Psa?tpgs偶联物及其应用
【专利摘要】将PSA修饰于高纯度的TPGS上，不仅可降低TPGS的CMC值、溶血性，还可以提高其抗肿瘤活性，并且可与亲脂性物质共同制备混合胶束。混合胶束可同时具有PSA和TPGS各自的优势，首先借助PSA做为肿瘤“必需营养元素”的特性主动靶向至肿瘤部位，然后利用TPGS抗肿瘤的特性与药物协同杀伤肿瘤细胞，既保持TPGS原有优势的同时，又降低其CMC值。更重要的是，其还可以消除交叉注射PEG化载体的ABC现象。
【专利说明】
PSA-TPGS偶联物及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及PSA-TPGS偶联物的制备方法及其在治疗肿瘤上的应用。
【背景技术】
[0002] 聚乙二醇1000维生素 E琥珀酸酯(TPGS)是维生素 E的水溶性衍生物，由亲脂性的维 生素 E琥珀酸酯和亲水性的聚乙二醇1000经酯键连接而成，结构式如下所示。
[0003]
[0004] 除了作为药用辅料，近年来研究证实TPGS还具有一定的生物活性，体内外结果证 明TPGS可选择性的杀伤肿瘤细胞，包括胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤细胞，且对正常细 胞无作用。
[0005] 虽然TPGS具有较强的乳化增溶能力、协同抗肿瘤等优势，但目前市售TPGS纯度较 低，应用于静脉注射或作为合成原料仍存在诸多问题。现阶段有关TPGS的研究所采用的 TPGS来源均不相同，涵盖了Eastman、BASF、Sigma等。以BASF公司生产的KolIiphOT_ ; TPGS为例， TPGS纯度仅为70 %~87 %，杂质主要为聚乙二醇1000维生素 E琥珀酸双酯（di-d-a-t°C opherol polyethylene glycollOOOsuccinate，di_TPGS)和PEG100 0。di-TPGS为PEG1000两 端接蛄νρ?的而主杜壞各物_娃始才5
[0006
[0007] 相比于TPGS，d i -TPGS的亲水链变短，导致其水溶性、乳化能力均降低，进而缩短其 所修饰制剂的循环时间。对于抗肿瘤制剂来说，如果制剂的循环时间较短，将无法借助EPR 效应进入肿瘤，发挥抗肿瘤疗效。更为重要的是，不同批次间TPGS的纯度差异较大，不仅无 法保证制剂重现性，还会对制剂疗效产生不良影响。低纯度的TPGS除了应用于静脉注射存 在局限外，由于参差不齐的纯度，以其作为合成原料时，杂质PEG1000可能会参与反应而产 生副产物，导致实验结果受到干扰，无法对实验结果进行准确判断。此外，市售TPGS中的di-TPGS和PEG1000抗肿瘤活性和逆转MDR作用较差，减弱了制剂的疗效。
[0008] 另外，TPGS临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC)相对较高 (0.02%，w/v)，作为药物载体时存在着载药量低及稀释稳定性差等问题，因此需要对其进 行结构修饰，降低CMC值。
【发明内容】
[0009]
【申请人】创造性的发现，将PSA修饰于高纯度的TPGS上，不仅可降低TPGS的CMC值，并 可与亲脂性物质共同制备混合胶束。混合胶束可同时具有PSA和TPGS各自的优势，首先借助 PSA做为肿瘤"必需营养元素"的特性主动靶向至肿瘤部位，然后利用TPGS抗肿瘤的特性与 药物协同杀伤肿瘤细胞，既保持TPGS的原有优势的同时，又降低其CMC值。同时，其可以消除 交叉注射PEG化载体的加速血液清除(Accelerated Blood Clearance ,ABC)现象，以及降低 了纯化后的TPGS的溶血性，PSA-TPGS与TPGS的空白混合胶束也具有抗肿瘤作用，强于DTX的 Tween80 溶液。
[0010] PSA-TPGS是由TPGS与PSA为原料，甲酰胺为溶剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺为催化剂所得到的产物，合成反应路线如下所示。
[0011]
[0012] 优选PSA聚合度在50-200、TPGS的PEG分子量为500-5000之间。
[0013]进一步的，将其制备成药物载药系统，优选载药系统为胶束、纳米粒、乳剂、微球、 微囊、脂质体，用于负载各种类型的在水中不可溶的、或者溶解性小的药物。选自紫杉烷类、 喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、替尼类、埃坡霉素类、维A酸类、二氢吡啶类、人参皂甙类、月旨 溶性维生素类、他汀类、激素类、康唑类、泊苷类、青霉素类、头孢类、大环内酯类、多烯/多肽 类、醌类化合物、金属铂类化合物、萜类化合物、黄酮类、姜黄素类、联苯酚类化合物、吡唑酮 类、嘧啶类、嘌呤类、呋喃类、非留体抗炎药、非黄酮类多酚类化合物、阿糖腺苷类、沙坦类、 有机碘化合物、烷基酚类。