脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用的制作方法

专利名称：脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，尤其涉及用于预防或治疗结核病 的疫苗及其制备方法和应用，特别是一种脱乙酰壳聚糖递送系统组装 的结核基因疫苗及其制备和应用。
背景技术：
结核分枝杆菌感染导致的结核病的死灰复燃是当今全球重大的
健康问题，由于人口密集度和流动性日益增加、常规BCG疫苗的无效 性、结核耐药菌株的出现、以及AIDS病导致的结核并发感染，目前 结核发病及死亡非常严重，全球每年有800万活动性结核患者并导致 300万死亡；我国约有5.5亿人口曾经感染结核，每年13万人死于结核， 每月约有12万新发病人。2006年结核己一跃成为我国感染性疾病发病 的首位，研制新型结核预防疫苗非常迫切。
结核研究表明，结核杆菌主要感染肺部巨噬细胞。诱导Th1型的 细胞免疫应答对于清除结核杆菌至关重要，诱导CD4+Th1及其分泌 的高水平的IFNy，不仅能够增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，还可以 通过促进CD8 + CTL的诱导发挥特异性杀伤结核感染细胞，发挥免疫 保护作用。基因疫苗或称DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表 达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原， 通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈途径被DC细胞提呈，有效激 活CD4+Th1禾口CD8+T细胞，因此特别有利于诱导Th1型免疫应答。
除诱导Th1型细胞免疫应答至关重要以外，诱导肺粘膜局部的粘 膜T细胞免疫应答同样非常关键。结核杆菌主要通过呼吸道粘膜入侵机体，粘膜免疫是人体免疫的第一道防线，可在感染的早期和最初感 染部位有效控制感染，防止感染扩散。诱导呼吸道和肺部特异性粘膜 免疫应答，对于有效控制结核早期感染具有非常重要的意义，因此结 核特异性粘膜免疫的诱生成为新型结核疫苗研制的热点问题。通过呼 吸道给予DNA疫苗可更好地模拟结核杆菌的天然感染，诱导特异性粘 膜免疫，在粘膜局部感染的第一时间清除病原体，可能会产生更为有 效的抗结核免疫保护作用。
然而，通常粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，这是由于
粘膜局部纤毛的频繁摆动、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使 得外来抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通过粘膜疫苗递 送系统来对DNA疫苗进行组装，而后在粘膜部位免疫。
因此，应用申请人过去申请的脱乙酰壳聚糖递送系统(一种含粘 膜佐剂的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统和其应用。专利申请号-200610147575.1)，根据这一专利的方法，再以申请人过去申请的基 于T细胞表位的结核基因疫苗(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其 制备方法和应用。专利申请号200710171416.X)为基础，以特定 性质的一种chitosan天然多糖通过共聚沉淀的方法与结核基因疫苗 形成chitosan-DNA纳米颗粒复合物，而后进行滴鼻免疫，诱导结核 特异性全身和肺部T细胞应答。

发明内容
本发明的目的在于提供一种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核 基因疫苗及其制备和应用，所述的这种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的 结核基因疫苗要解决现有技术中由于常规BCG疫苗的无效性、以及结 核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核伴发感染使得现有疫苗预防 和治疗结核病的效果不佳的技术问题。本发明提供了一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫 苗，由脱乙酰壳聚糖与结核抗原编码质粒组成，所述的结核抗原编码 质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核杆菌热休克蛋白的 全长基因，所述的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有
来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞 表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因，结核杆菌 Ag85A蛋白的369 405位基因，结核杆菌CFP-10蛋白的162 207 位基因，结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因。
进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选 自pcDNA3.1质粒、或pVAXl质粒。
进一步的，所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列 如SEQIDNO: l所示。
进一步的，所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65基因的DNA序 列如SEQIDNO: 2所示。
进一步的，所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的氨 基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步的，所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的 DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨 基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步的，所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因的 DNA序列如SEQ ID N0:6所示。
进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨 基酸序列如SEQ ID N0:7所示。
进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步的，所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨 基酸序列如SEQ ID N0:9所示。
进一步的，所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因的 DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
进一步的，在结核杆菌的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438 位碱基后插入结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位碱 基后插入结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位碱基 后插入结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因和结核杆菌Ag85B 蛋白的420 459位基因。
进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因和所 述的结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因之间以gccgcctac基因 序列相连接。
进一步的，所述的结核基因疫苗，嵌合了结核杆菌4个T细胞表 位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的 基因蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:ll所示。
进一步的，所述的结核基因疫苗，嵌合了结核杆菌4个T细胞表 位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的 基因的DNA序列如SEQIDNO: 12所示。
进一步的，所述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，所用的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000 420000之间，脱 乙酰度为75%-85%。
进一步的，所述的结核抗原编码质粒的构建方法，包括以下步骤-
1) 提取结核分枝杆菌DNA作为模板，通过PCR方法扩增结 核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；2) 以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过 PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1 、片段 2、片段3，所述的片段l的双链DNA的序列为
taccggttct
gccctcgccg cgggagcggc
ttcttC3CCC
ctggaggatc gacctcctsg
gatgscgtcg ctsctgcsgc
gagggcctgc ctcccggscg
6taggccgtgg ttccggcscc
ctcgtct33C
gcgatttcgg cgctss3gcc
C33ttgcgtai gttsatcgc3t
t3cgccaittt
gtgcccccsc cscgggggtg
cgt3cg3g33 gcatgctctt
ccggtgscgg ggccsctgcc
gc3scgtcgc cgttgcaLgcg
tcttccsgtg
cggccsccga gccggtggct
cgggtg3CC3 gcccactggt
gctgcttctc
ggtg3cattg ccactgtaaic
ctsgtggttg
gstcggcgcc ctsgccgcgg
cscc3cg3cg gtggtgctgc
ggccggcgcc ccggccgcgg
cgagsccctg gctctgggac
cg3Cttgttg
gtccstcg csggtsgc
gcccgtcgcg cgggc3gcgc
ggccccssgg ccggggttcc
gstggtgtgt
Ct3CC3C3C3
gagctggtca ctcgsccagt
gccsccgtgc cggtggcacg
sacccgctcg ttgggcgsgc
ctcsagggcg gsgttcccgc
gcgctgcsga cgcg3cgtct
gcctcgsgcg cgg3gctcgc
gccgcsscgt cggcgttgc3
ccstcgcc33 ggtsgcggtt
3ag3ggt3gc ttctccatcg
tggcccsggc accgggtccg
gtctcs3aicg csgsgtttgc
ccssggsggt ggttcctccs
scctggcgcg tggsccgcgc
gggcttgasc. cccgsscttg
cgtcctggaa gcsggscctt
cctctagctc
gttcttctgg
gttggttcgc caaccsagcg
cggcstcgai3 gccgtagctt
gctctggttc
g3cgatcgc3 ctgct3gcgt
所述的片段2的双链DNA的序列为
gcttcttcgg cgsagssgcc
ctcctcsggt
ggctscstct ccgatgtaga
CCCt3C3tCC
gggstgtsgg
gagasggtca ctcttccsgt
gcgctgtccs cgcgscaggt
gctcccggct cgsgggccgs
ggtc3ggtgs ccagtccact
ggc33ggccc ccgttccggg
gacaccgacg ctgtggctgc
tccg3ctscg 3ggctg3tgc
gtgatcasgg C3ctsgttcc
