一种三组份生物胶水及其制备与应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种用于软组织及重要器官缺损修复的三组份生物胶水、及其制备与应用，可用于组织工程领域。

(二)

背景技术：

软组织包括人体的皮肤、皮下组织、肌肉、肌腱、韧带、关节囊、滑膜囊，神经、血管等。软组织经常会由于外力作用导致创伤或缺损，其中小创伤可以自发修复，对于大创伤和缺损，机体的自修复能力十分有限。重要器官，如肝脏，心脏，也会由于先天性的疾病或者外力作用导致缺损，同样，机体自我修复能力也十分有限。

对于大创伤和重要器官缺损，在临床治疗上也缺少相应的修复手段。目前主流的治疗手段是自体组织移植和手术缝合，通过对缺损处先用止血布按压止血，然后植入自体组织，再进行手术缝合来达到促进组织缺损修复的目的。但这些治疗方式存在很多缺陷，如：按压止血会导致组织坏死，自体组织供应不足以及手术缝合会导致疤痕等。另外，多数缺损修复需要二次手术才能完成，创伤也较大，给患者带来不便、痛苦和经济上的负担。因此，我们希望找到一种简单有效的治疗手段，免去手术治疗的不利影响。

近年来，水凝胶因其操作方便，可塑性强，同时又能够为干细胞增殖分化提供一个适宜的微环境等特点，受到了研究者的广泛关注。美国alikhademhosseini研究团队和中国研究团队利用一种光交联的水凝胶(gelma)混合静电纺丝纤维(plga)作为敷料来促进伤口的愈合。(xinzhao,xiaomingsun,larayildirimeretal.cellinfiltrativehydrogelfibrousscaffoldsforacceleratedwoundhealing,actabiomaterialia,2016.10.017.)。韩国haeshinlee研究团队合成了一种多巴胺改性的透明质酸的水凝胶用来治疗肝脏和心脏缺损。(jisooshin,jungseunglee,changhyunleeetal.tissueadhesivecatechol-modifiedhyaluronicacidhydrogelforeffective,minimallyinvasivecelltherapy,adv.funct.mater.2015,25,3814-3824.)。

然而，上述的几种水凝胶其本身的组织的黏附力或力学性质仍然有待改善，本发明利用醛基和氨基能够反应形成席夫碱的原理，醛基化的天然多糖可以和软组织及重要器官缺损表面的氨基反应生成席夫碱，使水凝胶能够与软组织或重要器官相整合，从而干细胞等细胞可以迁移进入水凝胶内部进行增殖分化，形成新生组织。同时丙烯酸酐接枝的天然高分子可以光交联快速成胶(最快可达1s)，这种三组份生物胶水，一方面具备可调节的力学特性，同时具有组织黏附性且原位成胶，操作方便，可以达到有效修复软组织及重要器官缺损的目的，避免了二次手术带给病人的痛苦。另外，制备生物胶水的原料均是天然高分子或多糖，无毒性，可降解，因此，这种三组份生物胶水是一种理想的软组织及重要器官缺损修复材料。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种用于软组织及重要器官缺损修复的三组份生物胶水及其制备与应用，解决了目前临床治疗供体缺乏和移植物不能与缺损处吻合等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种三组份生物胶水，所述三组份生物胶水由质量浓度1～20％的醛基化天然多糖溶液，质量浓度1～20％的氨基改性天然生物高分子溶液和质量浓度1～15％的丙烯酸酐接枝天然高分子溶液按体积比1:0.1-2:0.1-2混合制成；所述醛基化天然多糖溶液以去离子水或ph值6～6.5的水为溶剂制成，其中天然多糖为葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、羧甲基纤维素或硫酸软骨素中的一种，醛基氧化率为20～50％；所述氨基改性天然生物高分子溶液以去离子水或ph值6～6.5的水为溶剂制成，其中天然生物高分子为透明质酸、明胶、海藻酸钠、硫酸软骨素、丝胶或胶原中的一种，氨基接枝率为40～80％；所述丙烯酸酐接枝天然高分子溶液以去离子水为溶剂制成，其中天然生物高分子为明胶、丝素蛋白、海藻酸钠、羧甲基纤维素、透明质酸或葡聚糖中的一种，丙烯酸酐接枝率为45～85％。