所述紫杉烷类选自紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛，喜树碱类选自羟 基喜树碱、硝基喜树碱，长春碱类选自长春新碱、长春瑞滨，阿霉素类选自阿霉素、表阿霉 素、柔红霉素、伊达霉素、吡柔比星，替尼类选自来他替尼、埃克替尼、阿法替尼、奥替尼啶、 多韦替尼、苏尼替尼、坦度替尼、马赛替尼、吉非替尼、巴非替尼，埃坡霉素类选自伊沙匹隆、 埃坡霉素 A、埃坡霉素 B、埃坡霉素 C、埃坡霉素 D、脱氧埃坡霉素，维A酸类选自（全反式)维甲 酸、阿维A酯、芳维甲酸，二氢吡啶类选自尼群地平、尼莫地平、氨氯地平、西尼地平，人参皂 甙类选自人参皂苷Re、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh3、人参皂苷 Rh5,脂溶性维生素类选自维生素 A、维生素 D、维生素 E、维生素 K、胆骨化醇、钙三醇、VE烟酸 酯，他汀类选自辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀，激素类选自地塞米松、地塞米松 棕榈酸酯、醋酸地塞米松、非那雄胺、2-甲氧基雌二醇、乙烯雌酚、醋酸甲羟孕酮、可的松、氢 化可的松、泼尼松、氢化泼尼松、前列地尔，康唑类选自伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、氟康 唑、益康唑，泊苷类选自依托泊苷、替尼泊苷，青霉素类选自青霉素 G、阿莫西林、氨苄西林， 头孢类选自头孢他啶、头孢曲松、头孢唑肟，大环内酯类选自红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、 克拉霉素、雷帕霉素，多烯/多肽类选自曲古霉素、两性霉素 B、环孢菌素 A、放线菌素 D，醌类 化合物选自辅酶Q10、丹参酮IIA、丝裂霉素，金属铂类化合物选自顺铂、卡铂、奈达铂、阿劳 铂、奥沙利铂肩类化合物选自β-榄香烯、青蒿素、二氢青蒿素、冬凌草甲素、冬凌草乙素、细 辛醚、细辛脑、萌芦素提取物、蒿本内酯、马蔺子素，黄酮类选自葛根素、水飞蓟素、藤黄酸， 姜黄素类选自姜黄素、单去甲氧基双黄素、双去甲氧基双黄素，联苯酚类化合物选自厚朴 酚、和厚朴酚，吡唑酮类选自氨基比林、保泰松，嘧啶类选自氟尿嘧啶、齐多夫定棕榈酸酯、 齐多夫定肉豆蔻酸酯、齐多夫定硬脂酸酯、齐多夫定胆固醇酯，嘌呤类选自恩替卡韦、巯嘌 呤、磺巯嘌呤钠，呋喃类选自呋喃唑酮、呋喃妥英、呋喃丙胺，非留体抗炎药选自尼美舒利、 布洛芬、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸(钠）、美洛昔康，五环三萜类化合物选自齐墩果酸、甘 草酸、乌苏酸、桦木酸、23-羟基桦木酸，非黄酮类多酚类化合物选自白藜芦醇，阿糖腺苷类 选自阿德福韦酯，沙坦类选自坎地沙坦、氯沙坦、缬沙坦、依普罗沙坦、缬沙坦苄酯、坎地沙 坦、坎地沙坦乙酯、洛沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、替米沙坦、阿齐沙坦，有机碘化合物选自胺 碘酮，烷基酚类选自丙泊酚。
[0014] 胶束的制备方法可以是本领域任何已知的制备方法，优选薄膜水化法、溶剂挥发 法或者自组装法，优选自组装法。
[0015] 薄膜水化法：按比例称取PSA-TPGS，活性成分于圆底烧瓶中，活性成分的重量为 PSA-TPGS重量的2-20%，加入适量有机溶剂，优选二氯甲烷，超声10-20min使其充分混匀 后，减压旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥过夜除去残留溶剂，得干燥透明的药膜。水浴加 热至50-70°C，使固体骨架融化后，加入PSA-TPGS重量体积比为10-20:1的同温度水，搅拌 20-40min水化。冷却至室温，过0.22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液。
[0016] 乳化溶剂挥发法:按比例称取PSA-TPGS于西林瓶中，加入PSA-TPGS重量体积比为 10-20:1的水溶解。将活性成分溶于有机溶剂中，优选丙酮，活性成分的重量为PSA-TPGS总 重量的2-20%，30-50°C水浴加热搅拌条件下快速滴加入西林瓶中，继续搅拌10_20min直至 有机溶剂完全挥去。冷却至室温，过〇. 22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液。
[0017] 自组装法:按比例称取PSA-TPGS，和重量为PSA-TPGS重量的2-20 %的活性成分于 西林瓶中，加入适量有机溶剂溶解后，并加入与有机溶剂等体积的水超声2_5min使药物载 体混合均匀。在室温条件下，向其中快速注入生理盐水至有机溶剂的浓度为5-10%，并振摇 成均相，得到澄清透明的胶束溶液，过〇. 22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液。优选有机溶剂 为乙醇。
[0018] 在制备胶束过程中，其可以跟本领域中任何的表面活性剂类物质联合使用，并且 其与PSA-TPGS可以为任意比例。离子型表面活性剂(肥皂类、硫化物类、磺酸化物类、磷脂类 DOPC/DOPG/DPPC/HSPC/EPC/SPC/DSPE 以及其PEG 衍生物，如 mPEG-DSPE等）；非离子型表面活 性剂(脂肪酸甘油酯类:脂肪酸单甘油酯、脂肪酸二甘油酯，如单硬脂酸甘油酯等）；多元醇 类(鹿糖脂肪酸酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯）；聚氧乙烯型（聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂 肪酸醇醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，如泊洛沙姆）。
[0019] 本申请中包封率的测定方法：
[0020] 对于紫衫烷类难溶性药物，可采用过膜法(0.22μπι)测定胶束中药物的包封率，即 测定过膜前后药物的含量。