gtggtgcgct c3cc3cgcg3
gggtg3cc3 ccc3ctggt
cgctgacgct gcgsctgcgs
3cscctttgg tgtgg333cc
cggggt3ctt gcccc3tg33
tgctggtcsg 3cgscc3gtc
tcggagccgg 3gcctcggcc
ccctggtcgt gggscc3gca
tcggcgsccg egccgctggc
tcdgcgaiags agtcgcttct
gcssggtcgt cgyyccagca
ccstcgccgg ggtagcggcc
3ccgtg3g33 tggcsctctt
ccggtgccgc ggccscggcg
sggttcttcg
gtccstcggt csggtagcca
ggcgstggsc ccgctacctg
gctgcagctc cgdcgtcgag
cgtgsccg3c gcsctggctg
ctcc3sggtg gsggttccsc
tssgccgctg sttcggcgac
caacasgatc gttgttctag
ccgc3aLggcg ggcgttccgc
ggtcggcctg ccsgccggsc
ggtcscc3sg ccsgtggttc
acgagtggcc tgctcaccgg
gctgcsggag cg3cgtcctc
C3ccg3ggtc ggcg€tccgc
3gcc33t33g tcggtt3ttc
g3cctgstcg ctggsctagc
ggccscccgt
gsgctc3ccg ctcgstgtggc
ccggetgcgtc ggcctcgcag
tccactgtca 3ggtgacsgt
ctgstc3tcg gsct3gt3gc
cgcggcscct gcgccgtggs
3tgctgcsgg taicgscgtcc
tgcgscctct
g3cg3g3cc3 ctgctctggt
cagstccgcc gtctsggcgg
cggctggcc3 gccgaiccggt
cttgagttcc
csga3gcsgg gtcttcgtcc
ccgsgggtct ggctccc3g3
scgagggcgt tgctcccgcs
sgggt3tgcg tccc3t3cgc
sggsggcggt tcctccgccs
sggstctgct tcctsgacgs
ccgsggacgt ggctcctgca
tC3sgtcggt 3gttcsgcc3
atatggccat t3tsccggt3
3cgccg3cct tgcggctggs
ccstcgtcgs ggtagcagct
3ggsgatcg3 tcctctagct
agctggccgg tcgatccggcc
tcgcgttcgt
33ctcgccgc ttgsgcggcg
ttcgatggct
catcaccgtc gtsgtggcag
gttcg3c33g casgctgttc
cctggaggsc ggscctcctg
gccgctgctc cggcgacgag
cgsgggcgsg gctcccgctc
ggcggtcasg ccgccsgttc
tctcaccggt sgsgtggccs
gtcgctgcts C3gcgscg3t
gggcgccggt cccgcggcca
gascagcgac cttgtcgctg
tggtgtcgcg 3ccscsgcgc
ccgc3tcgeig ggcgtsgctc
ctscc gstgg
12所述的片段3的双链DNA的序列为
ttcatctacg
gtcgsggaggcsgctcctcc
gscgsgctgsctgctcgsct
gsggccccgccaccggggcg
33ggtgcgca1ttccscgcgt
ctgctcgctg
gcgtccstcgcgcaggt3gc
gsgsaggcttctcttccgss
gg 3sctcgccgc ctaiccsgcsgcc ttgagcggcg gatggtcgtc
csaggccgccgttccggcgg
cccgsccctggggctgggac
ggtggcgctgccaccgcgac
ggtggccgaigcc3ccggcgc
ctscg3gg3tgstgctcct3
gcagaatgcgcgtcttscgc
gccgg3333gcggccttttc
ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgcggccgagcga c6Lgccgggac gacctacgcc aagcgttacg
gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcsagcggccgtsgcsgcg gccsccccc3 cactgcgaca scgttcgccg
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tgsagcsgat cgccttcaac tccgggctgg sgccgggcgtacttcgtcts gcggssgttg aggcccgscc tcggcccgca
scctgccggc tggcc3cgg3 ctgsscgctc agsccggtgttgg3cggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccacs
ccggcgttgc tgscccggtc saggtgaccc gttcggcgctggccgcsscg sctgggccsg ttccactggg cssgccgcga
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ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggstttcccgaatgggcc accgccgctg tscccaccgt acctssag;
3)将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了 4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经EcoRI和Hind III双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的结核抗原编码质粒。
进一步的，是以SEQIDNO: 13所示的HSP65上游引物和SEQ
ID NO: 15所示的引物HSP65T1序列通过PCR扩增片段1。
进一步的，以SEQIDNO: 16所示的引物HSP65T2序列和SEQ
ID NO: 17所示的引物HSP65E1序列通过PCR扩增片段2。
进一步的，以SEQ ID NO: 18所示的引物HSP65E2序列和SEQ
ID NO: 14所示的HSP65下游引物通过PCR扩增片段3。
具体的，是将上述的片段1和片段2混合，热变性使各自成为
单链DNA，由于片段l、 2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互
补成为双链，再通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与
片段3混合，热变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，用SEQIDNO: 13所示的HSP65上游引物和SEQIDNO: 14所示的下游引物经PCR可扩增获得片段(1+2+3)，即嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因。
进一步的，所述的结核分枝杆菌DNA自结核分枝杆菌H37Rv株。
进一步的，所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAXl质粒。本发明还提供了一种制备上述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗的方法，包括以下步骤
(1) 构建结核抗原编码质粒pECANS;
(2) 将0.01~0.04%浓度、PH5.5-5.7的脱乙酰壳聚糖溶液，与50 400昭/ml pECANS质粒溶液在50-60 °C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳聚糖溶液中，所述的脱乙酰壳聚糖的分子量在38000 420000之间，脱乙酰度75% 85%，所述的质粒DNA溶解在5mM 25mM的Na2S04中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳聚糖-pECANS纳米颗粒为球形，直径在50 200nm之间。
本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。
本发明还提供了上述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。
本发明通过DNA预测软件，从结核分枝杆菌的已知的4种关键抗原Ag85A、 Ag85B、 ESAT-6和CFP-10中各自筛选了一个T细胞表位，共4个T细胞表位，拟构建含有4个T细胞表位的结核靶抗原编码质粒。
14由于表位的氨基酸序列仅有8 — 20个，结构太小和简单，免疫原性很弱，通常不能诱导很强的免疫应答。因此拟挑选一种载体基因，将4
个T细胞表位插入载体基因中，共同构成结核外源目的基因。
本发明选择结核杆菌来源的热休克蛋白65 (HSP65)作为嵌入T细胞表位的基因载体。HSP65是热休克蛋白60家族成员，在细菌到人体细胞有很高的同源性。全长1623bp，编码540个氨基酸，分子量65kD。选择结核杆菌来源HSP65作为嵌入T细胞表位的基因载体的原因有两点1、 HSP内含有多个结核T细胞和B细胞表位，本身就是重要的免疫保护性抗原，已证实HSP65作为目的抗原免疫小鼠可产生抗结核强保护性免疫应答，且与产生IFN-Y的CD8VCD44hi细胞有关。2、HSP作为细胞内伴侣蛋白，参与蛋白质转位、折叠和装配，可帮助嵌入的表位更好地折叠形成空间结构。
本发明选择的4个T细胞表位来自以下4种结核抗原
1) Ag85A， 295氨基酸。结核菌的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(antigen 85 complex),由Ag85A、 Ag85B、 Ag85C组成的相对分子质量为38000蛋白家族。Ag85A可刺激机体产生体液免疫，也可激发Thl型细胞免疫，诱导CD8+T细胞增殖和IL-2及IFN-y等上升。
2) Ag85B，蛋白质全长285氨基酸，分子量34.6KD。又称MPT59、Rvl886，是一种分枝杆菌转移酶，与细菌细胞壁合成有关，具有多个T细胞表位，能诱导Thl反应、IFN-Y的产生。
3) ESAT-6，又称Rv3875，全长288bp， 95个氨基酸，分子量9.9KD，仅在强毒株中有这种抗原。含有多个T细胞表位，能激活CD4+、 CD8+T细胞，在抗结核保护性免疫应答中起重要作用。ESAT-6还可刺激Mtb病人的外周血T细胞增殖，促进IFN-Y释放。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠具有较好的保护性。
4) CFP-IO，低分子量结核杆菌培养滤液蛋白，全长303bp， IOO个氨基酸，分子量10000，与结核分枝杆菌毒力有关，刺激机体产生强烈
的T细胞免疫应答并释放高水平的IFN-Y。
BCG传代过程中ESAT-6和CFP-10基因丢失，而在绝大多数毒株
中这两个基因都存在。
本发明通过BLAST网络数据库比对、DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段；然后通过网络数据库(http:〃www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析予页测这些区段中存在的T细胞抗原表位、同时与HLAI、 II类分子可高亲和力结合的表位。经过计算机分子预测最后获得的4个T细胞表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因(EAST-6189—228);结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369-4()5);结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_207);结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42(M59)。分别插入到HSP65基因的第438位碱基、第486位碱基、第1185位碱基后，构建结核靶抗原编码质粒。
