专利名称：葱子提取物及制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种葱子提取物及其制备方法，以及该葱子提取物在制备防治心肌缺血性心血管疾病药物或食品中的用途。
背景技术：
心肌缺血是发病率较高的一类心血管疾病，发作时，患者感觉心前区剧烈阵发性闷痛或绞痛；当反复发作及再灌注发生时还会引起心肌细胞的损伤和心脏功能的紊乱，主要表现为心律失常、血管损伤甚至血液滞留、心肌功能丧失、加速缺血致损伤心肌细胞的坏死、心肌细胞水肿等。我国每年死于心脑血管疾病患者达300多万，而幸存下来的患者之中，75％不同程度的丧失劳动能力，4％重残，极大地影响了生活质量。
国内外学者研究表明，葱属植物中含有黄酮，甾体皂苷，硫化物，生物碱，脂肪酸等成分，主要用于抗菌及抗真菌，抗肿瘤，抗血小板聚集，抗氧化等。近几年来，对葱的研究主要集中在其全草的心血管药理作用方面，据报道葱粗提物对雄性SD大鼠具有显著的抗凝血作用(The Journal Of Nutrition，2000；130(1)34-37)；有学者考察了葱提取物对细胞内[Ca2+]及血小板内核苷酸水平的影响(Life Sciences，2000；66(17)1571-1579)；另有实验证明葱提取物可以通过内皮依赖或非依赖方式调整血管紧张度(Journal Of Cardiovascular Pharmacology，1999；33(4)515-520)；还有人考察了大葱对于高血压的形成及自氧化的作用(Bioscience，Biotechnology，And Biochemistry，2005；69(7)1311-1317)。
葱子(Semen Allii Fistulosi)是百合科葱属植物葱(Allium fistulosum L.)的干燥成熟种子，具有补中益精，明目散风的功效，用于肾虚，目眩，风寒感冒等症，在全国各地广泛栽培，资源丰富。
目前尚无文献报道有关葱子提取物及其在防治心肌缺血性心血管疾病方面的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治心肌缺血的有效部位，即葱子的提取物及其制备方法，以及该葱子提取物在制备防治心肌缺血性心血管疾病药物或食品中的用途。
本发明的一种葱子提取物，是通过以下制备方法制得的葱子干燥药材粉碎后，以纯水加热提取2-5次，合并提取液，浓缩后离心，弃去沉淀，取上清液进行大孔树脂吸附，以蒸馏水淋洗除去杂质，再用15％-65％含水乙醇溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩干燥后即得葱子提取物。
本发明的一种葱子提取物的制备方法是葱子干燥药材粉碎后，以纯水加热提取2-5次，合并提取液，浓缩后离心，弃去沉淀，取上清液进行大孔树脂吸附，以蒸馏水淋洗除去杂质，再用15％-65％含水乙醇溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩干燥后即得葱子提取物。
本发明还通过如下实验证明了葱子提取物在制备防治心肌缺血性心血管疾病药物或食品中的用途 1.采用麻醉犬冠状动脉左前降支结扎造成心肌梗塞模型，观察葱子提取物灌胃给药的治疗作用。实验结果显示，葱子提取物15、45、90mg/kg灌胃给药可显著降低犬冠脉结扎后心肌缺血的程度，缩小心肌缺血的范围；与生理盐水对照组比较，葱子提取物可显著减小梗塞范围；2.观察葱子提取物灌胃给药对SD大鼠缺血再灌注所致心肌损伤的影响。结扎SD大鼠冠状动脉左前降支，制成急性缺血模型，缺血同时灌胃给予葱子提取物，缺血30min再灌注30min，发现葱子提取物低、中、高剂量组血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶活性，心肌梗塞区与心脏重量比例明显低于模型组；结果表明葱子提取物灌胃给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，可明显缩小心肌梗塞范围；3.观察葱子提取物灌胃给药对麻醉犬心肌耗氧量的影响，同时观察平均动脉压、主动脉流量、冠脉流量。结果显示葱子提取物15、45、90mg/kg灌胃后心肌耗氧量变化与同时间点生理盐水组相比显著下降；心肌氧摄取率明显降低，冠脉流量增加，冠脉阻力降低，作用强度与剂量有一定的关系。可见，本发明的葱子提取物对心肌缺血性心血管疾病具有防治作用。
