/kg剂量的紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂6小时后的组织分布。图9为小鼠尾静脉注射10mg/kg剂量的紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂12小时后的组织分布。图10为紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂对各组小鼠的宫颈癌U-14实体瘤抑制率。图11为注射紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂的各组宫颈癌U-14实体瘤小鼠的瘤
重结果。图12为注射紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂的各组宫颈癌U-14实体瘤小鼠的瘤体积。图13为注射紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂的各组宫颈癌U-14实体瘤小鼠的体
重变化。图14为注射紫杉醇溶液和紫杉醇纳米混悬剂的各组宫颈癌U-14实体瘤小鼠去瘤体重对比图。
具体实施例方式
一、维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的制备实施例一
称取分子量为MkDa的壳聚糖(脱乙酰度95%) 0.2 g，碳二亚胺0.25 g和N-羟基琥珀酰亚胺0.15 g，配成水溶液，称取维生素E琥珀酸酯0.3 g溶于30 ml的N，N-二甲基甲酰胺中。在搅拌条件下，于3小时内将含有壳聚糖的水溶液缓慢加入到维生素E琥珀酸酯的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中。在30 °C下反应48小时，向终反应液中倾入270ml甲醇与 30ml氨水的混合溶液(9 :1)，将沉淀过滤得到黄色凝胶，用无水乙醇反复清洗后，置于透析袋(MWC03500)中，蒸馏水透析M小时，除去残留的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺以及反应副产物。将透析液冷冻干燥，即得到维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物，经测定，其接枝率 (氨基取代度)为20%。实施例二
称取分子量为MkDa的壳聚糖(脱乙酰度90%) 0.2 g，碳二亚胺0.4 g和N-羟基琥珀酰亚胺0.4 g，配成水溶液，称取维生素E琥珀酸酯0.2 g溶于40 ml的N，N-二甲基甲酰胺中。在搅拌条件下，于3小时内将含有壳聚糖的水溶液缓慢加入到维生素E琥珀酸酯的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中。在30 °C下反应M小时，向终反应液中倾入300ml甲醇与20ml 氨水的混合溶液(15 :1)，将沉淀过滤得到黄色凝胶，用无水乙醇反复清洗后，置于透析袋 (MWC07000)中，蒸馏水透析48小时，除去残留的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺以及反应副产物。将透析液冷冻干燥，即得维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物。经测定，其接枝率为 14% ο实施例三
称取分子量为IOOkDa的壳聚糖(脱乙酰度97%) 1 g，碳二亚胺0.2 g和N-羟基琥珀酰亚胺0.2 g，配成水溶液，称取维生素E琥珀酸酯0.5 g溶于30 ml的N，N-二甲基甲酰胺中。在搅拌条件下，于3小时内将含有壳聚糖的水溶液缓慢加入到维生素E琥珀酸酯的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中。在40°C下反应48小时，向终反应液中倾入180ml甲醇与120ml 氨水的混合溶液(6:4)，将沉淀过滤得到黄色凝胶，用无水乙醇反复清洗后，置于透析袋 (MWC07000)中，蒸馏水透析48小时，除去残留的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺以及反应副产物。将透析液冷冻干燥，即得到维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物。经测定，其接枝率为 8 %。实施例四
称取分子量为20kDa的壳聚糖1 g，碳二亚胺0.5 g和N-羟基琥珀酰亚胺0. 4 g，配成水溶液，称取维生素E琥珀酸酯2g溶于30 ml的N，N-二甲基甲酰胺中。在搅拌条件下， 于3小时内将含有壳聚糖的水溶液缓慢加入到维生素E琥珀酸酯的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中。在20 °C下反应48小时，向终反应液中倾入180ml甲醇与360ml氨水的混合溶液 (1 2)，将沉淀过滤得到黄色凝胶，用无水乙醇反复清洗后，置于透析袋(MWC07000)中，蒸馏水透析48小时，除去残留的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺以及反应副产物。将透析液冷冻干燥，即得到维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物。经测定，其接枝率为％ %。合成后验证性实验
(1)壳聚糖和维生素E琥珀酸酯-壳聚糖嫁接物的红外图谱