本发明在pcDNA3.1或pVAX1质粒中，插入一段结核外源目的基因，作为靶抗原编码质粒，该结核外源目的基因由4个结核T细胞表位嵌合到结核HSP65蛋白的3个非关键结构位置所共同构成，经分析，4个表位的嵌入不会影响HSP65本身的正常三级、四级空间结构，因此将这一嵌合有4个T细胞表位的HSP65基因的靶抗原编码质粒称为ECANS (Epitope Cast in ANatural Structure, ECANS)。
本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。
进一步的，所述的结核基因疫苗的粘膜免疫方法如下
1) 首先对动物进行轻度麻醉；
2) 在鼻腔、口腔或生殖道内逐滴注入脱乙酰壳聚糖-pECANS纳
16米颗粒，
3) 二周后重复1) +2)的免疫过程，
4) 共免疫3 4次，pECANS DNA总量在150 200凶。
本发明采用的脱乙酰壳聚糖(chitosan，化学名为P-(l—4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)是甲壳类动物来源的天然生物多糖，是几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物，完全无毒，具有生物可容性和生物可降解性。更重要的是脱乙酰壳聚糖天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜天然静电吸附，因此具有增强粘膜黏附吸收作用；此外还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。
以合适分子量和脱乙酰度的脱乙酰壳聚糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的脱乙酰壳聚糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在50-200nm的纳米颗粒复合物。具体选择0.02。/。浓度、PH.5.7的脱乙酰壳聚糖(分子量约400000，脱乙酰度75% 85%)溶液，与400iLig/ml编码靶抗原的质粒DNA(pcDNA3.1载体构建)溶液(5mM Na2S04),在55。C下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了脱乙酰壳聚糖-结核耙抗原DNA纳米颗粒。
本发明中，将chitosan-pECANS结核基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行以常规小鼠麻醉方法轻度麻醉小鼠，将小鼠鼻孔向上，以枪头吸取<20|11液体直接逐滴滴入鼻腔内，待液滴随小鼠呼吸自主进入呼吸道后，再滴下一滴液体。可交替滴入两个鼻孔。液体总体积不宜超过5CVI。
本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于pcDNA3.1 、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。本发明中，"药学上可接受的"成分是适用于人和动物而无过度 不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。
本发明中，"药学上可接受的载体"成分是用于将具有活性的有 效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所 述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于水、PBS 缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。
本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载 体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介
质中，pH值通常约6—8。
综上所述，本发明公开的一种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的多表
位ECANS结核粘膜基因疫苗，具有以下三大特性
1 )其核心是一种已申请专利的pECANS多表位靶抗原编码质粒 (基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请 号200710171416.X)，其中编码的结核耙抗原包括结核杆菌HSP65 蛋白基因，和嵌入其中的4个结核杆菌优势抗原来源的4个T细胞 表位，理论上含有至少5种结核抗原，可诱导多抗原特异性的、更有 效的抗结核免疫保护作用。
2) 通过已申请专利的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统chitosan ( — 种含粘膜佐剂的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统和其应用。专利申请号 200610147575.1 )，与上述pECANS质粒DNA形成共聚复合物后， 再通过粘膜途径接种DNA疫苗，具有安全无毒性、缓释性、亲粘膜 性等多种优势，可促进粘膜局部特异性免疫应答的诱导。
3) 该结核粘膜基因疫苗通过优化免疫途径、免疫程序、免疫剂 量、间隔时间，能更有效地诱导全身和粘膜T细胞和抗体应答。
本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的 chitosan-pECANS结核粘膜疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠，有效诱导针 对多个结核抗原的特异性抗体应答；更重要的是，能诱导全身及肺脏
18粘膜局部很强的结核特异性T细胞杀伤应答，同时可诱导分泌高水平
IFNy的Thl免疫应答，效果显著优于传统BCG结核疫苗。


图1显示了 chitosan-pECANS结核粘膜疫苗的构建示意图。图 A显示了 pECANS结核基因疫苗的构建图；图B显示了 chitosan与 pECANS形成共聚复合物示意图；图C显示了 chitosan-pECANS纳 米颗粒的电镜图。
图2显示了通过HSP65上游引物/T1、 T2/E1、 E2/HSP65下游引 物三对引物分别扩增得到的双链DNA片段1 (l-508bp)、片段 2(491-1315bp)、片段3(1298-1788bp)，而后通过彼此重叠的17个碱 基互补相连得到嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因，其中，粗 体带下划线的序列是插入的4个T细胞表位序列。
图3显示了本发明中嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因的 质粒PCR (图3A)、酶切(图3B)及部分测序鉴定结果(图3C)。
图4显示了 chitosan-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱生 结核特异性抗体血清IgG水平。图A显示HSP65抗原特异性IgG的 水平；图B显示Ag85A抗原特异性IgG效价；图C显示EAST6特 异性IgG效价。
图5显示了 chitosan-pECANS结核粘膜疫苗免疫小鼠诱导的特 异性淋巴细胞杀伤活性。
图6显示了免疫小鼠脾细胞经结核抗原刺激后分泌IFN-y的水平。
图7显示了 chitosan-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫诱生脾脏 特异性IFN-y+T细胞数量。图A显示HSP65抗原特异性IFN-y+T的 水平；图B显示Ag85A抗原特异性IFN-y+T数量；图C显示EAST6 特异性IFN-y+T数量。
19图8显示了 chitosan-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫诱生肺局 部特异性IFN-y+T细胞数量。
具体实施例方式
以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的 使用和用途，而不是限制本发明。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下
结核分枝杆菌标准H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科 提供)。质粒pcDNA3.1(-)、 pVAX、 pET32a、宿主细菌DH5a 、 BL21(lnvitrogen公司)。基因合成委托上海赛百盛公司。chitosan (分 子量在380000 420000之间，脱乙酰度为75%-85%)购自sigma 公司、CFSE和PI染料购自sigma公司、小鼠IFN-y ELISA检测试 剂盒购自R&D公司；HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Sant Clous 公司)；。HSP65蛋白为本实验室自行表达(见200610027572.4号 专利)、Ag85A及ESAT-6蛋白由上海市海归生物科技公司李忠明教 授惠赠、Ag85A 、 ESAT-6多肽委托上海吉尔公司合成、 Upofectamin-2000购自invitrogen公司。限制性核酸内切酶EcoR /、 MA7d/// (TaKaRa公司)、T4DNA连接酶(MBI公司)；TaqDNA聚 合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega 和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、 SDS、 EB (上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回 收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen)。 6-8周 龄雌性BALB/c(H-2d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲 养。动物词养及操作符合国家相关规定。
实施例l: pcDNA3.1-ECANS结核基因疫苗的构建 1、 ECANS结核基因疫苗的目的T细胞表位的预测
20通过BLAST网络数据库、DNAstar生物软件、网络数据库 (http:〃www.syfJ5eithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析，综 合亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性、与HLAI、 II类分子 结合、等参数，预测获得的4个T细胞表位结核杆菌ESAT-6蛋白 的189 228位基因(EAST-6189-228);结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A满5);结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基 因(CFP10162-207);结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因 (Ag85B420—459)。
以pcDNA3.1或pVAX为质粒载体，以结核分枝杆菌HSP65基 因作为嵌合表位的基因载体，在计算机预测其二级结构的基础上，在 其中不影响关键结构的位置第438位碱基后插入ESAT-6189 228表 位基因、第486位碱基后插入Ag85A369 405、第1185位碱基后插 入CFP-10162 207和Ag85B420 459， CFP-10和Ag85B之间以 gccgcctac相连接，如图1A所示。
实施例2 pcDNA3.1-ECANS结核基因疫苗的构建
为了不在HSP65基因和T细胞表位基因之间引入酶切位点，本 发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5 '和3'端依次扩 增三段彼此部分重叠的包含部分HSP65基因和T细胞表位的基因片 段，变性后通过彼此重叠的互补序列连接，最后用5'和3'两端HSP65 引物PCR扩增出嵌合有4个T细胞表位的HSP65全长基因。同时在 基因两端分别带上J5coR /和历>^///酶切位点，经双酶切后可连接入 载体pcDNA3.1(-)或原核表达载体pET32a。
首先提取结核分枝杆菌H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结 防科)DNA，作为模板，用HSP65上游引物(SEQIDNO: 13)和 下游引物(SEQIDNO: 14)通过PCR方法扩增获得HSP65片段，回收并纯化PCR产物(华舜公司小量胶回收试剂盒)。