进一步，优选所述三组份生物胶水由质量浓度1～20％的醛基化天然多糖溶液，质量浓度1～20％的氨基改性天然生物高分子溶液和质量浓度1～15％的丙烯酸酐接枝天然高分子溶液按体积比1：1：2混合制成。

进一步，优选所述醛基化天然多糖溶液中天然多糖为葡聚糖、透明质酸或硫酸软骨素中的一种。

进一步，优选所述氨基改性天然生物高分子溶液中天然生物高分子为透明质酸、明胶或海藻酸钠中的一种。

进一步，优选所述丙烯酸酐接枝天然高分子溶液中天然生物高分子为明胶、透明质酸或葡聚糖中的一种。

进一步，优选所述醛基化天然多糖按如下方法制备：1)将天然多糖溶于去离子水或ph为6～6.5的水中，配制成质量浓度1～10％的溶液，待完全溶解后，加入氧化剂，20～35℃避光反应1～24h，之后用乙二醇终止反应；所述氧化剂为高碘酸钠、高氯酸钠、高碘酸钾或高氯酸钾中的一种，所述氧化剂与天然多糖的质量之比为0.5-1：1，所述乙二醇加入量与天然多糖等质量；

2)将步骤1)反应液以去离子水为透析液，15-35℃透析2～7天，之后取透析袋内溶液放置在-20℃下保存0.5～3小时，随后在-80℃放置5～12小时；再在-50℃，1～99pa的条件下冻干24～96小时，即得到醛基化天然多糖。

进一步，优选所述氨基改性天然生物高分子按如下方法制备：将天然生物高分子溶于去离子水，配制成质量浓度为1％～15％的溶液，随后加入酰肼类有机物，完全混合后，加入催化剂，调节ph到3～7并维持4～8h，随后室温搅拌反应24h～48h，将反应液以去离子水为透析液，4-35℃透析2～7天，取透析袋内溶液在-50℃，1～99pa的条件下冻干24～96小时，即得到氨基改性天然生物高分子；所述酰肼类有机物为联氨或己二酸二酰肼；所述催化剂为等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)混合物或等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和1-羟基苯并三氮唑水合物(hobt)混合物，所述酰肼类有机物与天然生物高分子物质的量之比为1-30:1，所述催化剂与天然生物高分子物质的量之比为1-5:1。

进一步，优选所述丙烯酸酐接枝天然高分子按如下方法之一制备：(1)将天然高分子溶于去离子水或二甲基亚砜，配置成质量浓度为1％～15％的溶液，加入丙烯酸酐类有机物，完全混合后，加入催化剂，室温搅拌反应24～48h，将反应液先用过量丙酮沉淀，重溶于去离子水，再以去离子水为透析液，4-30℃透析2～7天，取透析袋内溶液在-50℃，1～99pa的条件下冻干24～96小时，即得到丙烯酸酐接枝天然高分子；所述催化剂为4-二甲基氨基吡啶；所述丙烯酸酐类有机物为甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯；所述丙烯酸酐类有机物体积用量以天然高分子质量计为0.1～5ml/g，所述催化剂与天然高分子的质量之比为0.1～1:1；(2)将天然高分子溶于去离子水或二甲基亚砜，配置成质量浓度为1％～15％的溶液，加入丙烯酸酐类有机物，完全混合后，室温搅拌反应4～10h，将反应液以去离子水为透析液，15-30℃透析2～7天，取透析袋内溶液在-50℃，1～99pa的条件下冻干24～96小时，即得到丙烯酸酐接枝天然高分子；所述丙烯酸酐类有机物为甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯；所述丙烯酸酐类有机物体积用量以天然高分子质量计为0.1～5ml/g。

本发明还提供一种所述三组份生物胶水在制备软组织及器官缺损修复剂中的应用，所述所述修复剂是由三组份生物胶水与光引发剂混匀而成；所述光引发剂为苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐(lap)，加入光引发剂的量为三组份生物胶水中丙烯酸酐接枝天然高分子质量的1～3％。所述修复剂使用方法如下：将三组份生物胶水与光引发剂混匀后，注射到软组织及器官缺损处，先用波长为365nm～420nm的光照射1s～1min，即可完成对软组织及器官缺损修复的应用操作。