见附图2，附图2中A为壳聚糖红外图谱，B为维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的红外图谱。由图B显示酰化反应后壳聚糖吸收峰如下3415 (0-H峰与N-H峰交叠)，2926 (C - H峰)，1652 (酰胺I带，CO乙酰基吸收峰)，1559 (酰胺II带，N-H吸收峰)， 1420 - 1380 (<-!1吸收峰)，1383 (C-N吸收峰)，1155 (bridge 0 吸收峰)和 1073 (C-0吸收峰)。嫁接物的酰胺峰在1652、1559 cm 1左右，和壳聚糖原料相比(由于壳聚糖原料含乙酰胺基，在图A中可观察到16沈、1519 cm 1的酰胺峰)，分别向高波移动了沈和30个左右单位。表明与壳聚糖氨基相连的基团发生了变化，即由壳聚糖中的氨基与维生素E琥珀酸酯中的羧基形成了酰胺键。一个较弱的肩峰出现在1738 cm 1处，表示了维生素E琥珀酸酯中酯键的羰基，进一步提示了维生素E琥珀酸酯已经连接到了壳聚糖上。(2)壳聚糖和维生素E琥珀酸酯-壳聚糖嫁接物的IH NMR谱
见附图3，在维生素E琥珀酸酯-壳聚糖嫁接物的IH NMR谱中出现了维生素E琥珀酸酯分子中-CH3和-CH2的质子峰，而壳聚糖的IH NMR谱中，在相同的位置没有出现峰。这个结果表明经过反应，在壳聚糖链上连接有维生素E琥珀酸酯，证明生成维生素E琥珀酸酯-壳聚糖嫁接物。二、紫杉醇纳米混悬剂的制备
实施例一(直接加药物粉末探头超声法)
取维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物(壳聚糖分子量为34kDa，接枝率20%)分散于 0. 05%醋酸溶液中，超声溶解，纯水透析12小时，除去醋酸，得到壳聚糖维生素E琥珀酸酯嫁接物溶液(0.3 mg/ml)，取接枝物溶液5 ml，在冰浴超声下分次加入紫杉醇粉末50 mg，加入完毕在冰浴下探头超声30 min，过0.8 Mm的微孔滤膜除去杂质和大粒子的药物，经测定，药物含量为9. 82mg/ml，混悬剂的粒径为100_250nm。向制得的纳米混悬液中加入质量分数为2. 5%的甘露醇，冷冻干燥，得到疏松、平整的粉末，将该粉末水化“复溶”后粒径无明显变化。
权利要求
1.维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物，其特征在于，其通式如下
2.一种如权利要求1所述的维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备在搅拌条件下，于3小时内将壳聚糖与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液缓慢加入到维生素E琥珀酸酯的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，控制温度 200C -400C，反应12-96小时后，将终反应液倾倒至过量的15 1 1 2的甲醇-氨水溶液中沉淀，过滤得到黄色凝胶，透析纯化，冷冻干燥制得维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物。
3.根据权利要求2所述的维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于 壳聚糖的分子量为IXlO3- IOXlO4 Da，脱乙酰度为70%-99%;维生素E琥珀酸酯的取代度为 1%-99%。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其用量分别为壳聚糖的0. 2-2倍。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，维生素E琥珀酸酯的用量为壳聚糖的 0. 5-2 倍。
6.权利要求1或2所述的维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物在制备纳米混悬剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的纳米混悬剂通过如下方法制备将维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的水分散液与药物粉末或该药物的有机溶液混合，冰浴探头超声处理，得到粒径为10-500nm的纳米混悬剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物的水分散液浓度为0. l-10mg/ml。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于药物的有机溶液中的有机溶剂为能溶解药物并与水混溶的有机溶剂，选自甲醇、乙醇、丙酮，药物的有机溶液的药物浓度为1 mg/ ml-200 mg/ml。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的纳米混悬剂为液体状混悬剂或干纳米混悬剂；干纳米混悬剂为喷雾干燥或冻干的干混悬剂，加入或不加入支持剂。
11.根据权利要求10所述，其特征在于，所述的支持剂为蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇中的一种或任意几种的混合物。
12.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的的药物选自紫杉醇，或其同系物。
全文摘要
本发明提供一种维生素E琥珀酸酯-壳聚糖接枝物(Ⅰ)及其制备方法以及其在紫杉醇及同系物纳米混悬剂中的应用。该接枝物具有两亲性，能起到表面活性剂的作用，用于稳定药物的纳米混悬剂。本发明所制得的纳米混悬剂具有载药量高，稳定、安全、低毒，无溶血及静脉血管刺激性等特点，并且制备工艺简单，容易实现产业化。
文档编号A61P35/00GK102558391SQ201110456539
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者崔福德, 朴洪宇, 李雪丰, 梁娜 申请人:沈阳药科大学