以HSP65基因作为模板，分别以引物HSP65上游引物(SEQID NO: 13)和T1引物(SEQIDNO: 15)通过PCR扩增片段1 (如图 2所示HSP65上游引物和Tl相对，经PCR扩增得到的1 一508bp双 链DNA片段)，所述的片段1的双链DNA的序列为
3tggcc3sga t3ccggttct
gccctcgccg cgggagcggc
a^g^gtggg
ttCttC3CCC
ctggagg3tc gacctcctsg
gatgacgtcg ctactgcagc
gsgggcctgc ctcccggscg
asggccgtgg ttccggcscc
gsgcsgsttg ctcgtctssc
gcgatttcgg cgctsaagcc
caaittgcgts gttsacgc3t
tacgccattt
gtgccccc己c cscgggggtg
cgt3cgatg33 gcatgctctt
ccggtgscgg ggccactgcc
gcaacgtcgc cgttgcsgcg
sgaaggtcsc tcttccagtg
cggccsccgs gccggtggct
cgggtg3cc3 gccc3ctggt
gctgcttctc
ggtgscattg ccactgtaac
ctagtggttg
gaitcggcgcc ctagccgcgg
C3cc3cgaicg gtggtgctgc
ggccggcgcc ccggccgcgg
cgsgsccctg gctctgggac
gctgascssc cgacttgttg
gtccatcg csggtagc
gcccgtcgcg cgggcsgcgc
ggcccc33gg ccggggttcc
gatggtgtgt
gaigctggtc己 ctcgaccsgt
gccaiccgtgc cggtggcacg
ascccgctcg ttgggcgsgc
ctcs3gggcg gagttcccgc
gcgctgcsgs cgcgscgtct
gcctcgsgcg cggsgctcgc
gccgcs3cgt cggcgttgca
ccstcgccs3 ggtsgcggtt
ttctccatcg
tggcccaggc accgggtccg
gtctc3aacg csgagtttgc
ccaaggaggt ggttcctcca
scctggcgcg tggaccgcgc
gggcttg3ac cccgsscttg
cgtcctggaa gcsggscctt
cctctsgctc
gttcttctgg
gttggttcgc casccasgcg
gccgtagctt
cgaig5icc33g gctctggttc
gacgaitcgca ctgctsgcgt
，以T2引物(SEQIDNO: 16)禾C1E1弓1物(SEQIDNO: 17)通过 PCR扩增片段2 (如图2所示T2引物和E1相对，经PCR扩增得到 的491 一 1315bp双链DNA片段)，所述片段2的双链DNA的序列为
gggtgacca gtccatcggt ccc3ctggt csggtagccs
gcttcttcgg cga3g33gcc
g3gg3gtcc3 ctcctcsggt
ggctsc3tct ccg3tgt3g3
CCCt3C3tCC
gggstgtagg
ctcttccsgt
gcgctgtcca cgcgscsggt
gctcccggct cgagggccga
ggtcsggtg3 ccagtccact
ggcaaggccc ccgttccggg
gscsccgscg ctgtggctgc
cgctgscgct gcgactgcga
3C3cctttgg tgtggs3scc
cggggtsctt gccccstgs3
tgctggtcag 3cgsccsgtc
tcggsgccgg sgcctcggcc
ccctggtcgt gggscc3gc3
tcggcgsccg sgccgctggc
tcsgcgaags 3gtcgcttct
gcasggtcgt cgyycc6Lgcs
ccstcgccgg ggtaigcggcc
ggcgatggsc ccgctscctg
gctgcsgctc cgscgtcgsg
cgtgsccgsc gcsctggctg
ctccssggtg gsggttccac
tasgccgctg attcggcg3c
gttgttctsg
ggcgttccgc
ggtcggcctg ccagccggsc
ggtcscc33g ccsgtggttc
3cg3gtggcc tgctc3ccgg
gaicctgstcg ctggactagc
33ggtgggc3 ggccscccgt
gsgctcaccg ctcgagtggc
ccggagcgtc ggcctcgcsg
tccactgtc3 sggtgscaigt
ctgatcatcg gsct3gtsgc
cgcggcscct gcgccgtggs
atgctgcagg tscgscgtcc
scgctggaga tgcgscctct
g3cg3gscc3 ctgctctggt
csgstccgcc gtctsggcgg
ccgsgggtct ggctcccsga
3cg3gggcgt tgctcccgca
agggtstgcg tcccst3cgc
aggsggcggt tcctccgcca
aggatctgct tcctsgscg3
ccgaggscgt ggctcctgca
tcasgtcggt 3gttC3gccs
st3tggcc3t tataccggta
acgccgacct tgcggctgga
ccstcgtcga ggtsgc3gct
3gg3g3tcg3 tcctctsgct
ttcgstggct asgctaccga
cstcsccgtc gtsgtggcsg
gttcgsc6L3g csagctgttc
cctggsggsc ggacctcctg
gccgctgctc cggcgacgag
cgsgggcgsg gctcccgctc
ggcggtcssg ccgccsgttc
tctcsccggt agagtggcca
gtcgctgct3 cagcgacgat
gggcgccggt cccgcggccs
ga3C3gcgsc cttgtcgctg
22tccg3Ctacg accgtgsgss gctgcsggsg cggctggccai sigctggccgg tggtgtcgcg 3ggctgstgc tggcsctctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc sccacsgcgc
gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag csctsgttcc ggccscggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgt3gctc
gtggtgcgct tcc33gaagc agccaataag cag3agc3gg ssctcgccgc ctscc C3ccscgcgai sggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgsgcggcg gaitgg
以E2引物(SEQIDNO: 18)和HSP65下游引物(SEQ ID NO: 14) 通过PCR扩增片段3 (如图2所示E2引物和HSP65下游引物相对， 经PCR扩增得到的1298 —1788bp双链DNA片段)，所述的片段3 的双链DNA的序列为
gg ei己ctcgccgc Ct3cc3gc3g cc ttgagcggcg gatggtcgtc
ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc csaggccgcc asgtagstgc ggccg3gcgs csgccgggsc gacctacgcc 33gcgttscg gttccggcgg
gtcgsggsgg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgscgctgt tgcasgcggc cccgsccctg cagctcctcc cgt3gcsgcg gccsccccc3 C3ctgcgac3 3cgttcgccg gggctgggsc
gscgsgctgs sgctcgssgg cgscgaggcg accggcgccs 3c3tcgtg33 ggtggcgctg ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac
gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag C3ccggggcg acttcgtct3 gcggasgttg sggcccgacc tcggcccgcs ccaccggcgc
aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcg3g tctggccscs g3tgctccts
ctgctcgctg ccggcgttgc tg3cccggtc a3ggtg3ccc gttcggcgct gc3g33tgcg gacgagcgac ggccgcaacg sctgggccsg ttccsctggg c36Lgccgcg己cgtcttacgc
gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacsa gccggaaaag cgcsggtsgc gccccgdcss ggsctggtgg ctccggcsgc sscggctgtt cggccttttc
gagasggctt ccgttcccgg tggcggcgsc atgggtggcs tggstttc ctcttccgaa ccgsagggcc sccgccgctg tscccaccgt acct3aag;
将上述的片段1和片段2混合，变性使各自成为单链DNA，由 于片段l、 2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链， 再以HSP65上游引物和E1引物通过PCR法可扩增获得片段(1+2) 的片段，再与片段3混合，变性成为单链，由于片段2和片段3也有 17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以HSP65上游 引物(SEQIDNO: 13)和HSP65下游引物(SEQIDNO: 14)作 为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段(1+2+3)，即嵌合了 4 个T细胞表位的HSP目的基因即ECANS编码基因(如图2所示)。 PCR鉴定结果显示产物为1807bp，如图3A所示。再将扩增产物经/和历'wd ///双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体
pcDNA3.1(-)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，氨苄青霉素筛选 转化菌落。经酶切(图3B)及测序鉴定(图3C)，成功构建了 pcDNA3-ECANS真核表达质粒。4段表位基因就以没有酶切位点的 方式插入HSP65基因了。
将重组质粒ECANS转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，经LB (AmplOO吗/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGEN PlasmidMegaKit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。
实施例3 pET32a-ECANS原核表达载体的构建及蛋白表达纯化
将扩增得到的ECANS编码基因片段或者HSP65基因用￡"7 / 和/// "///双酶切，与经相应酶切的原核表达载体pET32a连接，构 建了 pET32a-ECANS和pET32a-HSP65原核表达质粒。
以pET32a-ECANS转化大肠杆菌BL21 (DE3 )感受态细胞，37°C 培养过夜，筛选阳性克隆。经LB (AmplOOpg/ml)液体培养基振荡 培养至A600达到0.75左右，加入异丙基硫代半糖苷(IPTG)至终 浓度为0.5mM。继续振荡培养3小时，4000r/min离心20min收集菌 体，lxPBS重悬后超声破碎，12000r/min于4i:离心20min，分别收 获上清和沉淀。上清过亲和层析柱，以不同浓度洗脱液洗脱，收集每 lml洗脱液，保存A280大于1.0的洗脱液，最后经12% SDS-PAGE 电泳鉴定表达的蛋白。最后得到纯化融合蛋白ECANS或HSP65。
