，用此洗脱液将蛋白洗脱平衡后，再用盐离子浓度稍高的洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,8mol/L尿素，70mmol/L β-疏基乙醇，130mmol/LNaCl)洗脱，电泳后虽然目 的蛋白含量较高，但是蛋白纯度降低很多，且所有上样蛋白几乎全部洗脱下来，再用lmol/L 的NaCl冲洗，几乎没有蛋白，因此最终将80mmol/LNaCl浓度洗脱的蛋白定为收获蛋白，得到 75ml的体积，蛋白浓度大约为0.5mg/ml。
[0058] 5.VPl包涵体蛋白的Sepharose CL-4B凝胶过滤层析纯化
[0059] 预先装好经酸碱漂洗的Sepharose CL-4B填料(上海源叶生物科技有限公司），对 离子交换纯化后的样品进行PEG20000透析袋包埋浓缩，浓缩后样品浓度大约1.2mg/ml，体 积大约25ml，对浓缩样品进行凝胶过滤层析纯化分析。首先用大量的超纯水冲洗柱子，再用 平衡缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,8mol/L尿素，70mmol/L β-巯基乙醇），直到基线平 衡为止，将离子交换纯化后的样品缓慢上样，用平衡缓冲液冲洗柱子，收集相应的洗脱峰， 最终洗脱体积大约50ml，蛋白浓度大约0.5mg/ml，进行SDS-PAGE电泳分析，结果见（图3)。
[0000] 6. VPl包涵体蛋白洗涤纯化后的内毒素含量检测
[0061]对每一步收集的蛋白样品进行了内毒素检测，鲎试剂内毒素检测试剂盒购自厦门 市鲎试剂实验厂有限公司，由于我们纯化的样品中都含有高浓度的尿素，而尿素对内毒素 试剂盒检测有干扰，因此我们对样品进行了稀释摸索，结果显示稀释2000倍的样品刚好回 收率R值接近100%，此倍数稀释的样品检测结果可靠准确。
[0062] 具体操作如下：首先将lOEU/ml的标准品分别稀释成lEU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ ml、0.1EU/ml;外加无细菌内毒素用水的阴性空白对照;实验组样品测定为:①上样样品稀 释2000倍，稀释前蛋白浓度大约3mg/ml，②离子交换纯化浓缩后样品稀释2000倍，蛋白浓度 大约1.2mg/ml，③凝胶过滤层析纯化浓缩后样品稀释2000倍，蛋白浓度大约0.5mg/ml，④上 样样品稀释2000倍+0.5EU/ml的标准品内毒素，按照操作说明首先加入鲎试剂37°C水浴 1〇111；[11，再加入显色基质37°0水浴61]1；[11，分别加入偶氮化试剂1、2、3，静置51]1；[11后于人545下测 定数值，结果见表1:换算后，上样样品中内毒素含量接近900EU/ml，内毒素带负电，所以阴 离子交换纯化后内毒素含量上升，大约为lOOOEU/ml，而凝胶过滤层析纯化后内毒素含量小 于100EU/ml，符合药典规定标准。
[0063]表1内毒素含量测定
[0065] 7. VPl包涵体蛋白洗涤纯化后的宿主残留蛋白检测
[0066] 对每一步收集的蛋白样品进行了宿主残留蛋白检测，宿主残留蛋白检测试剂盒购 自Cygnus公司，由于样品都是在高浓度尿素存在条件下制备的，而尿素对试剂盒检测有干 扰，首先对样品进行了尿素干扰摸索，结果表明稀释20倍以上的样品溶液对宿主残留蛋白 检测不存在干扰。
[0067] 具体操作步骤如下：将宿主蛋白标准品Ong/ml、lng/ml、3ng/ml、12ng/ml、40ng/ml 和lOOng/ml分别加入包被有残留蛋白抗体的96孔板，实验组样品测定如下:①超声破碎菌 液上清稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍，BCA法测定蛋白浓度分别为400μg/ml、40μg/ml、4yg/ !111、0.4以8/ 1111，这些作为阳性对照，?上样蛋白稀释102倍、103倍、104倍，蛋白浓度分别为3(^ 8/1111、3以8/1111、0.3以8/1111，@离子交换纯化浓缩后样品稀释102倍、10 3倍、104倍，蛋白浓度分 别为12μg/ml、1 · 2μg/ml、0 · 12μg/ml，④凝胶过滤层析纯化浓缩样品稀释IO2倍、IO3倍、IO4 倍，蛋白浓度分别为5μg/ml、0 · 5μg/ml、0 · 05μg/ml，⑤40ng/ml的蛋白标准品+0 · 8mo 1/L的尿 素缓冲液，⑥40ng/ml的蛋白标准品+0.4m〇VL的尿素缓冲液。将这些样品也相应加入96孔 板，加入辣根过氧化酶标记的大肠杆菌宿主蛋白抗体，混匀静置，加入显色液以及终止液， 在λ450下测定吸收值，检测结果见表2:换算后阳性对照的超声菌液残留蛋白大约等于35μ g/ml，明显小于BCA法测得的蛋白浓度，可能由于试剂盒中针对这些蛋白的抗体较少，上样 蛋白的宿主残留蛋白大约为800ng/ml，而经过纯化后的样品几乎检测不到杂蛋白，实验结 果符合药典标准。
