一种神经组织工程导电纤维管状支架及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料领域，涉及一种神经修复用神经导管及其制备方法，特别涉及一种导电纳米纤维管状支架和一种用于管内作为促进神经再生的新型组织工程填充材料及制备方法。

背景技术：

由于严重创伤、肿瘤切除等原因造成的周围神经组织损伤在临床非常多见。神经一旦受损，将使病人无法正常生活与工作，但大段神经缺损的修复和功能重建仍然是临床难题。神经移植是临床上公认的比较有效的治疗大段神经缺损方法，但自体神经来源有限，异体神经很难避免免疫排斥，用骨骼肌或静脉代替神经进行移植，修复效果又有限。随着神经组织工程学的发展，生物可吸收神经导管成为最有希望成功修复大段神经缺损的方法。神经导管的基本功能是为神经的生长提供一个通道，为了给轴突生长提供理想的微环境，国内外研究人员在制备具有纵向排列孔结构神经导管、负载生物活性物质的神经导管、导电性神经导管等多方面进行了深入探索，这些导管材料据称都能加速神经生长和减少神经瘤的形成。但从组织工程学的角度，除了生物相容性和生物可降解性，用于神经再生修复的理想支架材料应该同时具有：引导轴突生长方向的拓扑学结构；刺激轴突再生和神经功能恢复的仿生电生理特性；提高神经再生速度和质量的生物活性物质；负载利于神经修复的细胞等。满足以上条件，制备出完全仿生的神经导管支架，将大幅度提高神经修复的效果。

目前的研究中，各种神经导管材料和设计不断被推出，如专利cn102525689b采用静电纺丝法制备了一种取向纳米纤维神经导管，引导神经沿纤维取向方向生长；专利cn1303946c公开了一种神经组织工程管状支架的制备方法及其专用模具，构建了内部带有轴向多通道结构的壳聚糖管状支架；专利cn101579246a公开了一种双层神经修复导管的制备，其内外层分别由平行和垂直导管延展方向排列的丝素蛋白纤维构成；专利cn103230622a也公开了一种多层纤维膜构建的、降解速度由内向外逐渐减慢的神经移植导管；专利cn10105194729a中采用高分导电材料制备一种具有导电能力的管体支架，通过体内植入电极，施加电刺激，大鼠坐骨修复效果良好；专利cn103263695a中公开了一种全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法，是将混有种子细胞的全氟三乙胺乳液注入多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内得到。但尚未有一种导管支架材料能为神经组织工程提供多功能的仿生微环境。因此，如何优化设计和制备一种更加全面促进神经修复和再生的组织工程支架，是保障再生神经功能恢复和充分发挥功效的必要前提。

技术实现要素：

本发明的目的是为神经组织工程提供一种管状支架材料，采用导电性高分子材料，制备同时负载神经营养因子和利于神经再生种子细胞的导电性管状支架。该支架管壁具有通透性，但阻隔纤维组织的进入生长；该支架内管壁具有平行导管延展方向的拓扑结构，利于神经轴突和种子细胞的取向生长；该管状支架内填充有导电凝胶材料，可防止导管结构塌陷，并作为促神经再生的种子细胞和生长因子的载体。这种复合功能化的神经组织工程管状支架，结合电刺激进行细胞功能（如粘附、增殖、迁移和分化）的调节，可有效促进神经损伤修复。

上述发明目的是通过以下技术方案实现的：

一种神经组织工程导电管状支架，其特征在于：该支架由导电纤维管和导电性水凝胶填充材料构成；导电纳米纤维管由内外两层纤维膜复合而成，即管外层为非导电无纺排布纤维膜，管内层为沿导管轴向取向的平行排布导电纤维膜；填充材料由天然大分子水凝胶和负载生长因子的导电纳米管复合而成。

所述的非导电纤维膜，其材料为生物可降解脂肪族聚酯，可以是聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯及它们的共聚物中的一种。

所述的导电纤维膜，其材料为导电性聚吡咯（ppy）与生物可降解脂肪族聚酯的共混复合物。

所述的天然大分子水凝胶选自海藻酸钠或透明质酸钠中的一种。

所述的导电纳米管为ppy纳米管，直径为300-600nm，管壁厚80-130nm。

所述的促神经再生的生长因子可以是神经生长因子（ngf）和碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）中的一种或两种。

