基因组中的"DNA甲基化"通常是指添加甲基到CpG双核苷酸中胞嘧 啶残基的5'碳（即5-甲基胞嘧啶）。DNA甲基化可以发生在例如CHG和CHH等其它背景 下的胞嘧啶中，其中H是腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。胞嘧啶甲基化也可以呈5-羟基甲基 胞嘧啶形式。还报导了非胞嘧啶甲基化，例如N6-甲基腺嘌呤。
[0075] "组织"对应于任何细胞。不同类型的组织可以对应于不同类型的细胞（例如肝、肺 或血液），但也可以对应于来自不同生物体（母亲与胎儿）的组织或健康细胞与肿瘤细胞。 「生物样品」是指取自个体（例如人类，例如孕妇、癌症患者或怀疑患有癌症者、器官移植接 受者或怀疑患有涉及器官的疾病过程的个体（例如心肌梗塞中的心或中风中的脑））并含 有一或多个相关核酸分子的任何样品。生物样品可以是体液，例如血液、血浆、血清、尿、阴 道液、子宫或阴道冲洗液、胸膜液、腹水、脑脊髓液、唾液、汗水、泪液、痰液、支气管肺泡灌洗 液等。也可以使用粪便样品。
[0076] 术语"癌症等级"可以指癌症是否存在、癌症阶段、肿瘤尺寸、是否存在转移、身体 的总肿瘤负荷和/或癌症严重程度的其它量度。癌症等级可以是数值或其它特征。等级可 以是零。癌症等级还包括与突变或多种突变相关的癌变前或癌前期病状（状态）。癌症等 级可以按各种方式使用。举例来说，筛选可以检查已知先前未患癌症的某人是否存在癌症。 评估可以研宄已经被诊断为患有癌症的某人以监测癌症随时间推移的进展、研宄疗法的效 用或确定预后。在一个实施例中，预后可以表示为患者死于癌症的机率，或在特定持续时间 或时间后癌症进展的机率，或癌症转移的机率。检测可以意指'筛选'或可以意指检查具有 癌症的暗示性特征（例如症状或其它阳性测试）的某人是否患有癌症。
[0077]发明详述
[0078] 表观遗传机制在胚胎和胎儿发育中发挥着重要的作用。但是，人类胚胎和胎组织 (包括胎盘组织）不容易获得（美国专利6, 927, 028)。某些实施例已经通过分析具有母体 循环中存在的游离胎儿DNA分子的样品解决了此问题。胎儿甲基化组可以用多种方式推 断。举例来说，母体血浆甲基化组可以与细胞甲基化组（来自母亲的血细胞）比较并且展 示与胎儿甲基化组相关的差异。作为另一实例，可以使用胎儿特定的等位基因确定特定的 基因座上胎儿甲基化组的甲基化。另外，如尺寸与甲基化百分比之间的相关性所展示，片段 的尺寸可以用作甲基化百分比的指示物。
[0079] 在一个实施例中，全基因组亚硫酸氢盐测序用于在单核苷酸分辨率下分析母体血 浆DNA的甲基化型态（甲基化组的部分或全部）。通过采用母亲与胎儿之间的多态差异，可 以从母体血液样品集合胎儿甲基化组。在另一个实施例中，不使用多态差异，而是可以使用 血浆甲基化组与血细胞甲基化组之间的差异。
[0080] 在另一个实施例中，通过采用肿瘤基因组与非肿瘤基因组之间的单核苷酸变异和 /或拷贝数异常以及来自血浆（或其它样品）的测序数据，可以在怀疑或已知患有癌症的 患者的样品中进行肿瘤的甲基化型态分析。在与健康对照或一组健康对照的血浆甲基化水 平比较时测试个体的血浆样品中甲基化水平的差异可以允许鉴别测试个别为患有癌症。另 外，甲基化型态可以充当揭露癌症类型、例如来自哪一器官、个人已经发展和是否已发生转 移的标记。
[0081] 由于此方法具有无创性，故能够从早期妊娠、晚期妊娠中和产后收集的母体血液 样品连续评估胎儿和母体血浆甲基化组。观测到妊娠相关的改变。所述方法也可以应用于 在中期妊娠期间获得的样品。从妊娠期间的母体血浆推断的胎儿甲基化组类似于胎盘甲基 化组。从母体血浆数据鉴别出印记基因和甲基化有差异的区域。