[0021] 具体的含量测定为:精密移取过膜前后的胶束溶液IOOyL至Ε.P管中，分别加入乙 酸乙酯ImL，异丙醇50yL，充分祸旋5min，N2条件下挥干后，加入乙腈ImL复溶，1000 Orpm离心 IOmin后，取上清液，在HPLC下测定即可。按照公式1和公式2计算制剂包封率 (Encapsulation，EE% )和载药量（Drug loading，DL% ) 〇
[0022] EE% =MVMOX 100%
[0023] 其中，Μ'为胶束中药物含量;MO为投药量
[0024] DL% =MVMX 100%
[0025] 其中，M'为胶束中药物含量;M为胶束中药物和材料的总量。
【附图说明】
[0026] 图I PSA-TPGS衍生物的红外谱图
[0027] 图2 PSA-TPGS衍生物的氢谱图
[0028] 图3 PSA-TPGS衍生物的CMC值
[0029] 图4 PSA-TPGS衍生物的CMC值
[0030]图5不同物质的溶血性 [0031]图6不同浓度物质的溶血性
[0032] 图7-8首次注射1.0~lO.Omg · kg-Ι的药时曲线
[0033] 图9-10首次注射PT对抗PEG IgM影响
[0034] 图11肿瘤生长曲线
[0035]图12每日的体积抑瘤率
[0036]图13生存天数
[0037]图14荷瘤鼠各组的体重变化(n = 6)
[0038] 图15去瘤鼠的体重变化(n = 6)
[0039] 图16荷瘤鼠的摄食量变化(n = 6)
[0040] 图17荷瘤鼠饮水量变化(n = 6)
[0041] 图18脾指数和胸腺指数(n = 6)
【具体实施方式】
[0042] 实施例1PSA-TPGS衍生物的合成
[0043] 1.1制备方法如下
[0044] 将PSA(IOOmg，0.33mmoI SA单体)60°C水浴加热溶在5mL的甲酰胺中，待体系降至 室温，加入80mg N-羟基丁二酰亚胺(0.68mmol)和128mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亚胺盐酸盐(0.68mmol)，冰水浴条件下搅拌30min后，将溶解在5mL的甲酰胺中的TPGS (IOOmg，0.066mmol)加入反应体系中，充氮气保护，密封，室温下搅拌24h。反应完成后，用蒸 馏水将反应液稀释2倍，并将其置于透析袋(截留分子量IOkDa)中。透析介质为水体系，透析 体积为3L，每4h更换1次透析介质，透析12h。水透析结束后，采用无水乙醇继续透析，透析体 积为1L，每4h更换1次透析介质，透析24h。透析结束后，真空旋转出乙醇，加水分散冻干，得 至泊色絮状物质。其中PSA聚合度为100, TPGS中PEG分子量分子量为1000。
[0045] 1.2结构确认如下
[0046] 参见图1其中a为PSA的红外谱图、b为TPGS的红外谱图、c为PSA-TPGS的红外谱图 [0047]测定方法如下：
[0048] 采用KBr压片法测定PSA、TPGS及PSA-TPGS的红外吸收，结果如Fig. 1-2所示。在IR 光谱中，与PSA相比，PSA-TPGS在1739.8CHT1处出现一个吸收峰，为羰基(Vc=O)振动峰。TPGS 含有两种不同羰基，即与VES的苯环相连的芳香羰基（1741.2(3!^1)和与TOG相连的醇羰基 (1738.6(3!^ 1) Aig. 1-3中可知，芳香羰基伸缩振动信号强度明显强于醇羰基的信号强度，且 呈尖峰。而在PSA-TPGS红外图谱中，醇羰基伸缩振动的信号明显加强，说明TPGS已通过酯键 连接于PSA上。此外，相对于TPGS，PSA-TPGS在1640.1Cnf 1处出现酰胺键的羰基(Vc=Q)伸缩振 动峰。
[0049] 1.3氢谱如下
[0050] 采用氢核磁共振进一步验证所得产物的结构。由于TPGS结构中本身已存在碳酸酯 键，核磁共振碳谱中无新特征峰生成，因此未进行碳谱分析。IH-匪R(DMSO) ,δρρηι: 1.12， 1·24(d，16H，H-a)，2·03(s，3H，H-e)2.59(t，2H，H-b)，2.81，2.95(t，4H，H-c)，3.66((1,92Η， H-e)。具体参见图2。结合上述结果可知，所得产物即为目标化合物PSA-TPGS。
[0051 ] 1 · 4PSA-TPGS的基本性质考察
[0052] 1.4. ICMC的测定
[0053]合成后的PSA-TPGS虽然一定程度上增加了 PSA的脂溶性，但仍无法单独进行载药， 后续实验中均采用PSA-TPGS与TPGS制备的混合胶束(TPM)。采用芘荧光法[78]对其011(：值进 行测定。
[0054] 1.4.2芘溶液的配制
[0055] 精密称取10.Omg芘于25mL量瓶中，丙酮稀释至刻度，摇匀，得浓度为2 X HT3M的芘 储备液。取芘储备液0.5mL于IOOmL量瓶中，丙酮稀释至刻度，摇匀，得浓度为I X HT5M的芘工 作液。取0.1 mL芘工作液至若干IOmL量瓶中，氮气吹干备用。
[0056] 1.4.3不同浓度胶束溶液的制备
[0057] 精密称取适量PSA-TPGS、TPGS于"4.1. Γ项中的容量瓶内，分别加水稀释至10mL， 得至Ijl X HT7M芘溶液(芘在水中的饱和溶解度为7 X I(T7M)，水浴超声Ih，25°C恒温震荡过 夜，即得到浓度分别为5 X 10-5、I X 10-4、5 X 10-4、I X 10-2、5 X 10-2、I X 10-Vg · mL-1的PSA-TPGS与TPM溶液;另有一瓶仅加入IOmL纯水而无胶束材料，得到浓度为HT7M的芘水溶液。 [0058] 1.4.4测定结果