图1 葱子提取物对犬冠脉结扎心外膜电图ST段总和(∑ST)的影响 图2 葱子提取物对犬冠脉结扎心肌梗塞范围(N-ST)的影响 图3 葱子提取物对犬心肌耗氧量(mL/min·100g-1)的影响 图4 葱子提取物对犬心肌氧摄取率(％)的影响 图5 葱子提取物对犬冠脉流量(mL/min)的影响 图6 葱子提取物对犬冠脉阻力(Kpa/mL/min)的影响 图7 葱子提取物对犬心输出量(L/min)的影响 图8 葱子提取物对总外周阻力(TPR，dyn·s·cm-5)的影响(
n＝5)
具体实施例方式 下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1葱子提取物的制备 10公斤葱子干燥药材粉碎后，投入提取罐，以50升纯水在90-100℃煮提三次，每次提取时间为1小时，合并三次提取液，浓缩至20升，离心后过滤，弃去沉淀，上清液用蒸馏水调节至50升。缓缓通过装有6公斤聚苯乙烯多孔性吸附大孔树脂的吸附柱，用80升蒸馏水淋洗除去杂质；再用50升50％含水乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，进一步干燥并粉碎，得黄色粉末状的葱子提取物0.09公斤，按生药量记得率为0.9％。
实施例2葱子提取物对犬急性心肌缺血的治疗作用 本实验通过对麻醉犬灌胃给予不同剂量的葱子提取物，观察其对急性心肌缺血的改善和治疗作用。
1材料与方法 1.1实验动物 健康杂种犬(第二军医大学动物中心提供，动物饲养合格证号SCXK(沪)2002-0006；性别雄雌兼用；体重9～14kg；每组5条；动物总数25条) 1.2给药方法 给药方式灌胃给药 给药剂量犬低、中、高剂量分别为15mg/kg(相当于原生药1.9g/kg)，45mg/kg和90mg/kg；阳性对照杏灵颗粒，为300mg/kg(相当于银杏酮酯15mg/kg)；生理盐水按2mL/kg灌胃给药 给药次数单次给药 1.3试验方法 参照相关文献(西药新药研究指南(药学，药理学，毒理学)，1993；药理实验方法学，第二版，1991804-807，830-832，921-922，924-926，1022-1023；新药与临床，1994；13(3)140-143)方法进行实验。对犬急性心肌缺血模型采用Harris两步结扎法，而后灌胃给药，阴性对照组给生理盐水。在心脏表面连接30点心外膜电极，经多导转换开关连至Powerlab system 8s生理记录仪，记录30点心外膜电图。计算规定的不同时间点心外膜电图ST段升高的导联数(NST)和ST段升高值的总和(∑ST)为指标观察给药前后的变化，以了解心肌缺血的程度与范围。
冠脉结扎前及给药后3小时各取右心室血3mL，取血清测乳酸脱氢酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK)。在UV751GD型紫外/可见光分光光度计上进行比较。给药3小时后取心脏，染色。梗死区不着色，非梗死区着暗蓝色，剪去着色部分，将未着色的梗死区称重。
实验数据用
表示，用SPSS 10.0软件进行方差分析，检验差异的显著性 2实验结果 2.1对心肌缺血程度(心外膜电图∑ST)的影响 冠脉结扎后15min生理盐水组心外膜电图ST段总和(∑ST)升高，30min时∑ST升高达221mv，此后缓慢回落；葱子提取物低剂量组(15mg/kg)从15min起可显著减轻心肌缺血程度，作用可持续至60min；在90、120min和180min后与生理盐水组比较无显著性差异；葱子提取物中、高剂量组(45、90mg/kg)灌胃给药后能剂量依赖性地减轻心肌缺血程度，∑ST显著下降(P＜0.01)，作用从给药15min持续至180min。阳性对照药杏灵颗粒组在给药后15min至60min，∑ST下降与生理盐水组同时间点比较差异显著(P＜0.01)。实验结果见表1，图1。