本发明所述ph值6～6.5的水是指用盐酸调节去离子水ph值至6～6.5。

由醛基化的天然多糖溶液和氨基改性的天然生物高分子溶液反应形成一层网络结构，具有组织黏附性；丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液添加光引发剂光交联形成另一层网络结构，可以增强水凝胶力学性能，通过注射到软组织及重要器官缺损处原位成型达到修复的目的。所述的软组织及重要器官缺损包括软骨缺损，皮肤缺损，肝脏缺损和心脏缺损。所述的丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液光交联形成一层网络，增强力学性能。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供的一种用于软组织及重要器官缺损修复的三组份生物胶水的组织黏附性，成胶时间和力学强度，可以通过醛基化的天然多糖中醛基含量、氨基改性的天然生物高分子中氨基的接枝量、丙烯酸酐接枝的天然高分子中丙烯酸酐的接枝量，醛基化的天然多糖溶液浓度，氨基改性的天然生物高分子溶液浓度和丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液的浓度来控制。通过增加天然多糖中醛基含量和提高醛基化天然多糖溶液浓度可以增加凝胶的组织黏附性，降低成胶时间和增强力学强度；通过增加氨基改性天然生物高分子中氨基的接枝量和氨基改性的天然高分子溶液浓度，可以降低成胶时间和增强力学强度；增加丙烯酸酐接枝的天然高分子中丙烯酸酐的接枝量和提高丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液浓度可以增强力学强度。本发明采用改性的天然多糖和天然生物高分子，生物安全性好，用法简单，避免了二次手术带给病人的创伤，可用于组织工程领域。

(四)附图说明

图1为实施例1三组份生物胶水实物的照片。

图2为实施例5三组份生物胶水原液注射到软骨缺损处及成胶后的照片。

图3为实施例5三组份生物胶水与软骨整合的扫描电镜图。

图4为实施例6三组份生物胶水内部孔隙及孔径大小的扫描电镜图。

图5为实施例2三组份生物胶水用于修复软骨缺损的结果图(16周后取样)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述(以软骨缺损修复为例)，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1)醛基化天然多糖：将2g羧甲基纤维素溶于100ml去离子水配制成质量浓度2％溶液，待完全溶解后，加入1g高碘酸钠，20℃避光反应1h，之后用1.8ml的乙二醇终止反应。将反应液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，15℃透析2天，之后放置在-20℃下保存0.5小时，随后在-80℃放置5小时，再在-50℃，1pa的条件下冻干24小时，获得醛基氧化率为40％的醛基化羧甲基纤维素。

2)丙烯酸酐接枝天然高分子：将1mmol透明质酸溶于100ml去离子水，随后加入1mmol联氨，完全混合后，加入1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和1mmol的n-羟基丁二酰亚胺(nhs)混合物，调节ph到3并维持4h，随后20℃搅拌反应24h。将反应液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，10℃透析2天，以-50℃，1pa的条件下冻干24小时，获得氨基接枝率为80％的氨基改性透明质酸。

3)丙烯酸酐接枝天然高分子：将10g葡聚糖溶于100ml去离子水配制成质量浓度10％溶液，待完全溶解后，加入10ml的甲基丙烯酸缩水甘油酯。完全混合后，加入1g的4-二甲基氨基吡啶，室温搅拌反应48h。将反应溶液先用过量丙酮沉淀，再重溶于水，倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，4℃透析3天，以-50℃，99pa的条件下冻干72小时，获得丙烯酸酐接枝率为70％的丙烯酸酐接枝的葡聚糖。