所述的促神经生长的种子细胞可以是雪旺细胞、髓鞘细胞、神经干细胞和骨髓间充质干细胞中的一种。

本发明还提供了一种神经组织工程导电纤维管状支架的制备方法，其步骤如下：

（1）将单体吡咯（py）、掺杂剂十二烷基苯磺酸（dbsa）采用去离子水溶解混合均匀后，加入引发剂过硫酸铵（aps），在0℃下引发py聚合，聚合完成后，产物分别用甲醇、水、丙酮清洗纯化，干燥后重新溶解于氯仿（chcl3），过滤除去不可溶解部分后，将滤液旋蒸除去溶剂，得到干燥、可溶解的ppy。

（2）将步骤（1）制备的ppy，按一定重量比，与生物可降解脂肪族聚酯共同溶于氯仿与二甲基甲酰胺（dmf）混合溶液（体积比1:1）中，采用高速旋转的金属滚筒为接收装置，通过静电纺丝制备纤维高度平行取向的导电聚酯/ppy复合纤维膜。

（3）将步骤（2）制备的高度平行取向的聚酯/ppy复合纤维膜，采用多巴胺水溶液在室温进行表面改性后，固定在铝箔上。

（4）将生物可降解脂肪族聚酯溶于三氟乙醇，采用步骤（3）固定有平行纤维膜的铝箔为接收装置，通过静电纺丝，在其上直接堆积纤维无规排列的无纺聚酯纤维膜。

（5）将步骤（4）制备的双层纤维膜，以平行纤维膜为内层，垂直于纤维取向方向卷曲成管，得到双层的纤维管体。

（6）将生物可降解脂肪族聚酯溶于三氟乙醇，采用铝箔为接收装置，通过静电纺丝制备无纺聚酯纳米纤维膜，将此纳米纤维膜浸泡于py单体水溶液中，加入催化剂fecl3溶液，py聚合并沉积在聚酯纳米纤维上，然后用氯仿浸泡该ppy/聚酯复合纳米纤维，溶解去除聚酯、干燥后得到导电的ppy纳米管。

（7）将步骤(6）制备的导电ppy纳米管采用多巴胺水溶液改性、干燥、研磨、灭菌后，分散浸渍于经过滤除菌的生长因子水溶液中，通过纳米管的吸附作用来负载生长因子。

（8）配置海藻酸钠或透明质酸钠的水溶液，向其中加入一定密度的种子细胞悬液，并同时加入步骤（7）制备的负载生长因子的ppy纳米管，得到混合液a，将该混合液a从步骤（5）制备的纳米纤维管体一端注射，海藻酸钠或透明质酸钠与培养基中的钙或镁离子作用后，形成凝胶。

所述制备步骤（1）中，优化的掺杂剂比例为0.5（摩尔比dbsa:ppy），优化的单体与催化剂的摩尔比为7，在0℃下优化的聚合时间为8h。

所述制备步骤（2）中，优化的ppy与生物可降解脂肪族聚酯的重量比为1:10，所配置混合溶液的优选质量体积百分浓度为20%。

所述制备步骤（2）中，高速旋转的金属滚筒，优选的表面线速度范围为12.5m/s-20m/s，纺丝时间不小于10h，获得厚度不低于60um的高度取向平行纤维膜。

所述制备步骤（2）和步骤（6）中使用的生物可降解脂肪族聚酯，可以是相同的，也可以是不同的。

所述步骤（6）中制备的ppy/聚酯复合纳米纤维，是一种以聚酯纤维为芯、以ppy为壳的核壳结构纳米纤维，经氯仿溶解去除芯部的聚酯纤维后，得到中空的ppy纳米管。

所述步骤（3）和所述步骤（7）中，聚酯/ppy复合纤维和ppy纳米管改性所采用的多巴胺水溶液，其优化的多巴胺溶液浓度为2mg/ml，溶液ph值为8.5，改性反应时间为24h。