实验结果表明，葱子提取物15-90mg/kg灌胃给药能显著降低心肌缺血后心外电图ST段总和(∑ST)升高，即降低犬冠脉结扎引起的急性心肌缺血程度，并且作用迅速，各剂量组在15min内即起效，葱子提取物低剂量组结果与阳性对照药杏灵颗粒相当。
2.2葱子提取物对心肌缺血范围(心外膜电图N-ST)的影响 葱子提取物低剂量组(15mg/kg)30min N-ST值降低率与生理盐水组同时间点比较差异非常显著(P＜0.01)，作用可持续至60min(P＜0.05)；中剂量组(45mg/kg)N-ST值降低率与生理盐水组同时间点比较，在15、90min差异显著(P＜0.05)，30、60min差异非常显著(P＜0.01)；高剂量组(90mg/kg)能缩小心肌缺血范围，降低N-ST值，作用可持续180min，30min至180min N-ST值降低率与生理盐水组同时间点比较，有非常显著差异(P＜0.01)。阳性对照药杏灵颗粒组在给药后30、60min时N-ST值降低率与生理盐水组同时间点比较差异非常显著(P＜0.01)，实验结果见表2、图2。
2.3葱子提取物对心肌梗塞范围影响的定量组织学检测 用定量组织学检测心肌梗塞范围即用N-BT染色，结果显示葱子提取物对心肌梗塞范围的影响与心外膜电图测定的结果一致。葱子提取物15~90mg/kg灌胃给药能剂量依赖性地减少心肌梗塞范围。葱子提取物低、中、高剂量组(15、45、90mg/kg)梗塞区/左心室的比值与生理盐水组比较下降非常显著(P＜0.01)；葱子提取物中、高剂量组(45、90mg/kg)梗塞区/全心的比值与生理盐水组比较下降非常显著(P＜0.01)，低剂量组(15mg/kg)梗塞区/全心的比值与生理盐水组比较下降显著(P＜0.05)。其中高剂量组(90mg/kg)梗塞区/全心的比值和梗塞区/左心室的比值分别由生理盐水组的14.01±3.76％，24.90±3.54％下降到8.20±1.54％，13.07±2.25％。阳性对照组杏灵颗粒组能显著地缩小心肌梗塞范围，梗塞区/左心室的比值和梗塞区/全心的比值与生理盐水组比较下降均非常显著(P＜0.01)。实验结果见表3。
2.4葱子提取物对冠脉结扎后血清生化指标的影响 冠状动脉结扎后各组血清LDH、CK均升高，其中生理盐水组LDH、CK可分别由256.88±47.81、155.42±19.33上升到730.36±120.93、484.08±33.08(IU/L)。葱子提取物低、中、高剂量组(15、45、90mg/kg)及阳性对照药杏灵颗粒组均能非常显著的降低血清乳酸脱氢酶(LDH)的升高程度(P＜0.01)；葱子提取物中、高剂量组(45、90mg/kg)及阳性对照药杏灵颗粒组均能非常显著的降低血清肌酸激酶(CK)的升高程度(P＜0.01)，低剂量组(15mg/kg)显著降低血清CK的升高程度(P＜0.05)。实验结果见表4。
表1 葱子提取物对犬冠脉结扎心外膜电图ST段总和(∑ST)的影响(mV，
n＝5只/组)
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 表2葱子提取物对犬冠脉结扎心肌梗塞范围(N-ST)的影响(点数，
n＝5只/组)
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组同时间点的改变值比较 表3葱子提取物对N-BT染色测定心肌梗塞范围的影响
n＝5只/组) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 表4葱子提取物对冠脉结扎动脉血清生化指标的影响