4)三组份生物胶水的应用：用去离子水将步骤(1)的醛基化羧甲基纤维素配制成质量浓度5％的溶液，用去离子水将步骤(2)的氨基改性透明质酸配制成质量浓度5％的溶液，用去离子水将步骤(3)的丙烯酸酐接枝的葡聚糖配制成质量浓度10％的溶液，然后按体积比1:1:2混合制成三组份生物胶水，添加占三组份生物胶水中丙烯酸酐接枝天然高分子质量的3％的光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐(lap)，用注射器注射1ml到软骨缺损处，该软骨缺损是利用活体动物新西兰兔后腿关节人工造模，缺损为直径4mm，深4mm的圆柱体，用波长为365nm的光照射30s，从而进行软骨缺损修复。软骨缺损得到很好修复，且新生软骨也原组织界面愈合很好。

实施例2

1)醛基化天然多糖：将10g葡聚糖(分子量70000)溶于100ml去离子水配制成质量浓度10％溶液，待完全溶解后，加入10g高氯酸钠，25℃避光反应3h，之后用9ml乙二醇终止反应。将反应液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，25℃透析7天，之后取截留液放置在-20℃下保存3小时，随后在-80℃放置12小时，再以-50℃，99pa的条件下冻干96小时，获得醛基氧化率为50％的醛基化葡聚糖。

2)氨基改性天然生物高分子：将1mmol(购自sigma)明胶溶于100ml去离子水，随后加入30mmol己二酸二酰肼。完全混合后，加入5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和5mmol的1-羟基苯并三氮唑水合物(hobt)混合物，调节ph到7并维持8h，随后40℃搅拌反应48h。将反应液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，20℃透析7天，取截留液以-50℃，99pa的条件下冻干96小时，获得氨基接枝率为75％的氨基改性明胶。

3)丙烯酸酐接枝天然高分子：将1g海藻酸钠溶于100ml去离子水配制成质量浓度1％溶液，待完全溶解后，加入5ml甲基丙烯酸酐。完全混合后，室温搅拌反应10h。将反应液直接倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，25℃透析4天，取截留液以-50℃，1pa的条件下冻干48小时，获得丙烯酸酐接枝率为80％为丙烯酸酐接枝海藻酸钠。

4)三组份生物胶水的应用：用去离子水将步骤(1)醛基化葡聚糖配制成质量浓度10％的溶液，用去离子水将步骤(2)氨基改性明胶配制成质量浓度10％的溶液，用去离子水将步骤(3)丙烯酸酐接枝海藻酸钠配制成质量浓度15％的溶液，按体积比1:1:2的比例混合制成三组份生物胶水，添加占三组份生物胶水中丙烯酸酐接枝天然高分子质量的2％的光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐(lap)，用注射器注射1ml到软骨缺损处(缺损模型同实施例1)，用波长为405nm的光照射1min，从而进行软骨缺损修复(结果如图5所示)。软骨缺损得到很好修复，且新生软骨也原组织界面愈合很好。

实施例3

1)醛基化透明质酸：将2g透明质酸溶于100ml去离子水配制成质量浓度2％溶液，待完全溶解后，加入2g高碘酸钾，避光25℃反应12h，之后用1.8ml乙二醇终止反应。将反应液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，15℃透析4天，之后取截留液放置在-20℃下保存1.5小时，随后在-80℃放置10小时，再在-50℃，50pa的条件下冻干48小时，获得醛基氧化率为42％的醛基化透明质酸。

2)丙烯酸酐接枝海藻酸钠：将1mmol海藻酸钠溶于100ml去离子水，随后加入15mmol己二酸二酰肼。完全混合后，加入3mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和3mmol的n-羟基丁二酰亚胺(nhs)混合物，调节ph到5并维持6h，随后室温搅拌反应36h。将反应液倒入透析袋(透过分子量为

8000-14000da)中以去离子水为透析液，25℃透析4天，取截留液以-50℃，50pa的条件下冻干72小时，获得氨基接枝率为65％的丙烯酸酐接枝海藻酸钠。

3)丙烯酸酐接枝明胶：将10g(购自sigma)明胶溶于100ml去离子水配制成质量浓度10％溶液，待完全溶解后，加入5ml甲基丙烯酸酐。完全混合后，室温搅拌反应5h。将反应液直接倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，40℃透析5天，取截留液以-50℃，50pa的条件下冻干48小时，获得丙烯酸酐接枝接枝率为75％的丙烯酸酐接枝明胶。