[0068]表2宿主残留蛋白含量测定
[0070] 实施例2
[0071] 1.不同免疫佐剂和VPl抗原蛋白混合
[0072]收集到经过凝胶过滤层析柱后的蛋白样品先和氢氧化铝佐剂结合，蛋白样品所在 溶液为(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,8mol/L尿素，70mmol/L β-巯基乙醇），蛋白浓度大约为 0.5mg/ml，体积大约为200μ1，氢氧化铝佐剂用量为200yg，在室温混合静置30min，中间用枪 头混匀，3000rpm离心，去上清，用lOmmol/L pH7.0 HEPES缓冲液漂洗几次，去上清，得到氢 氧化错佐剂包裹的抗原蛋白，即为免疫原①;再将包裹蛋白加入20yg MPLA(Invivogen)佐 剂混合，用lOmmol/L pH7.0 HEPES缓冲液补充到200μ1，作为小鼠的免疫原②;将凝胶过滤 层析纯化后的蛋白样品透析冻干，得到IOOyg蛋白样品和20yg MPLA佐剂混合为免疫原③； 以灭活病毒免疫原，配方如下：向EV71病毒液中加入终浓度为0.2%的甲醛，37°C灭活16小 时，然后加入终浓度为0.2 %的焦亚硫酸钠终止灭活，免疫剂量为每只小鼠 100μΙ 107TCID50/ml的灭活病毒量和50yg的氢氧化铝佐剂混合，用lOmmol/L pH7.0 HEPES补满体 积至200μ1作为免疫原④;另外加上正常小鼠对照组⑤和只免疫氢氧化铝佐剂对照组⑥。
[0073] 2.不同免疫佐剂和VPl抗原蛋白混合后免疫小鼠以及抗血清效价检测
[0074] 选取24只BALB/c小鼠，随机分成6组，每组4只，实验组包括8中的3种不同佐剂混合 的抗原注射(抗原为IOOyg/只），氢氧化铝佐剂混合的灭活病毒免疫组为阳性对照组，其余 氢氧化铝佐剂组和正常小鼠组为阴险对照组，小鼠采用皮下多点注射。
[0075] (1)第一次免疫注射：
[0076] 将配制好的抗原和佐剂混合后分别注射小鼠体内，每只小鼠的抗原注射量为100μ g，在一免后14天对小鼠进行眼球采血，4°C3000rpm离心10min，分离出血清，-80°C冻存待 ELISA检测（IgG检测）。
[0077] (2)第二次免疫注射:一免两周后进行第二次免疫注射，免疫方法剂量同上。在二 免两周后，对小鼠进行眼球采血，将收集到的血液在4°C3000rpm离心10min，分离出血清，-80°C冻存待ELISA检测（IgG检测）。在二免三周和四周后分别对小鼠进行眼球采血，方法同 上，分离出血清，-80°C冻存待ELISA检测（IgG检测）。
[0078] ELISA抗血清效价检测：
[0079] -、样品稀释:样品用PBS倍比稀释，同时设置阴性，阳性，空白对照。
[0080] 二、包被:取可溶性抗原加入包被液溶解，加入50μ1/孔的VPl抗原包被混合液，终 浓度为Iyg/孔，37°C孵育2小时或4°C孵育过夜。
[0081 ]三、洗板:甩掉液体，取一块干净的纱布，将板孔中的液体拍干净。用洗板机洗板三 次，用力拍板，将板孔中的液体拍掉。
[0082] 四、封闭：加200μ1/孔封闭液到酶标板孔中，37°C孵育一个小时，孵育结束后甩掉 板孔中的封闭液干净的纱布上将板子中的液体拍干净。
[0083] 五、一抗:将采集到的血清稀释到1:100加入到酶标板中第一孔(第一孔加入ιοομL 1:100的稀释液，用封闭液稀释，后面加入50μ1的封闭液），后倍比稀释，37°C孵育1.5h。 [0084] 六、二抗：（将二抗稀释到1:5000-1:8000,用封闭液稀释)将稀释到工作浓度的二 抗，以50μ1/孔加到孔中，37°C孵育一个小时。
[0085]七、洗板:甩掉液体，取一块干净的纱布，将板孔中的液体拍干净。用洗板机洗板三 次，再用力拍板，将板孔中的液体拍掉。
[0086] 八、显色和读数：TMB显色，将配制的底物50μ1/孔加到板中，