n＝5只/组) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 3结论 实验结果证明，葱子提取物灌胃给药能显著降低冠脉结扎犬的心肌缺血程度，缩小心肌缺血范围，作用强度与剂量有一定的关系，定量组织学检测与心外膜电图测定的结果一致，与生理盐水对照组比较，梗塞区显著缩小，证明葱子提取物灌胃给药对犬冠状动脉结扎引起的心肌梗塞有明显的治疗作用。实验结果还表明，葱子提取物能显著降低犬冠脉结扎后血清肌酸激酶及乳酸脱氢酶升高的程度；提示其可减少急性缺血心肌细胞CK、LDH的溢出，减轻心肌缺血时的细胞损害，对心肌细胞有保护作用。葱子提取物灌胃给药对急性心肌缺血有保护作用，可减轻心肌缺血程度和范围，保护缺血心肌细胞。
实施例3葱子提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 本实验通过给大鼠灌胃给予不同剂量的葱子提取物，观察其对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
1材料与方法 1.1试验动物 Sprague-Dawley大鼠(中国科学院上海分院动物中心提供；动物合格证号SCXK(沪)2002-0010；等级清洁级，合格证号医动字第02-64号；体重250-300g；性别雌性；每组10只；总数60只) 1.2给药方法 给药方式灌胃给药 给药剂量大鼠低低、中、高剂量分别为50mg/kg，150mg/kg和300mg/kg。阳性药剂量为900mg/kg(相当于银杏酮酯45mg/kg) 给药次数均单次给药 1.3试验方法 雄性SD大鼠，各组灌胃给药后立即结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血，缺血30min后剪断结扎线，使前降支再灌注30min。
再灌注结束后，股动脉取血，紫外分光法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK)活性。给药后60分钟取心脏，染色。梗死区不着色，非梗死区着暗蓝色，剪去着色部分，将未着色的梗死区称重。
各组数据以
表示，用SPSS 10.0软件进行方差分析，进行差异显著性检验。
2实验结果 心肌缺血再灌注后，血清LDH、CK活性明显增加，心肌梗塞区重量明显增加，与假手术对照组比较有非常显著性差异(P＜0.01)；葱子提取物各剂量组血清LDH、CK活性，心肌梗塞区与心脏重量百分比明显低于模型组。其中葱子提取物各剂量组(50、150、300mg/kg)血清LDH降低与模型组比较差异具有非常显著意义(P＜0.01)；血清CK活性降低与模型组比较差异具有显著意义(P＜0.05)。葱子提取物中、高剂量组(150、300mg/kg)心肌梗塞区与心脏重量百分比降低与模型组比较差异非常显著(P＜0.01)；低剂量组(50mg/kg)心肌梗塞区与心脏重量百分比降低与模型组比较差异显著(P＜0.05)。其中高剂量组梗塞区与心脏重量比例由生理盐水对照组的31.09±4.52％下降到23.09±3.67。杏灵颗粒组与葱子提取物给药组相似，血清LDH、CK活性、心肌梗塞区重量明显降低，与模型组比较有显著差异(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。见表5。
表5 葱子提取物对心脏缺血再灌注损伤大鼠的影响
n＝10) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 △△P＜0.01与假手术组比较 3结论 葱子提取物灌胃给药对缺血再灌注所致SD大鼠心肌损伤有保护作用，可明显抑制缺血再灌注所致大鼠心肌损伤时LDH、CK溢出，降低血清LDH、CK活性，可明显缩小心肌梗塞范围，并有一定的量效关系。与实验剂量的杏灵颗粒比较，中剂量葱子提取物的效果与杏灵颗粒相似。