实施例4 chitosan-pECNAS结核基因疫苗的制备
1) 质粒DNA的大量制备依照QIAGEN Plasmid Mega Kit进行。
2) 分别制备chitosan溶液和pcDNA3.1-pECANS溶液，方法如 下首先制备0.02。/。、 pH5,7的chitosan溶液，称取0.02g chitosan
24(Fluka, MW约400000，脱乙酰度75%—85%)，先以500|jl-1 ml 1% HAc溶液将其缓慢溶解，37T:放置1hr。而后称取0.042g NaAc，以 80mlH2O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以 1NNaOH调节pH值至5.7，此即0.02%、 pH5.7的chitosan溶液。 pcDNA3.1-pECANS质粒以5mM闪32504溶解，DNA浓度为 1mg/ml， -20^保存备用。
3)采用共沉淀法(共凝聚法)制备chitosan-DNA纳米颗粒， 方法如下在55"水浴中，将0.02%、 pH5.7的chitosan溶液逐滴 滴入400ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡20秒， 即可形成均一略带混浊的chitosan-DNA纳米颗粒(图1B、图1C)。
实施例5 chitosan-pECNAS结核粘膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠
将6-8周BALB/c雌鼠分为9组，其中滴鼻免疫5组，分别为 chitosan-pECANS、 chitosan-pHSP65、 pcDNA3,1-ECANS (简称 pECANS)、 pcDNA3.1画pHSP65 (简称pHSP65)、 chitosan;肌注 免疫3组，分别为pECANS、 pHSP65、 pcDNA3.1;皮下免疫组 BCG，每组6只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0.75%戊巴比妥钠 80-120|jI经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50|jg质粒DNA的 chitosan-pECANS疫苗溶液逐滴滴入小鼠两恻鼻腔。肌注免疫程序 如下以0.75。/。戊巴比妥钠80-120ijl经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。 于小鼠胫骨前肌接种50ijgpECANS质粒DNA疫苗，每腿50|jl。每 两周免疫1次，共4次，质粒总量为200pg。皮下免疫程序如下小 鼠麻醉后，以含有BCG (1x105CFU)的PBS于小鼠背部皮下多点 接种，总量100jjl。每两周经眼眶后眦静脉采血，37。c静置30min， 6000rpmx10min，收集血清，分装冻存于-70。c。
实施例6 chitosan-pECANS滴鼻免疫可诱导结核特异性抗体应答
25间接ELISA法检测免疫小鼠血清中特异的抗结核抗原IgG。以 5吗/mlHSP65蛋白、Ag85A蛋白、ESAT-6蛋白包被聚苯乙烯微孔板 (包被液0.1M Na2C03， pH9.6) 4。C过夜。以5% milk-PBS封闭板， 200ijI/孔，37。C化。依次加1: 50稀释血清、湖口l/孔，37。C1h，洗 板后加HRP-羊抗小鼠IgG 37。C1h，洗板后以邻苯二胺显色30min， 2N H2S04终止反应后测A49o值。
如图4A显示chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗免疫三次以 后在小鼠体内诱生了 HSP65特异性IgG，在免疫第4周即可检测到 HSP65特异性血清IgG，其水平随时间不断增高，于第10周达到 OD值1.03，抗体滴度为1:4200，显著高于对照组。但IgG水平低 于chitosan-pHSP65、 pECANS、 pHSP65滴鼻组和pECANS、 pHSP65肌注组。此外，chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗还诱 导了另外两种结核抗原Ag85A和ESAT-6特异性抗体应答。其中， Ag85A特异性IgG于第10周达到最高，但不高于其他组(图4B); 但其诱导的ESAT-6特异性IgG水平显著高于其他各组，效价达4000 (图4C)。总之，chitosan-pECANS疫苗滴鼻免疫诱导了较强的结 核多个抗原特异性抗体应答。
实施例5 chitosan-pECANS滴鼻免疫可诱导脾脏T细胞的特异性 CTL杀伤和IFNy分泌
1)小鼠脾细胞CTL功能检测
以瞬转pcDNA3.1國HSP65的SP2/0 (SP2/0-HSP65)作为耙细 胞，制备方法如下取5ijg纯化pcDNA3.1-HSP65加入245pl无血 清1640中；取10pl Lipofectamin-2000加入2,1无血清1640中， 分别小心混匀，将DNA逐滴加入到Lipofectamin-2000中，轻轻混 匀，室温静置20min，逐滴加入2x106 SP2/0细胞表面，收集24hr 细胞作为靶细胞。
26取末次免疫后10天小鼠脾脏细胞，重悬于含20U/ml IL-2的完 全1640中，以5"07细胞/孔接种6孔板，加入HSP65蛋白 (200|jg/ml)， 37°C， 5%002体外培养7天作为效应细胞，并以1pm CFSE进行标记。将2x10S个效应细胞/孔接种入96孔圆底板中，同 时以100: 1、 50: 1、 10: 1的比例加入相应数量耙细胞，37°C， 5 %002共孵育4小时，收集细胞，以20|jg/ml Pl进行染色，4。C染色 30分钟后，应用流式细胞术进行CTL检测，计算被杀伤的靶细胞 (CFSEPI+)的百分比。
结果显示，效靶比为50:1时，chitosan-pECANS组特异性杀伤 率达79.66%，高于其他疫苗免疫组和阳性对照BCG组(图5)，提 示chitosan-pECANS基因疫苗有效诱生了较强的结核特异性细胞免 疫应答，有抵抗结核分枝杆菌感染的潜能。 2)小鼠脾细胞培养上清中IFN-Y水平检测
取末次免疫后10天小鼠脾脏细胞，以HSP65蛋白(200ijg/ml)， 体外刺激培养(同上)，取48hr、 96hr、 144hr培养上清1ml，用小 鼠IFN-y ELISA试剂盒(R&D)检测脾脏T细胞分泌IFN-y水平。
ELISA方法以4pg/ml大鼠抗小鼠IFN-y抗体(PBS)包被4°C 过夜；以1。/。BSA-PBS封闭；依次加100lJl细胞培养上清或标准品、 0.4ng/ml生物素标记羊抗小鼠IFN-y抗体，100pl HRP标记链亲和素 (Str印tavidin-HRP),以OPD显色，2NH2S04终止，OD柳nm读数, 绘制标准曲线，计算培养上清中IFN-Y表达量。
如图6所示，与其他疫苗免疫组相比，chitosan-pECANS滴鼻 免疫小鼠脾脏T细胞经抗原特异性刺激后，分泌最高水平的IFN-y， 48hr最高，随后逐渐下降，但至144hr时仍高达1700pg/ml，提示 该疫苗能够有效激活分泌IFN-y的脾脏T细胞，有利于打破因结核杆 菌感染而引起的免疫耐受或免疫抑制状态。 (3)小鼠脾细胞IFN-Y+T细胞的ELISPOT检测以ELISPOT方法直接检测脾脏T细胞中分泌IFNy的T细胞。 以5pg/ml IFN-y包被抗体100ijI/孔4'c包被过夜，吸去孔内液体，用 200|J|完全1640 37°c封闭2hr。去液体，取末次免疫后10天小鼠脾 脏，重悬于含20U/ml IL-2的完全1640中，以1"06细胞/孔加入 ELISPOT板，随后分别加入特异性抗原HSP65蛋白(200|jg/ml)、 表位多肽Ag85A 、 ESAT-6(20|jg/ml)或非特异性抗原 ConA(10(jg/ml),37。c， 5XCO2培养60hr，吸弃各孔液体，加200|jl 冰预冷的去离子水，在冰上放置10min， pbst洗3次。加100ijI生 物素标记的抗小鼠IFN-Y检测抗体(2yg/ml)， 37'c放置1 hr。去液 体，PBST洗3次。加100|j| HRP标记链亲和素(Str印tavidin-HRP)， 37°C1 hr， PBST洗4次，PBS洗2次，拍干。力Q 100|jl AEC底物 避光显色30min，用自来水冲洗终止反应，室温下干燥板，在免疫斑 点成像分析仪下计数斑点。
结果显示，chitosan-pECANS结核粘膜疫苗经滴鼻免疫后，脾 脏hsp65特异性分泌IFN-y的t细胞较其他组最高，达550/106脾 细胞(图7A)。此外，表位Ag85A、 ESAT-6特异性IFN-y+T细胞 数量也最高，分别为400、 280/106脾细胞(图7B、图7C)。提示 chitosan-pECANS可诱生强烈的结核特异性IFN-y+T细胞的产生。
实施例6 chitosan-pECANS滴鼻免疫可诱导肺粘膜局部T细胞的 特异性CTL杀伤和IFNy分泌
1)小鼠肺脏局部淋巴细胞细胞的分离
分离免疫小鼠肺脏局部淋巴细胞，分离方法如下取末次免疫后
10天小鼠肺组织，称重约100 mg/只，剪碎置于消化液中(胶原酶 (1mg/ml)、 DNA酶(5U/ml)、完全1640)， 300mg/10ml消化液，于 37°C摇床180 rpm振摇60min。将混悬液过尼龙指套去除碎块， 1500rpm离心5mjn,细胞重悬于4ml 40% Percoll中，轻柔加至等
28体积70% Percoll上方，2400rpm离心30 min，吸取淋巴细胞，10 ml PBS洗涤1次，重悬于含有20U/ml IL-2的完全1640中，调整浓度 为5xl06/ml备用。
2)小鼠肺脏局部淋巴细胞IFN-y ELISPOT检测 以ELISPOT方法直接检测肺脏T细胞中分泌IFNy的T细胞， 方法同实施例5: IFN-y包被抗体包板，加入5"05末次免疫后10 天小鼠肺脏淋巴细胞，再加入特异性抗原HSP65蛋白(200jjg/ml)、 表位Ag85A、 ESAT-6(20ijg/ml)或ConA(10ijg/ml)刺激培养60hr，加 抗小鼠IFN-y抗体和HRP标记链亲和素，最后AEC底物避光显色。 如图8所示，chitosan-pECANS免疫小鼠肺脏局部HSP65特 异性IFN-y+T细胞数量显著高于其他各组，达到280个IFN-y+ SFC/106肺淋巴细胞。在表位Ag85A、 ESAT-6特异性IFN-y+T细胞 方面，chitosan-pECANS粘膜疫苗同样诱导了最高数目的IFN-y+丁 细胞，分别达290、330个IFN-Y+SFC/1()6肺淋巴细胞；肌注pECANS 组也诱导了的IFN-y+T细胞，分别为160、 170。结果提示， chitosan-pECANS通过呼吸道粘膜给入后，可诱导肺局部特异性分 泌IFNy的功能性的T细胞免疫应答，提示其可能在感染早期和感染 局部有效清除结核杆菌，有效预防结核发生的潜力。序列表
<110〉 复旦大学
<120>脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用 <160> 18
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211> 540 <212> PRT
<213>结核杆菌热休克蛋白65 <400> 1
Met Ala Lys Thr lie Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr lie
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser He Ala Lys Glu lie Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys lie Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gin
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 no
Leu Gly Leu Lys Arg Gly He Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
115 120 125
Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gin lie Ala
130 135 140
Ala Thr Ala Ala lie Ser Ala Gly Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie 145 150 155 160
Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val lie Thr Val Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gin Leu Glu Leu Thr GIu Gly Met Arg