[0082] 因此，已经研发出一种无仓I」、连续和全面地研宄胎儿甲基化组的方法，因而能够鉴 别生物标记物或直接测试与妊娠相关的病变。实施例也可以用于无创、连续和全面地研宄 肿瘤甲基化组，用于筛选或检测个体是否患有癌症、用于监测癌症患者中的恶性疾病和用 于预后。实施例可以应用于任何癌症类型，包括（但不限于）肺癌、乳癌、结肠直肠癌、前列 腺癌、鼻咽癌、胃癌、睾丸癌、皮肤癌（例如黑色素瘤）、影响神经系统的癌症、骨癌、卵巢癌、 肝癌（例如肝细胞癌）、血液科恶性疾病、胰腺癌、子宫内膜癌、肾癌、宫颈癌、膀胱癌等。
[0083] 首先论述了如何测定甲基化组或甲基化型态的描述，随后描述了不同的甲基化组 (例如胎儿甲基化组、肿瘤甲基化组、母亲或患者的甲基化组以及混合的甲基化组，例如来 自血浆）。随后描述了使用胎儿特定的标记物或通过比较混合的甲基化型态与细胞甲基化 型态对胎儿甲基化型态的测定。胎儿甲基化标记物通过比较甲基化型态来测定。论述尺寸 与甲基化之间的关系。还提供了甲基化型态检测癌症的用途。
[0084] I.甲基化组的测定
[0085] 无数的方法已经用于研宄胎盘甲基化组，但每种方法都有它的限制性。举例来说， 亚硫酸氢钠，一种将未甲基化的胞嘧啶残基改性成尿嘧啶并保持甲基化的胞嘧啶不变的化 学物质，将胞嘧啶甲基化的差异转化成基因序列差异以供进一步询问。研宄胞嘧啶甲基化 的金标法是基于用亚硫酸氢钠处理组织DNA，接着对经亚硫酸氢盐转化的DNA分子的个别 克隆进行直接测序。在分析DNA分子的多个克隆后，可以获得每个CpG位点的胞嘧啶甲基 化模式和定量型态。但是，克隆的亚硫酸氢盐测序是低通量与劳动密集型程序，不易在全基 因组规模上应用。
[0086] 通常消化未甲基化DNA的甲基化敏感性限制酶提供了一种研宄DNA甲基化的低成 本方法。但是，由此类研宄产生的数据局限于具有酶识别基元的基因座并且结果不是定量 的。由抗甲基化胞嘧啶抗体结合的DNA的免疫沉淀可以用于研宄基因组的大区段，但往往 会偏向具有稠密甲基化的基因座，因为抗体结合于此类区域的强度更高。基于微阵列的方 法依赖于用于研宄的探针的先验设计和探针与标靶DNA之间的杂交效率。
[0087] 为了全面地研宄甲基化组，一些实施例使用大规模平行测序（MPS)基于每个核苷 酸和每个等位基因来提供全基因组信息和甲基化水平的定量评估。近来，先亚硫酸氢盐 转化后全基因组MPS已经变得可行（李斯特等人2008细胞；133:523-536(RListeret al2008Cell; 133:523-536))。
[0088] 在少量的将全基因组亚硫酸氢盐测序应用于研宄人类甲基化组的已发表研宄 (李斯特等人 2〇〇9 自然；462:315_322(RListeretal.2〇〇9Nature;462:3l5_322);劳 伦特等人 2010 基因组研宄；20:320-331(Laurentetal.2010GenomeRes;20:320-331); 李等人2010美国科学公共图书馆?生物学；8:el000533(YLietal.2010PLoSBiol; 8:el000533);和库里斯等人 2012 自然遗传；44:1236-1242(MKulisetal.2012Nat Genet;44:1236-1242))中，两个研宄集中于胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞（李斯特等人 2009自然；462:315-322 ;劳伦特等人2010基因组研宄；20:320-331)。两个研宄都分析细 胞系来源的DNA。