实施例4葱子提取物对麻醉犬心肌耗氧量的影响 1材料与方法 1.1试验动物 健康杂种犬(第二军医大学动物中心提供，动物饲养合格证号SCXK(沪)2002-0006；性别雄雌兼用；体重10～14kg；每组5条；动物总数25条) 1.2给药方法 给药方式灌胃给药 给药剂量葱子提取物低、中、高剂量分别为15mg/kg，45 mg/kg和90mg/kg。阳性对照杏灵颗粒为300mg/kg(相当于银杏酮酯15mg/kg) 给药次数均单次给药 1.3试验方法 分离麻醉犬左侧股动脉，向心插入导管，用于监测记录外周血压(BP)；分离右侧股动脉，备动脉血气分析。游离升主动脉根部和左冠状动脉前降支上部，分别放置适宜内径的电磁流量计探头测定记录主动脉流量(心输出量)和冠脉流量。分离右侧颈静脉，插入心导管。同步抽取冠状窦及股动脉血标本(0.5％肝素抗凝)，用血气分析仪测定p02，pH，动脉和静脉血氧含量。实验结束时将心脏称重，并以墨水逆流灌注于电磁流量计测量部位以下区域，切下染黑区并称重，用于计算心肌耗氧量。公式为 (1)、心肌耗氧量(ml/min/100g)＝冠脉血流量mL/min/100g×(动脉血氧mL％-冠状窦血氧mL％) (2)、心肌氧摄取率(％)＝(动脉血氧mL％-冠状窦血氧mL％)/动脉血氧mL％ (3)、体循环总外周阻力(TPR，dyn·s·cm-5)＝平均动脉压[MAP(KPa)]×80/心输出量[CO(L/min)](＝平均动脉压[MAP(mmHg)]×10.6/心输出量[CO(L/min)]) (4)、冠脉阻力(Kpa/mL/min)＝平均血压/冠脉流量试验结果以
表示，用SPSS 10.0软件进行方差分析，作差异显著性检验 2实验结果 2.1对犬心肌耗氧量的影响 葱子提取物低、中、高剂量组(15、45、90mg/kg)灌胃后心肌耗氧量同生理盐水组相比有所下降，其中低剂量组(15mg/kg)在60min时降低率与生理盐水组同时间点比较差异显著(P＜0.05)；中剂量组(45mg/kg)在15、30、120min时与生理盐水组相比差异显著(P＜0.05)，60、90min差异非常显著(P＜0.01)；高剂量组各时间点心肌耗氧量变化率与生理盐水组同时间点比差异非常显著(P＜0.01)；杏灵颗粒可显著降低心肌耗氧量，在30-90min时耗氧量降低率与生理盐水组同时间点相比，差异显著(P＜0.05)。结果见表6，图3。
2.2对犬心肌氧摄取率的影响 葱子提取物灌胃后可显著降低心肌氧摄取率。降低率与生理盐水组同时间点相比，低剂量组(15mg/kg)在30、60min时差异显著(P＜0.05)；中剂量组从15至90min差异非常显著(P＜0.01)，120min时仍有效(P＜0.05)；高剂量组(90mg/kg)从15min至180 min时各点降低氧摄取率与生理盐水组同时间点相比，差异非常显著(P＜0.01)。阳性对照药杏灵颗粒可显著降低心肌氧摄取率，降低率与生理盐水组同时间点相比30min至90min时各时间点差异非常显著(P＜0.01)。结果见表7，图4。
2.3对犬冠脉流量和冠脉阻力的影响 葱子提取物中、高剂量组可增加冠脉流量；增加率与生理盐水组同时间点相比，中剂量组(15mg/kg)从15min与生理盐水组差异显著(P＜0.05)，作用持续至90min(P＜0.01)；高剂量组(90mg/kg)从30min至180min差异均非常显著(P＜0.01)。阳性对照药杏灵颗粒组也可明显增加冠脉流量，在30min至90min时冠脉流量比给药前增加率与生理盐水组同时间点相比，差异非常显著(P＜0.01)。结果见表8，图5。
葱子提取物中、高剂量组(45、90mg/kg)可降低冠脉阻力，降低率与生理盐水组同时间点相比，中剂量组(45mg/kg)在30、60、90min差异非常显著(P＜0.01)；高剂量组(90mg/kg)分别在30、60、90min差异非常显著(P＜0.01)，120、180min时差异显著(P＜0.05)；阳性对照药杏灵颗粒组也可明显降低冠脉阻力，在30、60、90min时冠脉阻力降低率与生理盐水组同时间点相比差异非常显著(P＜0.01)。结果见表9、图6。
2.4对犬心输出量和总外周阻力的影响 葱子提取物各剂量组(15、45、90mg/kg)、杏灵颗粒及生理盐水组对犬心输出量无明显影响(P＞0.05)，葱子提取物高剂量组(90mg/kg)、杏灵颗粒组可略降低总外周阻力，但变化率与生理盐水组比较无显著性差异。结果见表10、图7、图8。