30180 185 190
Phe Asp Lys Gly Tyr lie Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg
195 200 205
Gin Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr lie Leu Leu Val Ser Ser Lys
210 215 220
Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val lie Gly 225 230 235 240
Ala Gly Lys Pro Leu Leu lie He Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
245 250 255
Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ik Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gin
275 280 285
Asp Met Ala lie Leu Thr Gly Gly Gin Val lie Ser Glu Glu Val Gly
2卯 295 300
Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys 305 310 315 320
Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr lie Val Glu Gly Ala Gly Asp
325 330 335
Thr Asp Ala lie Ala Gly Arg Val Ala Gin lie Arg Gin Glu lie Glu
340 345 350
Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val He Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu
370 375 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg He Glu Asp Ala Val Arg Asn 385 3卯 395 400
Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly He Val Ala Gly Gly Gly Val Thr
405 410 415
Leu Leu Gin Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp
420 425 430
Glu Ala Thr Gly Ala Asn lie Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu
435 440 445
Lys Gin lie Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
450 455 460
Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gin Thr Gly 465 470 475 480
Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val485 490 495
Thr Arg Ser Ala Leu Gin Asn Ala Ala Ser lie Ala Gly Leu Phe Leu
500 505 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser
515 520 525
Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 530 535 540
<210> 2 <211> 1620 <212> DNA
<213〉结核杆菌热休克蛋白65 <400> 2
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60
gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240
gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300
gagggcctgc gcaacgtegc ggceggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360
aaggccgtgg agaaggtoac cgagaccctg cteaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc 480
gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc 540
tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg 600
tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg 660
32gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga 720
gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg 780
gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc 840
gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900
gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag 960
gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc 1020
gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt 1080
gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt 1140
gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat 1200
gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg 1260
gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg 1320
aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc 1380
gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt 1440
gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg 1500
ctgcagaatg cggcgtecat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac 1560
aagccggaaa鄉aga鄉c ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc 1620
<210> 3 <211> 13 <212> PRT
<213> 结核杆菌EAST-6189-228抗原 <400> 3
33Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr lie 1 5 10
<210> 4 <211> 39 <212> DNA
<213> 结核杆菌EAST-6189-228抗原 <400> 4
gagctgaaca acgcgctgca gaacctggcg cggacgatc 39
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 结核杆菌Ag85A369-405抗原
<400> 5
Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu 1 5 10
<210> 6 <211> 36 <212> DNA
<213> 结核杆菌Ag85A369-405抗原 <400> 6
ggtctttcga tggctgcttc ttcggcgctg acgctg 36
<210> 7 <211〉 15 <212> PRT
<213> 结核杆菌CFP-10162-207抗原 <400> 7
Val Val Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys Gin Lys Gin Glu Leu1 5 10 15
<210> 8 <211> 45 <212> DNA
<213>结核杆菌CFP-10162-207抗原 <400> 8
gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactc 45
<210〉 9
<211> 13
<212> PRT
<213>结核杆菌Ag85B420-459抗原
<400> 9
Gin Gin Phe lie Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10
<210> 10 <2U> 39 <212> PRT
<213〉结核杆菌Ag85B420-459抗原 <400> 10
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly
15 10 15
Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Gly Cys
20 25 30
Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly 35
<210> 11 <211> 596 <212> PRT
35<213>嵌合了 4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白65外源目的基因蛋白 <400> 11
Met Ala Lys Thr lie Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr lie
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser lie Ala Lys Glu lie Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys He Gly Ala Giu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gin
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly lie Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
115 120 125
Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gin lie Ala
130 135 140
Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr He Ala 145 150 155 160
Ala lie Ser Ala Gly Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie Ala Glu Gly
165 170 175
Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Met Asp Lys Val
180 185 l卯
Gly Asn Glu Gly Val lie Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu
195 200 205
Gin Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr lie Ser
210 215 220
Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gin Glu Ala Val Leu Glu Asp 225 230 235 240
Pro Tyr lie Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu
245 250 255
Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val lie Gly Ala Gly Lys Pro Leu Leu lie
260 265 270
lie Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn
36<formula>formula see original document page 37</formula>580 585 590
Gly Met Asp Phe 595
<210> 12 <211> 1788 <212> DNA
<213>嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白65外源目的基因 <400> 12
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60
gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240
gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300
gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360
aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca 480
gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct 540
gcttcttogg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc 600
gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag 660
ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac 720
ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc 780
gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag 840gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag 900
gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tcteaccggt 960
ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta 1020
ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatc.gtcga gggcgccggt 1080
gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac 1140
tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg 1200
gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag 1260
gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctaccagcag 1320
ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc 1380
gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg 1440
gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg 1500
gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag 1560
aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat 1620
ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg 1680
gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag 1740
gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc 1788
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> HSP65上游引物
<400> 13gaagaattca tggccaagac aattgcg
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> HSP65下游引物
<柳> 14
cataagcttt cagaaatcca tgccacc
<210> 15 <211> 88 <212> DNA <213> Tl引物 <400> 15
cgatggactg gtcacccgcc gaaatcgctg cgategtccg cgccaggttc tgcagcgcgt tgtteagctc ggtggccgca atctgctc
<210〉 16 <211> 88 <212> DNA <213> T2引物 <400> 16
gggtgaccag tccatcggtg acctgatcgc cgagggtctt tcgatggctg cttcttcggc gctgacgctg gcgatggaca aggtgggc
<210> 17 <211> 73 <212〉 DNA <213> El引物 <400> 17
ggtaggcggc gagttcctgc ttctgcttat tggctgcttc ttggaagcgc accacctcgatgcggtgctt gcg
<210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> E2弓l物 <400> 18
ggaactcgcc gcctaccagc agttcatcta cgccggctcg ctgtcggccc tgctggatgc 60 ggttcgcaat gcc 7权利要求
1. 一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于所述的结核基因疫苗由脱乙酰壳聚糖与结核抗原编码质粒组成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因，所述的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因，结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因，结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。
2. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质 粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAXl质粒。
3. 根据权利要求l所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65的氨基酸序 列如SEQIDNO: l所示。
4. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65基因的DNA 序列如SEQIDNO: 2所示。
5. 根据权利要求l所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因 的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
6. 根据权利要求l所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
7. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因 的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
8. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。
9. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌CFP-IO蛋白的162 207位基因 的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
10. 根据权利要求l所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
11. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因 的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
12. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
13. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于在结核杆菌的热休克蛋白HSP65全长基因中的第 438位碱基后插入结核杆菌ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486 位碱基后插入结核杆菌Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位碱 基后插入结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因和结核杆菌Ag85B 蛋白的420 459位基因。
14. 根据权利要求13所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基 因疫苗，其特征在于所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420 459位基因之间以gccgcctac 基因序列相连接。
15. 根据权利要求l所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌 热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序 列如SEQIDNO:ll所示。
16. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因 疫苗，其特征在于嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌 热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如 SEQIDNO: 12所示。
17. 根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基 因疫苗，其特征在于所用的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000 420000之间，脱乙酰度为75%-85%。