[0059]将"1.4.2"项中得到的芘水溶液以397nm作为发射波长，在300~350nm波长范围内 进行扫描，叠加各激发波长图谱并记录数据。以338nm和334nm的荧光强度（1338/1334)之比为 纵坐标，对数浓度值为横坐标作图，所得各点可拟合为两条直线，它们的交点即对应着的 CMC值，结果见图3-4。由图3-4可知，PSA-TPGS、TPM的CMC值分别为6 · 2和2 · 8yg · mL-1 ISA- TPGS与TPGS(CMC值为200yg · mL-4相比，CMC值降低了约30倍。
[0060] 1 · 5TPM体外溶血试验
[0061 ] 1 · 5 · 1红细胞混悬液(2 % )的制备
[0062] 取新鲜家兔血约2mL至涂有肝素钠的离心管中，1000 rpm离心10min，吸弃上层血 浆，加入等体积生理盐水至血细胞中，充分混匀后离心（离心转数及时间同上），弃去上清 液，再加入等体积生理盐水并按上述方法重复洗涤细胞2次。吸取洗涤后的压积红细胞ImL， 以生理盐水稀释至50mL即可制得所需2 %红细胞混悬液。
[0063] 1.5.2TPGS胶束的制备
[0064] 分别称取适量TPGS、TPGS-BASF和TPGS-Sigma置于IOmL西林瓶中，适量无水乙醇溶 解后加入，加入生理盐水注射液，震荡，摇匀，既得50.0 mg · ml/1的TPGS胶束溶液。取上述样 品溶液适量，依次稀释至5.0mg · ml/^O.Smg · ml/1，备用。
[0065] 1.5.3TPM的制备
[0066] 称取与"1.5.2"项等量的TPGS和PSA-TPGS置于IOmL西林瓶中，适量无水乙醇溶解 后加入，加入生理盐水注射液，既得TPGS含量为50mg · mL-1的TPM。取上述样品溶液适量，依 次稀释至TPGS含量为5.0mg · mL-\0.5mg · mL-S备用。
[0067] I · 5 · 3PSA-TPGS和PSA溶液的制备
[0068] 分别称取适量PSA-TPGS和PSA置于IOmL西林瓶中，适量无水乙醇溶解后加入，加入 生理盐水注射液，既得50.0 mg · ml/1的PSA-TPGS胶束溶液和PSA溶液。取上述样品溶液适量， 依次稀释至PSA-TPGS和PSA含量为5.0mg · mL-\0.5mg · mL-S备用。
[0069] 1.5.4体外溶血试验
[0070]按表1给药方案依次加入不同体积的上述溶液，使TPGS胶束和TPM 1-9号管中的 TPGS的浓度分别为0 · 01、0 · 03、0 · 05、0 · 10、0 · 30、0 · 50、1 · 00和3 · OOmg · mL-1 (PSA-TPGS和PSA 溶液也为上述浓度），其中，0号管不加供试液为阴性对照管，10号管以灭菌注射用水替代生 理盐水为阳性对照管。摇匀后，置于37.0±0.5° c恒温振荡器中孵育lh，每隔15min观察1次， 孵育结束后，于1500rpm离心10min，取上清液，以生理盐水为空白对照，在紫外-可见分光光 度计577nm处测定各样品的吸光度，按公式(1-2)计算溶血百分率，结果见图5。
[0071] 溶血百分率 ％ = (As-An)/(AP-An)X100% (1-2)
[0072] 其中，As为供试管的吸光度;AnS阴性对照管吸光度;~为阳性对照管吸光度。
[0073] 表 1
[0075] 由图5结果可知，在0.01~3.OOmg · ml/1范围内，不同来源的TPGS空白胶束均具有 较强的溶血性，且随着浓度的增加溶血性逐渐上升。溶血性从强到弱排序为：TPGS>TPGS-BASF>TPGS-Sigma，与纯度由大到小的趋势相同。当TPGS浓度增加至3mg · mL-1时，TPGS、 TPGS-BASF和TPGS-Sigma的溶血性分别为92.3%、83.7% 和88.5%。
[0076] 由图6结果可知，当不同制剂中TPGS的浓度在0.01~3.00mg · mL-1范围内时，TPM的 溶血程度显著低于了?63。当了?63浓度为3.0〇11^.1111/ 1时，了?63、了?1的溶血百分率性分别为 92.3%、33.8% ISA-TPGSjSA在所有浓度下的溶血百分率均小于5%，即均不引起溶血。 [0077]实施例2薄膜水化法：
[0078] 精密称取PSA-TPGS 150mg和5mg DTX于圆底烧瓶中，加入适量二氯甲烷，超声 IOmin使其充分混匀后，减压旋转蒸发除去有机溶剂，真空干燥过夜除去残留溶剂，得干燥 透明的药膜。水浴加热至60°C，使固体骨架融化后，加入IOmL同温度的水，搅拌30min水化。 冷却至室温，过0.22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液。其中PSA聚合度为100，TPGS中PEG分子 量为1000,包封率为90 %。
[0079] 实施例3乳化溶剂挥发法
[0080] 精密称取PSA-TPGS 150mg于西林瓶中，加入IOmL水溶解。将5mg DTX溶于丙酮中， 40°C水浴加热搅拌条件下快速滴加入西林瓶中，继续搅拌IOmin直至丙酮完全挥去。冷却至 室温，过0.22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液。其中PSA聚合度为100，TPGS中PEG分子量为 1000,包封率为92 %。
[0081 ] 实施例4自组装法