3结论 葱子提取物可明显增加麻醉犬冠脉流量，明显降低冠脉阻力、明显降低冠心肌氧摄取率，显著降低心肌耗氧量，对心输出量、总外周阻力均无明显影响。
由上可见，葱子提取物可明显减轻模型动物心肌缺血的程度，减小梗死范围；对缺血再灌注损伤亦有保护作用，可明显缩小心肌梗塞范围。因此，本发明的葱子提取物对心肌缺血性心血管疾病具有防治作用。
表6葱子提取物对犬心肌耗氧量(mL/min·100g-1)的影响
n＝5) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 表7 葱子提取物对犬心肌氧摄取率(％)的影响
n＝5) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 表8葱子提取物对犬冠脉流量(mL/min)的影响
n＝5) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 表9葱子提取物对犬冠脉阻力(Kpa/mL/min)的影响
n＝5) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较 表10葱子提取物对犬心输出量(CO，L/min)的影响
n＝5) *P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较
权利要求
1.一种葱子提取物，是通过以下制备方法制得的葱子干燥药材粉碎后，以纯水加热提取2-5次，合并提取液，浓缩后离心，弃去沉淀，取上清液进行大孔树脂吸附，以蒸馏水淋洗除去杂质，再用15％-65％含水乙醇溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩干燥后即得葱子提取物。
2.根据权利要求1所述的一种葱子提取物，是通过以下制备方法制得的10公斤葱子干燥药材粉碎后，投入提取罐，以50升纯水在90-100℃煮提三次，每次提取时间为1小时，合并三次提取液，浓缩至20升，离心后过滤，弃去沉淀，上清液用蒸馏水调节至50升，缓缓通过装有6公斤聚苯乙烯多孔性吸附大孔树脂的吸附柱，用80升蒸馏水淋洗除去杂质；再用50升50％含水乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，进一步干燥并粉碎，得黄色粉末状的葱子提取物。
3.一种葱子提取物的制备方法，步聚如下葱子干燥药材粉碎后，以纯水加热提取2-5次，合并提取液，浓缩后离心，弃去沉淀，取上清液进行大孔树脂吸附，以蒸馏水淋洗除去杂质，再用15％-65％含水乙醇溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩干燥后即得葱子提取物。
4.如权利要求1所述的葱子提取物在制备防治心肌缺血性心血管疾病药物或食品中的用途。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种葱子提取物及其制备方法，以及该葱子提取物在制备防治心肌缺血性心血管疾病药物或食品中的用途。近几年来，对葱的研究主要集中在其全草的心血管药理作用方面。本发明的目的在于提供一种防治心肌缺血的有效部位，即葱子的提取物，是将葱子药材用纯水热提得提取液，采用大孔吸附树脂分离，精制得葱子提取物。经动物实验，葱子提取物可明显减轻模型动物心肌缺血的程度，减小梗死范围；对缺血再灌注损伤亦有保护作用，可明显缩小心肌梗塞范围。因此，本发明的葱子提取物对心肌缺血性心血管疾病具有防治作用。
文档编号A61K36/88GK101181581SQ200710171720
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月4日 优先权日2007年12月4日
发明者孙连娜, 陈万生, 威 来, 彦 邱, 阳 杨 申请人:中国人民解放军第二军医大学