4)三组份生物胶水的应用：用去离子水将步骤(1)醛基化透明质酸配制成质量浓度10％的溶液，用去离子水将步骤(2)氨基改性海藻酸钠配制成质量浓度15％的溶液，用去离子水将步骤(3)丙烯酸酐接枝明胶配制成质量浓度15％的溶液，按体积比1:1:2的比例混合制成三组份生物胶水，添加占三组份生物胶水中丙烯酸酐接枝天然高分子质量的3％的光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐(lap)，用注射器注射到软骨缺损处(缺损模型同实施例1)，用波长为380nm的光照射45s，从而进行软骨缺损修复。软骨缺损得到很好修复，且新生软骨也原组织界面愈合很好。

实施例4

1)醛基化海藻酸钠：将5g海藻酸钠溶于100ml去离子水配制成质量浓度5％溶液，待完全溶解后，加入5g高氯酸钾，35℃避光反应18h，之后用4.5ml乙二醇终止反应。将反应溶液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，30℃透析6天，之后取截留液放置在-20℃下保存2小时，随后在-80℃放置10小时，再在-50℃，99pa的条件下冻干48小时，获得醛基氧化率为35％的醛基化海藻酸钠。

2)氨基接枝硫酸软骨素：将1mmol硫酸软骨素溶于100ml去离子水，随后加入20mmol己二酸二酰肼。完全混合后，加入2mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和2mmol的1-羟基苯并三氮唑水合物(hobt)混合物，调节ph到7并维持5h，随后室温搅拌反应48h。将反应液倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，25℃透析6天，取截留液以-50℃，99pa的条件下冻干72小时，获得氨基接枝率为80％的氨基接枝硫酸软骨素。

3)丙烯酸酐接枝羧甲基纤维素：将3g羧甲基纤维素溶于100ml去离子水配制成质量浓度3％溶液，待完全溶解后，加入3ml甲基丙烯酸酐。完全混合后，室温搅拌反应10h。将反应液直接倒入透析袋(透过分子量为8000-14000da)中以去离子水为透析液，25℃透析5天，取截留液以-50℃，99pa的条件下冻干72小时，获得丙烯酸酐接枝率为65％的丙烯酸酐接枝羧甲基纤维素。

4)三组份生物胶水的应用：用去离子水将步骤(1)醛基化海藻酸钠配制成质量浓度15％的溶液，用去离子水将步骤(2)氨基改性硫酸软骨素配制成质量浓度15％的溶液，用去离子水将步骤(3)丙烯酸酐接枝羧甲基纤维素配制成质量浓度15％的溶液，按体积比1:1:2的比例混合制成三组份生物胶水，添加占三组份生物胶水中丙烯酸酐接枝天然高分子质量的1％的光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐(lap)，用注射器注射到软骨缺损处(缺损模型同实施例1)，用波长为365nm的光照射30s，从而进行软骨缺损修复。软骨缺损得到很好修复，且新生软骨也原组织界面愈合很好。

实施例5

根据实施例3方法制成三组份生物胶水，并用注射器注射1ml覆盖软骨缺损处，先用波长为380nm的光照射45s，37℃恒温箱中再让醛基化的天然多糖和氨基改性的天然生物高分子反应，并与软骨缺口表面氨基反应，待完全成胶后，如图2所示，-20℃下存放2小时，随后-80℃存放过夜，之后以-50℃，99pa的条件冻干48小时，进行扫描电镜制样并拍摄，如图3所示，生物胶水与软骨可以很好的整合，界面光滑，说明生物胶水组织黏附性好。

实施例6

根据实施例3方法制成三组份生物胶水，先用波长为365nm的光照射30s，37℃恒温箱中再让醛基化的天然多糖和氨基改性的天然生物高分子反应，待完全成胶后，-20℃下存放3小时，随后-80℃存放过夜，之后以-50℃，99pa的条件冻干72小时，进行扫描电镜制样并拍摄，如图4所示，分别为50倍，100倍和300倍的电镜图，可以看出，生物胶水内部孔隙率良好，孔径大小在100～200微米之间，适合细胞的迁移，增殖和分化。