[0082] 精密称取PSA-TPGS 150mg，和5mg DTX于西林瓶中，加入适量乙醇溶解后，并加入 等量水超声3min使药物载体混合均匀。在室温条件下，向其中快速注入生理盐水至总体积 IOmL，并振摇成均相，得到澄清透明的胶束溶液，过0.22μπι滤膜。其中PSA聚合度为100，TPGS 中PEG分子量为1000，包封率为99.2 %。
[0083] 实施例5
[0084] 1首次注射PT对二次注射PE诱导ABC现象的影响
[0085] I. IPE 的制备
[0086] 按表2称取MCT，E80，mPEG2000-DSPE及DiR于55°C水浴中溶解作为油相，搅拌条件 下注入加热至相同温度的水相（灭菌注射用水）。继续于55°C水浴中搅拌孵育IOmin后即得 初乳。初乳经50W超声处理2min后，IOOW超声分散6min(工作Is，间歇Is)，0.22μπι的微孔滤膜 过滤后即得各组乳剂。
[0087] 表2ΡΕ处方
[0089] 1.2给药方案及实验方法
[0090] 取雄性Wistar大鼠，体重180~220g，随机分组，每组3只，按表3进行实验，首次注 射不同剂量空白胶束，间隔7天第二次注射DiR标记的10%PE(磷脂剂量为5μmOl·kg-l)。给 药后，分别于1、5、15、30、60、120、240min，经眼眶静脉丛取血，4500rpm离心I Omin，取上层血 衆按本节"1.1"项下的方法处理，在&1 = 750腦，人6111 = 79〇111]1波长处测定?值，样品？值减去 空白血
[0091 ]衆F值得Δ F值，由标准曲线计算各时间点血浆中的药物浓度，药时曲线见图7-8。 [0092] 表3给药方案
[0094] 1.3实验结果
[0095]图7结果表明，首次注射1.0~10.Omg · kg-Ι的TPGS胶束会加速二次注射10%PE的 清除，且首次注射IOmg · kg^TPGS胶束所诱导的ABC现象最强。当TPGS胶束首次注射剂量大 于50.0 mg · kg^1时，几乎不对药动学行为产生影响。如图8所示，首次注射1.5~200.0 mg · kg"1的PT对二次注射10%PE的药动学行为不产生影响。
[0096] 为了量化地比较ABC现象发生的强烈程度，引入了ABC index这一概念，即以二次 注射与首次注射制剂AUC比值作为衡量这种程度的标准。ABC index计算方法为:ABC index =二次注射的AUC(W)/首次注射的AUC(O^t) ABC index值越大，表明首次制剂引起二次注射 药动学行为的改变越小，即ABC现象越弱。本实验室前期研究表明，AUC比值在注射0~Ih波 动性较大，而在其后时
[0097]间段波动性较小，且变化趋势一致，因
[0098] 此可考虑采用0~Ih的AUC的比值快速反映 ABC现象的强弱，相应的ABC Index(^lh) 值见表4。
[0099]表4TPGS和PT的ABC index
[0102] 实验室前期工作表明，ABC indexo^h)在0.9~1.0范围内可认为无 ABC现象的发 生，0.7~0.9为弱ABC现象。表4显示，首次注射1.0和10.0 mg · kg+1的TPGS胶束，引起了二次 注射10%PE较弱的ABC现象。首次注射50.0~133. Omg · kg-1TPGS和不同剂量的PT，二次注射 10%PE的ABC index^ih)基本都在0.9~1.0范围内，即首次注射首次注射50.0~133. Omg · kg 一1TPGS和不同剂量的PT均未引起二次注射10 % PE的ABC现象。
[0103] 1.4血清中抗-PEG IgM的测定
[0104] Wistar大鼠均于首次注射和二次注射前采集空白血0.5mL于未经肝素化的E. P管 中，室温放置2h后，4000rpm离心10min分离血清，采用间接ELISA法测定血清中抗PEG IgM。
[0105] 1.4.1溶液的配制
[0106] 包被溶液的配制:精密称取mPEG2000-DSPE 2.80mg置于5mL量瓶中，以无水乙醇稀 释至刻度，摇匀，即得〇.56mg · mL-1的mPEG2000-DSPE溶液。
[0107] Tris缓冲盐溶液的配制：精密称取Tris 3.0g、NaCl 4.1〇11^于烧杯中，加入45〇1^ 重蒸水搅拌并溶解，以稀盐酸调节PH至8.0,转移至500mL量瓶中，以重蒸水稀释至刻度，摇 勾，即得含50mmol · L-1 的Tris、0· 14mmol · !/1NaCl溶液。
[0108] 洗涤液的配制：精密称取Tween 20 250.Omg于500mL量瓶中，以配制好的Tris缓冲 盐溶液稀释至刻度，摇匀，即得含〇. 05%Tween 20的Tris缓冲盐溶液。
[0109] 封闭液的配制:精密称取BSA 100.Omg于IOmL量瓶中，以配制好的Tris缓冲盐溶液 稀释至刻度，摇匀，即得含I %BSA的Tris缓冲盐溶液。
[0110] 稀释液的配制：精密称取BSA 250.Omg和Tween 20 12.0于25mL量瓶中，以配制好 的Tris缓冲盐溶液稀释至刻度，摇匀，即得含1%BSA和0.05%TWeen 20的Tris缓冲盐溶液。
[0111] 显色剂的配制:精密称取磷酸氢二钠180.Omg和柠檬酸47.0于15mL量瓶中，以重整 水稀释至刻度，摇匀，即得PH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液。另精密称取临苯二胺10.Omg于IOmL 量瓶中，以pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液稀释至刻度，再加入IOyL 30%的过氧化氢即得显色 剂，临用前配制，避光保持。