18. —种如权利要求1所述的结核抗原编码质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤1) 提取结核分枝杆菌DNA作为模板，通过PCR方法扩增 结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；2) 以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过 PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、 片段3，所述的片段1的双链DNA的序列为3tggcc3sgs cssttgcgt3 cg3cg33gag gcccgtcgcg gcctcg3gcg gggcttg3sc taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggsgctcgc cccgsacttggccctcgccg stgcggtsss ggtgac3ttg ggccccssgg gccgcsscgt cgtcctggss cgggagcggc tacgccsttt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggaccttaagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctcctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtsgc cssgssgsLCC gacctcctsg gcstgctctt ctagccgcgg ctcgsccsgt ttctccstcg gttcttctgggatgacgtcg ccggtgacgg caccscgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcggagggcctgc gcsacgtcgc ggccggcgcc sscccgctcg gtctc333cg cggcstcgsa ctcccggscg cgttgcsgcg ccggccgcgg ttgggcgsgc csgsgtttgc gccgtaigcttssggccgtgg ttccggcsccgagcsgattg ctcgtctascgcgstttcgg cgct333gccag33ggtc3c cg3g3ccctg ctcssgggcg ccssggsggt cg3g3cc33g tcttccsgtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttccggccaccg3 gctgaacaac gcgctgcags scctggcgcg gacgatcgca gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgtcgggtgscc3 gtcc3tcg gcccectggt caggtsgc ，所述的片段2的双链DNA的序列为gcttcttcgg cg33g33gccg3gg3gtcc3 ctcctcaggtggctacatct ccgstgtagaCCC七3C3tCCgggstgtagggag33ggtca ctcttccagtgcgctgtccs cgcgsc3ggtgctcccggct cgsgggccgsggtcaggtga ccsgtccsctggcssggccc ccgttccggggaic3ccg3cg ctgtggctgctccgactacg sggctgstgcgtgstcasgg csct3gttccgtggtgcgct C3ccscgcg3gggtgaicc3 cccsctggtcgctgscgct gcgsctgcgs3cscctttgg tgtggsaacccggggt3ctt gcccc3tgastgctggtcag 3cgaccsgtctcggagccgg sgcctcggccccctggtcgt gggaccagcatcggcg3ccg agccgctggctcsgcgaaga agtcgcttctgcssggtcgt cgyyccagcaccstcgccgg ggtsgcggccaccgtgsg33 tggcsctcttccggtgccgc ggcc3cggcgtcc5L3ga6igc sggttcttcggtccatcggt caggtagccaggcgstggsc ccgct己cctggctgcsgctc cgscgtcgagcgtgsccgac gcsctggctgctcceiaiggtg gaggttccact33gccgctg aittcggcg3cgttgttctagccgcasggcg ggcgttccgcggtcggcctg ccsgccggscggtc己ccaeig ccsgtggttcscgsgtggcc tgctcsccgggctgcaggag cgscgtcctccsccg3ggtc ggcgttccgcagccaataag tcggttsttcgaicctgstcg ctggsctagc3sggtgggcs ggccscccgtgagctcaccg ctcgsgtggcccggsgcgtc ggcctcgcsgtccsctgtC3 aggtgacsgtctgatc3tcg g3ctsgtsgccgcggc3cct gcgccgtggsstgctgc3gg tacgacgtccacgctggsgai tgcgacctctgacgagaccs ctgctctggtcsgstccgcc gtct3ggcggcggctggccs gccgsccggtg6Lactcasgg cttgagttccc3g33gc3gg gtcttcgtccccgsgggtct ggctcccaga3cg3gggcgt tgctcccgcssgggtatgcg tcccstacgcaggaggcggt tcctccgccs3gg3tctgct tcctsgaLcgsccg3gg3cgt ggctcctgc3tcasgtcggt 3gttcsgcc3at3tggccst tataccggtaacgccgscct tgcggctggacc3tcgtcga ggtagcagcttcctctsgctagctggccgg tcgsccggcctcgcgttcgt3sctcgccgc ttgsgcggcgttcgstggctC3tc3ccgtc gtagtggcaggttcgac33g caagctgttccctggsggac ggacctcctggccgctgctc cggcgscgagcgagggcgag gctcccgctcggcggtcsag ccgccagttctctC3ccggt sgagtggccagtcgctgct3 csgcgscg3tgggcgccggt cccgcggccsg33csgcgsc cttgtcgctgtggtgtcgcg scc3csgcgcccgcatcgag ggcgt3gctcctscc gstgg ，所述的片段3的双链DNA的序列为gg ssctcgccgc ctsccsgcag cc ttgagcggcg gatggtcgtcttc3tct3cg ccggctcgct gtcggccctg ctggstgcgg ttcgcsetgc cssggccgccaagtagstgc ggccgsgcg3 csgccgggac g3cctacgcc 33gcgttacg gttccggcgggtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcssgcggc cccgaccctgcsgctcctcc cgtsgcsgcg gccacccccs csctgcg3C3 3cgttcgccg gggctgggacgacgagctga 3gctcgssgg cgscgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctgctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagc3ctt ccaccgcgacgsggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgagcaccggggcg acttcgtcts gcggsagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc3aggtgcgc3 scctgccggc tggccscgga ctgascgctc 3gsccggtgt ct3cgsggstttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctcctactgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcggacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg caagccgcga cgtcttacgcgcgtccatcg cggggctgtt cctgacc己cc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaagcgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttcgsgasggctt ccgttcccgg tggcggcgsc 3tgggtggc3 tggstttcctcttccgsa ccgaisgggcc sccgccgctg t3cccaccgt 3cct333g 3) 将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获 得嵌合了 4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目 的基因，将目的基因经EcoRI和Hind III双酶切后与经同样双 酶切的载体连接，获得权利要求1所述的结核抗原编码质粒。
19. 根据权利要求18所述的结核抗原编码质粒的构建方法，其特征 在于所述的结核分枝杆菌DNA来自结核分枝杆菌H37Rv株。
20. 根据权利要求18所述的结核抗原编码质粒的构建方法，其特征 在于所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAXl质粒。
21. —种制备如权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的 结核基因疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 构建结核抗原编码质粒pECANS;(2) 将0.01~0.04%浓度、PH5.5-5.7的脱乙酰壳聚糖溶液，与 50 400jig/ml编码结核抗原的质粒pECANS溶液在50-60。C下，以 15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳聚糖溶液中，所述 的脱乙酰壳聚糖的分子量在38000 420000之间，脱乙酰度75% 85%，所述的质粒DNA溶解在5mM 25mM的Na2S04中，通过共 聚交联作用，获得的脱乙酰壳聚糖-结核抗原质粒纳米颗粒为球形，直 径在50 200nm之间。
22. —种药物组合物，其特征在于含有有效量的权利要求1所述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，以及药学上可以 接受的载体或者赋形剂。
23. —种权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基 因疫苗的应用方法，其特征在于，以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。
24. 如权利要求23所述的结核基因疫苗的粘膜部位接种方法如下1) 首先对动物进行轻度麻醉；2) 在鼻腔、口腔或生殖道内逐滴注入脱乙酰壳聚糖-pECANS纳 米颗粒，3) 二周后重复1) +2)的免疫过程，4) 共免疫3 4次，pECANS DNA总量在150 200jug。
25. 权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫 苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。
全文摘要
一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，由脱乙酰壳聚糖与结核抗原编码质粒组成，结核抗原编码质粒中插入有结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因，HSP65全长基因中插入4个来自结核杆菌抗原中的T细胞表位基因EAST-6_189-228、Ag85A_369-405、CFP10_162-207和Ag85B_420-459。本发明还公开了这种结核基因疫苗的应用，通过将本发明的基因疫苗滴鼻免疫小鼠，证实可诱导针对多个结核抗原的特异性抗体应答，能诱导全身及肺脏粘膜局部较强的结核特异性T细胞杀伤应答，同时可诱导分泌高水平IFNγ的Th1免疫应答，效果显著优于传统BCG疫苗，是一种优良的预防和治疗结核病的疫苗。
文档编号A61K48/00GK101455846SQ20071017204
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者艳 岳, 薇 徐, 熊思东, 高海峰 申请人:复旦大学