所述步骤（7）中，ppy纳米管可分别负载不同的生长因子，也可同时负载两种生长因子。

发明效果

本发明为神经再生修复提供的一种具有导电性的纤维管状支架，其特征是具有可设计性和多功能性。该纤维管状支架壁具有的纤维网状结构，使支架具有通透性，利于营养物质和代谢废物的扩散；纤维管状支架的管壁为双层结构，外层的无纺纤维膜，纤维堆积密度高，可阻隔外界纤维组织进入管内生长，影响神经修复，内层的导电平行纤维膜，具有平行于导管延展方向的轴向拓扑结构，利于神经轴突和种子细胞的取向生长，同时，内层纤维膜所具有的导电特性，在电场的刺激下，能够更加促进神经细胞的增殖与分化，有利于神经突的生长与延伸。纤维管状支架的双层结构管壁，它们所应用的生物可降解脂肪族聚酯，可以是相同的，也可以是不同的，由此可根据神经再生对支架完整度保留时间的需要，控制支架管壁内外层具有一致的降解速率或由内到外降解速率降低的梯度。

本发明的导电性纤维管状支架内部填充的含ppy纳米管的导电凝胶材料，其中，ppy纳米管的功能一是作为生长因子的控释载体，功能二是赋予凝胶材料更优异的导电性，功能三是对水凝胶有一定的增强效果；海藻酸钠或透明质酸钠水凝胶的功能是作为种子细胞和负载生长因子的ppy纳米管的载体，通过生长因子的持续释放，为神经组织工程种子细胞提供更好的增殖与分化微环境。此外，导电性纤维管状支架内部填充的含ppy纳米管的导电凝胶材料，还能够起到支撑柔软的纤维管状支架的作用，以防止导管结构的塌陷，获得好的神经再生修复效果。

以下结合具体实施方式对本发明的内容进行详细说明，但本发明并不限于以下这些实例，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明：

图1无规排列的无纺聚（丙交酯-乙交酯）共聚物（plga）纤维的sem图。

图2高度取向的平行排布的plga/ppy复合纤维的sem图。

图3ppy纳米管的tem图。

具体实施方式：

实施例1

（1）将4gpy和10gdbsa溶解于100ml去离子水，置于冰浴中，机械搅拌下，向其中逐滴加入预冷的aps水溶液[20%（w/v）]10ml，在机械搅拌下在py/dbsa溶液中引发py聚合，反应温度控制在0℃，8h后加入过量甲醇使反应终止，离心收集黑色沉淀物，分别用去离子水、甲醇、丙酮洗涤，直至液体变为无色透明。将黑色固体产物溶于氯仿、过滤除去不溶物、旋转蒸发去除溶剂，制备得到可溶性ppy。

（2）将2gplga7525(丙交酯含量75mol%，分子量10万)溶于5.5ml氯仿，将0.2g步骤（1）制备的ppy溶于5.5mldmf，两者等比例混合后得到质量体积百分比浓度为20%的混合溶液，以高速旋转（表面线速度16.7m/s）的金属滚筒为接收装置,静电纺丝制备平行的plga/ppy复合纤维膜a，其中plga7525与ppy的重量比为10。纺丝参数为：接收距离20cm，流速0.4ml/h，电压15kv，滚筒转速1500rpm。

（3）将0.6g多巴胺盐酸盐溶解于300ml去离子水，用tris调节水溶液ph值为8.5，将步骤（2）制备的高度平行取向的聚酯/ppy复合纤维膜，浸泡在多巴胺水溶液中，室温下振荡反应处理24h。取出后用去离子水清洗真空干燥后，固定在铝箔上。

（4）将2gplga7525溶于10ml的三氟乙醇中，得到浓度为20%的纺丝液，采用步骤（3）固定有平行纤维膜a的铝箔为接收装置，通过静电纺丝在其上直接堆积纤维无规排列的无纺plga7525纤维膜，得到双层纤维膜b。纺丝参数为：接收距离20cm，流速0.6ml/h，电压18kv。

（5）将步骤（4）制备的双层纤维膜b，以平行纤维膜为内层，垂直于纤维取向方向卷曲成管，缝合固定并运用紫外灭菌得到双层的纤维管体。管体长度10-60mm,内径为0.5-10mm,壁厚为0.1-0.3mm。