[0112] 1.4.2血清中抗-PEG IgM的测定方法
[0113] 1包被:取96孔聚苯乙烯板，每孔加包被液50yL，室温条件下过夜完全风干。
[0114] 2封闭：每孔精密加入封闭液IOOyU室温条件下孵育lh。
[0115] 3洗涤:先将96孔板拍干后，每孔加满洗涤液，静置30~60s，倒出洗涤液后轻轻拍 干，重复清洗5次。
[0116] 4加样:每孔精密加入稀释的（1:100)待测血清样品IOOyL，每份血清样品3孔平行 操作，室温条件下孵育lh。
[0117] 5洗涤：同步骤3。 6加酶标结合物:每孔精密加入稀释的酶标结合物IOOyL(空白孔除外），室温条件 下孵育Ih。
[0119] 7洗涤：同步骤3。
[0120] 8显色:每孔精密加入新配制的显色剂IOOyU室温条件下孵育15min。
[0121] 9终止反应:每孔精密加入终止液I OOyL。
[0122] 10测吸收度:终止反应后15min内用酶标仪在双波长(490和630nm)测定吸收度。
[0123] 1.4.3首次注射PT对抗PEG IgM影响
[0124] 由图9-10可知，首次注射lO.Omg · kg-Ι的TPGS可引起抗PEG IgM的显著升高（p> 0.05)，其余剂量未见显著性变化。不同剂量的PT抗PEG IgM与对照组相比，未见显著性差异 (ρ>0·05)。
[0125] 实施例6
[0126] 按照实施例1的方法制备得到不同聚合度的PSA-TPGS载药性能研究(PSA聚合度为 10、50、100、200, TPGS 中 PEG 分子量为 1000)
[0127] 精密称取PSA-TPGS 150mg，和5mg卡巴他赛于西林瓶中，加入适量乙醇溶解后，并 加入等量水超声3min使药物载体混合均匀。在室温条件下，向其中快速注入生理盐水至总 体积IOmL，并振摇成均相，得到澄清透明的胶束溶液，过0.22μπι滤膜。
[0128] 表5不同PSA聚合度的PSA-TPGS制备胶束的包封率
[0130]由结果可知，PSA的聚合度对PSA-TPGS的载药性能具有一定影响，聚合度为50~ IOO的PSA-TPGS制备的胶束具有较佳的包封率。
[0131] 实施例7
[0132] 按照实施例1的方法制备得到不同PEG分子量TPGS制备的PSA-TPGS载药性能研究 (PSA 聚合度为 100，TPGS中PEG分子量为500、1000、5000)
[0133] 精密称取PSA-TPGS 150mg，和5mg紫杉醇于西林瓶中，加入适量乙醇溶解后，并加 入等量水超声3min使药物载体混合均匀。在室温条件下，向其中快速注入生理盐水至总体 积IOmL，并振摇成均相，得到澄清透明的胶束溶液，过0.22μπι滤膜。
[0134] 表6不同PEG分子量的PSA-TPGS制备腔東的包封率
[0136] 由结果可知，对于聚合度为100的PSA来说，PEG的分子量对PSA-TPGS载药胶束包封 率的影响呈现先增加后降低趋势，PEG分子量为1000时最佳。
[0137] 实施例8
[0138] PSA-TPGS与EPC制备混合胶束的载药性能研究(PSA聚合度为100，TPGS中PEG分子 量为1000)
[0139] 精密称取EPC、PSA-TPGS 150mg(EPC: PSA-TPGS = 2:1，w/w)，和5mg卡巴他赛于西林 瓶中，加入适量乙醇，50°C水浴溶解后，并加入等量水超声3min使药物载体混合均匀。在室 温条件下，向其中快速注入生理盐水至总体积10mL，并振摇成均相，得到澄清透明的胶束溶 液，过0.22μπι滤膜。所得胶束包封率为99.5 %，12h内稳定性良好。
[0140] 实施例9
[0141] 精密称取TPGS、PSA-TPGS 150mg(TPGS: PSA-TPGS = 2:1，w/w)，和5mg多西他赛于西 林瓶中，加入适量乙醇溶解后，并加入等量水超声3min使药物载体混合均匀。在室温条件 下，向其中快速注入生理盐水至总体积10mL，并振摇成均相，得到澄清透明的胶束溶液，过 0.22μπι滤膜。其中PSA聚合度为100，TPGS中PEG分子量为1000,所得胶束包封率为99.6%， 12h内稳定性良好。
[0142] 实施例10
[0143] PSA-TPGS(PSA聚合度100，TPGS1000修饰的阿帕利丁(Aplidine)脂质囊泡的制备。
[0144] 表7PSA-TPGS修饰的阿帕利丁脂质囊泡处方 阿帕利丁 10mg:
[0145] 司.盘 6.0 100 mg PSA-TPGS 50 l-ng
[0146] 制备方法:称取处方量的阿帕利丁、司盘60和PSA-TPGS，用氯仿溶解，40°C条件下 减压旋干溶剂，向其中加入预热至65°C的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，搅拌水化45min，过0.22μ m微孔滤膜即可。实验结果表明，所得阿帕利丁脂质囊泡的平均粒径为92.3±4.5nm，包封率 为99.4 %，4°C放置1个月稳定性良好。
[0147] 实施例11
[0148] PSA-TPGS(PSA聚合度50，TPGS1000)修饰的辅酶QlO乳剂的制备
[0149] 表8PSA-TPGS修饰的辅酶QlO乳剂处方 Lmbij 制爸万法：称取处万重
去呙于水中，作为^^相预热至55°C备用，另称 取处方量辅酶QHKMCT及DOPC于55°C下搅拌至全部溶解，作为油相。将水相缓慢滴加入油相 中，高速分散，再经探头超声(200w X 2min; 400w X 6min)处理后，过0.22μηι微孔滤膜即可。