[0089] A?全基因组亚硫酸氢盐测序
[0090] 某些实施例可以解决前述的挑战并能够全面、无创和连续地研宄胎儿甲基化组。 在一个实施例中，将全基因组亚硫酸氢盐测序用于分析在孕妇血液循环中发现的游离胎儿DNA分子。尽管血浆DNA分子的丰度低和片段性，我们仍能够从母体血浆组装高分辨率胎儿 甲基化组并观测到随着妊娠进展相关的连续改变。假定对无创产前测试（NIPT)的兴趣非 常浓厚，实施例可以提供一种用于发现胎儿生物标记的强大的新工具，或充当实现胎儿或 妊娠相关疾病的NIPT的直接平台。目前提供了来自各种样品的全基因组亚硫酸氢盐测序 的数据，从其中可以得出胎儿甲基化组。在一个实施例中，此项技术可以应用于并发有先兆 子痫或子宫内生长迟缓或早产的孕妇中的甲基化型态分析。对于此类妊娠并发症，因为其 无创性，此项技术可以连续使用从而允许监测和/或预后和/或监测对治疗作出的反应。
[0091] 图1A展示表100,为根据本发明的实施例，母体血液、胎盘和母体血浆的测序结 果。在一个实施例中，对以下各者的经亚硫酸氢盐转化的DNA文库进行全基因组测序，所述 DNA文库是使用甲基化DNA文库衔接子（伊路米那（Illumina))(李斯特等人2008细胞； 133:523-536)制备：早期妊娠收集的血液样品的血细胞、CVS、分娩时收集的胎盘组织、早 期妊娠和晚期妊娠以及产后时期期间收集的母体血浆样品。还分析从一个成年男性和一个 成年非怀孕女性获得的血细胞和血浆DNA样品。在这一研宄中，产生总共95亿对的原始序 列读数。每个样品的测序覆盖度展示在表100中。
[0092] 对于早期妊娠、晚期妊娠和产后母体血浆样品，可唯一性地比对到人类参考基因 组的序列读数分别达到50倍、34倍和28倍的平均单倍体基因组覆盖度。对于从孕妇获得 的样品，基因组中CpG位点的覆盖率在81%到92%范围内。针对早期妊娠、晚期妊娠和产 后母体血浆样品，横跨CpG位点的序列读数分别等于每链33倍、每链23倍和每链19倍的 平均单倍体覆盖率。所有样品的亚硫酸氢盐转化效率>99. 9% (表100)。
[0093] 表100中，不明确率（标记"a"）是指同时比对到参考人类基因组的沃森（Watson) 和克里克（Crick)链的读数的比例。A转化率是指内部对照ADNA通过亚硫酸氢盐处理而 转化成"胸腺嘧啶"残基占未甲基化胞嘧啶的比例。H-般等于A、C或T。"a"是指可以映 射到特定基因座但无法分配给沃森或克里克链的读数。"b"是指具有一致起始和结束座标 的成对读数。对于"c"，XDNA在亚硫酸氢盐转化前添加到每个样品中。X转化率是指在 亚硫酸氢盐转化后转化成"胸腺嘧啶"的胞嘧啶核苷酸的比例，并且用作成功亚硫酸氢盐转 化率的指示。"d"是指存在于参考人类基因组中并且在亚硫酸氢盐转化后保持为胞嘧啶序 列的胞嘧啶核苷酸的数目。
[0094] 在亚硫酸氢盐改性期间，未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶并随后在PCR扩增后转 化成胸腺嘧啶，而甲基化胞嘧啶将保持完整（弗罗梅尔等人1992美国国家科学院院刊； 89:1827-31(MFro_eretal.l992ProcNatlAcadSciUSA;89:1827-31))。在测序和 比对后，个别CpG位点的甲基化状态可以根据CpG序列中的胞嘧啶残基的甲基化序列读数 "M"（甲基化）的计数和未甲基化序列读数"U"（未甲