（6）采用铝箔为接收装置，对步骤（4）中的plga7525溶液进行静电纺丝，纺丝参数同步骤（4），得到无纺纳米纤维膜c。配置浓度均为14mmol·l^-1的py和对甲苯磺酸钠混合水溶液（摩尔比为1:1）。将100mm×70mm大小纤维膜c浸泡于100ml上述混合溶液中，超声处理30s,0℃孵化1h后,加入50ml预冷的浓度为38mmol·l^-1氯化铁（fecl3）水溶液，0℃下振荡聚合10h。将膜取出用去离子水清洗，然后用氯仿浸泡48h,取出干燥得到导电的ppy纳米管，直径为300-600nm，管壁厚80-130nm。

（7）将步骤(6）制备的导电ppy纳米管采用步骤（3）中多巴胺水溶液改性方法处理，干燥后充分研磨并紫外灭菌。将0.01mgngf溶解在10ml去离子水中，过滤除菌，将灭菌后的0.1gppy纳米管分散浸渍于促神经生长因子水溶液中，通过纳米管的吸附作用来负载生长因子。

（8）配置浓度为6%（w/v）透明质酸钠的水溶液，过滤除菌后加入步骤（7）制备的负载生长因子的ppy纳米管，加入含钙、镁离子的hanks平衡盐溶液（cellgro公司），混合均匀使浓度达到5%，得到混合液a，将该混合液a从步骤（5）制备的纳米纤维管体一端注射，透明质酸钠与平衡盐溶液中的钙或镁离子作用后，形成凝胶，得到一种负载ngf的神经组织工程导电纤维管状支架。

实施例2：

采用与实施例1相同的方法制备填充导电水凝胶的导电纤维管状支架，除管状支架的外层生物可降解聚酯无纺纤维膜，采用降解速度慢于plga7525的聚左旋乳酸（plla，分子量10万)来制备，由此得到纤维管壁从内到外具有一定降解梯度的一种负载ngf的神经组织工程导电纤维管状支架。

步骤（4）操作如下，其他操作步骤同实施例1：

将1gplla溶于10ml三氟乙醇，得到质量体积百分比浓度为10%的粘稠溶液，将固定有平行纤维膜a的铝箔为接收装置，通过静电纺丝在其上直接堆积纤维无规排列的plla纤维膜得到双层纺丝纤维膜c。纺丝参数为：接收距离20cm，流速0.4ml/h，电压15kv。

实施例3：

采用与实施例1相同的方法制备填充导电水凝胶的导电纤维管状支架，除步骤（7）中所配置的生长因子水溶液为同时含有ngf和bfgf的溶液，由此得到一种同时负载两种促神经再生生长因子的神经组织工程导电纤维管状支架。

步骤（7）操作如下，其他操作步骤同实施例1：

将步骤(6）制备的导电ppy纳米管采用步骤（3）中多巴胺水溶液改性方法处理，干燥后充分研磨并紫外灭菌。将0.01mgngf和0.01mgbfgf同时溶解于10ml去离子水，过滤除菌，将灭菌后的0.1gppy纳米管分散浸渍于促神经生长因子水溶液中，通过纳米管的吸附作用来负载两种生长因子。

实施例4：

采用与实施例1相同的方法制备填充导电水凝胶的导电纤维管状支架，除在其内部填充的水凝胶材料中负载雪旺细胞，由此得到一种同时负载促神经再生的种子细胞和生长因子的神经组织工程导电纤维管状支架。

步骤（8）操作如下，其他操作步骤同实施例1：

选用生长状态较好的雪旺细胞，配置浓度为200个/ml的细胞悬液。配置浓度为6%透明质酸钠的水溶液，过滤除菌后加入步骤（7）制备的负载生长因子的ppy纳米管，加入细胞悬液混合均匀使透明质酸钠浓度达到5%，得到混合液b，将该混合液b从步骤（5）制备的纳米纤维管体一端注射，透明质酸钠与培养基中的钙或镁离子作用后，形成凝胶，由此得到一种同时负载促神经再生的种子细胞和生长因子的神经组织工程导电纤维管状支架。