[0152] 实验结果表明，所得辅酶QlO乳剂的平均粒径为122.7±6.4nm，4°C放置1个月粒径 无明显变化，也无分层和乳滴合并现象，制剂稳定性良好。
[0153] 实施例12
[0154] 1S180瘤株的接种
[0155] 取出液氮中保存的S180细胞冻存管，置于37°C温水中复苏。将复苏的S180细胞悬 液接种于小鼠腹腔内（〇.2mL/只），7天后，无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜 下计数，肿瘤细胞活度大于95%，加生理盐水稀释成细胞混悬液，调整稀释倍数，使细胞混 悬液的瘤细胞数为1.8X107cell S ·πι I/1。将肿瘤细胞混悬液接种于正常小鼠右前腋下的 皮下组织，每只小鼠接种0.1 mL，共接种36只。
[0156] 2实验方案
[0157] 将36只接种S180瘤株的小鼠随机分为6组，每组6只，分别为（1)对照组（5%Glu: 0.2mL/只）；（2)Tween 80/DTX溶液组（DTX:10mg · kg-1L(S)TPGS组（TPGS:200mg · kg-1L (4)PSA-TPGS组（PSA-TPGS: IOOmg · kg-1JPGSdOOmg · kg-1L(S)TpGSZDTX胶束组（DTX: IOmg · kg-1JPGSdOOmg · kg-1L(G)PTAtTX组（DTX: IOmg · kg-SPSA-TPGS: IOOmg · kg-S TPGS:200mg · kg-4。
[0158] 接种后分别于第3、6、9、12、15天尾静脉注射给药，在整个试验过程中，记录肿瘤体 积、体质量、死亡事件、摄食饮水量等。
[0159] 3肿瘤生长曲线图
[0160] 在30天的观察期内，每隔一日用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，按公式V = 0.5(aXb2)计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，结果如图11所示。
[0161]由图11可知，在实验周期中，各组小鼠肿瘤体积均有所增加，但程度不同，在荷瘤 第30d时，肿瘤体积大小顺序为：5%Glu组〉Tween 80/DTX组〉TPGS组〉PT组〉TPGS/DTX组〉PT/ DTX组。各空白胶束和DTX制剂组均对S180肿瘤有一定的抑制作用，其中PT/DTX组的抗肿瘤 作用最为明显。值得注意的是，PT空白胶束的抗肿瘤作用优于Tween 80/DTX。
[0162] 4体积抑瘤率变化曲线和肿瘤曲线下面积
[0163] 目前，在评价药物或制剂的抗肿瘤活性时，一般采用体积抑瘤率或质量抑瘤率作 为指标。计算方法分别为，质量抑瘤率％ = (WN-Ws)/WNX 100%。其中，WN:对照组平均瘤重； Ws:给药组平均瘤重。体积抑瘤率％ = (VN-Vs)/VNX 100%。其中，Vn:对照组平均瘤体积;Vs: 给药组平均瘤体积。研究中多使用某一个时间点的抑瘤率，来反映整个给药期间药物或制 剂的抗肿瘤的作用，因此时间点的选择对各药物或制剂疗效的差异影响巨大。为了反映制 剂在整个肿瘤生长过程中所发挥的作用，以每日的体积抑瘤率对时间作图，结果见图12。并 选取变化相对平稳的时间段，即18~30d，求出平均体积抑瘤率，结果见表9。
[0164] 表9各治疗组肿瘤体积抑瘤率(n = 6)
[0166] 从表9中数据可知，PT/DTX的抑瘤效果最佳，PT空白胶束也具有一定的抑瘤效果。
[0167] 肿瘤的生长不是一个匀速的过程，无法用数学方程拟合，为了比较各药物或制剂 在整个实验过程的所发挥的作用，本文引入了另一参数一一肿瘤生长曲线下面积(Area under the tumor growth curve，AUTGC)以及AUTGC抑瘤率（IRautg。％)来对各个药物在整个 抑瘤实验中的优劣进行比较，结果见表10。
[0168] 表10各治疗组肿瘤生长曲线下面积抑制百分率(n = 6)
[0171]从表10中数据可知，PT/DTX的抑瘤效果最佳，其次为TPGS/DTX。空白胶束组均具有 一定的肿瘤抑制效果，且优于Tween 80/DTX组。平均体积抑瘤率和AUTGC值仅仅是反映药物 治疗效果的一个方面，对于一个药物或制剂的评价，还需要结合生存分析、生命质量等多个 指标综合考虑。
[0172] 5生存分析
[0173] 记录整个实验过程中小鼠的死亡事件，使用Origins. 0绘制生存分析曲线并借助 Kap I an-Me i er分析法计算中位生存时间，结果见图13和表11。
[0174] 表11荷瘤鼠的中位生存时间(n = 6)
LUI /〇」 对照纽_十仪土仔Η、」I日」刀ZU穴，仓东约姐；t>J_庇Λ人一疋程皮上脏何熘鼠 tfJ 土仔H、J 间。值得注意的是，PT组、PT/DTX组可以显著延长荷瘤鼠的生存时间，与对照组和Tween 80/ DTX相比中位生存时间可分别延长约50 %、34%，且PT/DTX组在实验周期中仅有1只荷瘤鼠 死亡，生存率可达83.3%。
[0177] 6荷瘤体重与去瘤体重
[0178] 传统指标如肿瘤体积变化及肿瘤缓解率已不能全面评价肿瘤患者的医疗结局，因 此生存质量(quality of life，Q0L)这一指标的提出可全面、客观、真实地评价肿瘤患者的 医疗结局。基于对生存质量的不同认识，目前发展了许多用于肿瘤患者生存质量的评估方 法，其中一项重要的指标为体重、摄食变化。
[0179] 由图14可知，对照组和各制剂组的荷瘤鼠体重均逐步增长。除对照组外，PT组增长 最为显著。各载药胶束组均出现先下降后增长的整体趋势。与其他两组DTX制剂相比，PT/ DTX组从12d开始荷瘤鼠的体重持续增长，且停药后增长最为迅速，表明其相对较低的毒性。 Tween 80/DTX组和TPGS/DTX组虽然于停药后体重出现短暂的上升，但由于其未能充分抑制 住肿瘤，导致生存质量下降，第22天开始呈现下降的趋势。
[0180] 各组小鼠死亡后，将肿瘤剖出，计算各组肿瘤密度，并通过肿瘤密度计算实时瘤质 量。图15为各组小鼠扣除肿瘤质量后的去瘤体重变化曲线，可以发现PT组的去瘤体重增长 最快，其次为PT/DTX组，而对照组的体重增长并不明显，其他两种载药胶束均为平稳下滑趋 势。这种趋势与荷瘤体重的变化曲线并不相同，说明对照组和TPGS/DTX组体重上升主要是 由于肿瘤的快速增长所引起的。
[0181] 7荷瘤鼠的摄食量与饮水量
[0182] 接瘤后隔日测量小鼠摄食、饮水量，绘制小鼠摄食、饮水量变化曲线，结果见图16 和图17。
[0183] 由图16和图17可知，对比各组摄食和饮水量发现，PT组摄食和饮水量一直处于较 高水平，与对照组接近。各载药胶束组于停药后摄食和饮水量均存在明显增加，以PT/DTX组 最为显著。除PT/DTX组外，随着肿瘤的生长，其余各组小鼠摄食和饮水量均有所降低。
[0184] 8免疫学损伤评价
[0185] 脾和胸腺均是体内重要的免疫器官，因此采用脾指数和胸腺指数来评价各制剂对 荷瘤动物免疫器官的毒性。将36只荷瘤小鼠随机分为6组，于肿瘤接种后第3、6、9、12、15天 分别注射5%Glu、Tween 80/^^^、1?63、？1\1?63/17^和?17^^^，第16天处死动物并剥离脾和 胸腺，称重并计算指数。结果见图18。
[0186] 脾指数(mg · g-1) =实验组小鼠脾质量/实验组小鼠体重(4-1)
[0187] 胸腺指数(mg · g-1) =实验组小鼠胸腺质量/实验组小鼠体重(4-2)
[0188] 结果显示，与对照组相比，各载药胶束组的脾指数均存在显著性差异（p〈0.05， compared with5%Glu)，其中TPGS/DTX组的脾指数为最低。空白胶束组均未出现脾显著性 减小的现象。类似的，在胸腺指数上，仅TPGS/DTX与对照组相比存在胸腺显著性减小的现象 (p〈0.05，compared with5%Glu)，而空白胶束组均未发现此现象。上述结果表明Tween 80/ DTX、TPGS/DTX、PT/DTX均会对免疫系统产生损伤，其中TPGS/DTX相对损伤性最强;而TPGS和 PT空白胶束均不会损伤免疫系统。
【主权项】
1. 一种偶联物，其特征在于：由PSA和TPGS接枝而成。2. 如权利要求1所述的偶联物，其特征在于:PSA聚合度在50-200之间。3. 如权利要求1-2任一项所述的偶联物，其特征在于:TPGS中PEG分子量在500-5000之 间。4. 制备权利要求1-3任一项所述偶联物的方法，其特征在于：以TPGS与PSA为原料，甲酰 胺为溶剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺为催化剂 所得到的产物。5. -种载药胶束，其特征在于:按比例称取PSA-TPGS，活性成分于圆底烧瓶中，活性成 分的重量为PSA-TPGS重量的2-20%，加入适量有机溶剂，优选二氯甲烷，超声10-20min使其 充分混匀后，减压旋转2蒸发除去有机溶剂，真空干燥过夜除去残留溶剂，得干燥透明的药 膜，水浴加热至50-70°C，使固体骨架融化后，加入PSA-TPGS重量体积比为10-20:1的同温度 水，搅拌20-40min水化，冷却至室温，过0.22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液。6. -种载药胶束，其特征在于：按比例称取PSA-TPGS于西林瓶中，加入PSA-TPGS重量体 积比为10-20:1的水溶解。将活性成分溶于有机溶剂中，优选丙酮、乙醇、叔丁醇，活性成分 的重量为PSA-TPGS总重量的2-20%，30-50°C水浴加热搅拌条件下快速滴加入西林瓶中，继 续搅拌10_20min直至有机溶剂完全挥去，冷却至室温，过0.22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶 液。7. -种载药胶束，其特征在于:按比例称取PSA-TPGS，和重量为PSA-TPGS重量的2-20 % 的活性成分于西林瓶中，加入适量有机溶剂溶解后，并加入与有机溶剂等体积的水超声2-5min使药物载体混合均匀。在室温条件下，向其中快速注入生理盐水至有机溶剂的浓度为 5-10%，并振摇成均相，得到澄清透明的胶束溶液，过0.22μπι滤膜，即得透明载药胶束溶液， 优选有机溶剂为乙醇。8. 权利要求1-3任一项所述的偶联物在制备药物载药系统中的应用。9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于:药物载药系统为胶束。10. 如权利要求7-8任一项所述的应用，其特征在于:药物载药系统中还含有活性成分。
【文档编号】A61P35/00GK106075467SQ201610457682
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】邓意辉, 宋艳志, 田清菁, 刘欣荣, 王旭玲, 苏钰清, 全晶晶, 李博群
【申请人】沈阳药科大学