用于获得1-蔗果三糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品领域和制糖工业，特别地涉及从蔗糖或其他包含蔗糖的原料（例 如蜂蜜、糖膏、糖浆等）开始来获得果寡糖（F0S)。 现有技术
[0002] F0S由具有1-9个通过0 2 - 1键与蔗糖分子相连接的果糖残基的线性链组成 (Yun, 1996, Enzyme Microb.Technol.，19:107-117)。这些化合物的重要性在于，其可以用 作人以及动物的饮食的不可消化成分，从而通过经由选择性地刺激在结肠中的一种或多种 类型的微生物的生长或活性而产生有益作用来提供益生效应。在所述微生物之中包括乳杆 菌属（Lactobacillus)和双歧杆菌属（Bifidobacterium) (Gibson 和 Roberfroid, 1995, J. Nutr.，125 (6) : 1401-12)。在自然界中，F0S通过植物、真菌、细菌和某些酵母的果糖基转移 酶（FTF，EC 2. 4. 1. 9)和0 -呋喃果糖苷酶（EC 3. 2. 1. 26)类型的酶的作用而产生（Guio 等人，2009, Recent Patents on Food, Nutrition&Agriculture.，1 (3): 221-30)。
[0003] 目前，F0S的工业生产遵循两种策略来进行：菊粉的部分降解 (Yun. , 1996, Enzyme Microb.Technol. , 19:107-117 ；Franck. , 2002, British Journal of Nutrition,87(2) :S287_S291)，或者通过使用主要由真菌（黑曲霉（Aspergillus niger)、 日本曲霉（A. japonicus)、米曲霉（A. oryzae)、棘抱曲霉（A. aculeatus)和出芽短梗 霉（Aureobasidium pullulans))产生的具有高的转果糖基酶活性的0-呋喃果糖苷酶 或 FTF 而从鹿糖开始进行酶促合成（Yun.，1996, Enzyme Microb. Technol.，19:107-117 ; Vaftkovd 等人，2008, Chemical Papers, 62 (4) : 375-381)。这两种技术均产生其聚合 度（DP)从2至10变化的F0S的混合物，其主要组分为：1-蔗果三糖（GF 2)、真菌四糖 (GF3)、果糖基真菌四糖（GF4)、黑麦双叉寡糖（bifurc 〇Se)(GF3)、菊粉二糖（F2)、菊粉三 糖（F3)和菊粉四糖（F 4)。1-蔗果三糖是具有最大商业利益的F0S，这是由于其低热量 甜味剂的和益生的双重作用，以及由于其作为用于糖尿病患者的糖的可能用途（Vega和 Zuniga-Hansen. , 2011, Bioresource Technology, 102(22), 10180-10186)〇
[0004] 通过蔗糖的生物转化来生产F0S的技术和专利文献基于野生型微生物的细胞 和酶（固定化的或游离的）的使用，所述野生型微生物例如为：出芽短梗霉（Smith和 Luenser, 1980，专利 US4309505)、海赛曲霉（A. phoenicis) (Van Dooren 等人，1988， 专利 US4849356)、黑曲霉（Hidaka, H?等人，1988, Agric. Biol. Chem.，1181)、棘孢曲 霉（Fernandez-Arrojo等人，2009，专利申请W0 2010/103150 Al)，酵母红酵母属物种 (Rhodotorula sp.) (Aguiar de Oliveira 等人，2007，专利申请 BRPI0705359-2 A2)，以 及细菌产左聚糖微杆菌（Microbacterium laevaniformans) (Hatcher 等人，1988，专利 US4927757)、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis)(0htsuka，K.等人，Biosci. Biotech. Biochem.，56 (9)，1373-1377, 1992)、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis) (Hatcher 等 人，1988,专利US4797360)等。这些生产方法在各种不同类型（主要是搅拌罐和固定床类 型）的反应器中实施，所述反应器要么以不连续的方式要么以连续的方式运作。迄今所使 用的不连续方法具有这样的限制：释放出的葡萄糖的积累抑制了合成反应。另一方面，使用 固定化在各种不同支持物上的酶或细胞的连续方法通过生物催化剂的再使用而降低了生 产过程的成本，并且还减小了葡萄糖的抑制效应。然而，所述连续方法具有这样的限制：不 可以以高流量进行运作，这归因于向底物扩散和接近的限制。调节反应时间以避免水解活 性，所述时间取决于初始的酶活性量/克底物，并且在8和24小时之间变化，在此期间合成 1-蔗果三糖、真菌四糖和果糖基真菌四糖的混合物。
[0005] 从其碳水化合物组成为大约20-25 %的葡萄糖、10-15 %的蔗糖、5 %的果糖和 55-60 %的总F0S的反应产物的混合物开始和从1-蔗果三糖浓度可以在40和60 %之间 变化的F0S开始来获得纯度大于90%的或者以晶体形式的1-蔗果三糖（Tetsuhiro等 人，1995,专利 US5463038 ;Koichiro 等人，2010,专利申请 JP2010273580-A)，是一个极其 复杂的过程，其从技术-经济的观点来看对于其在食品中的使用来说是难以实现的。从技 术-经济的观点来看，1-蔗果三糖的色谱法分开仅当在混合物中其浓度高于总F0S的80% 时才是切实可行的（Nishizawa等人，1996,专利US6479657)。
[0006] 其F0S内容物主要为1-蔗果三糖（大于所述混合物的糖类的80 % )的 反应混合物的获得是罕见的。已经通过源自于某些真菌例如棘孢曲霉（Hang和 Woodams，1995，Biotechnology Letters, 17:295-298)和日本曲霉 ATCC 20236 的酶，依靠 使用低于 227g/L 的鹿糖浓度（Mussatto 等人，2009, Journal of Molecular Catalysis B:EnZymatic，59:76-81)，以高水平合成了 1-蔗果三糖。在这两个报告中，1-蔗果三糖 占存在于混合物中的总F0S的大约71%，但是当检定高于500g/L的蔗糖浓度时，1-蔗果 三糖的百分比降低至接近或低于60%的值（Ghazi等人，2005，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，35:19-27)。黑曲霉 ATCC 20611、娄地青霉（Penicillium roqueforti)和短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis)的0-呋喃果糖苷酶能够在 500g/L的蔗糖的浓度下，分别以76. 7 %、86. 7 %和91. 3 %产生1-蔗果三糖（Nishizawa 等人，2002,专利US6479657 B1)。虽然这些数字显示娄地青霉和短柄帚霉的酶在1-蔗 果三糖的产量方面优于黑曲霉的酶，但在生产率和稳定性方面则不是这样。此外，这 两种微生物均未被认为对于在食品中应用来说是安全的（GRAS (General Recognized as Save)或 QPS(Qualified Presumption of Safety)) (EFSA Panel on Biological Hazards.，2009，EFSA Journal，7(12):1431 ;Cuenca_Estrella 等人，2003,Antimicrob Agents Chemother, 47(7):2339-2341) 〇
[0007] 在工业发酵中丝状真菌的使用是另一个巨大的生产限制，因为菌丝缠绕到搅拌器 的推进器中，从而损坏其翼板，并且所述菌丝经常倾向于阻塞发酵罐的空气扩散器（Ahmad 等人，2010, Bioprocess Biosyst Eng. ,33, 599-606)。
[0008] 在各种不同的0-呋喃果糖苷酶之间的氨基酸序列同一性的研宄用作用于获得 黑曲霉的该酶的突变型形式的工具。通过在缺乏呋喃果糖苷酶活性的同一真菌的菌 株中表达编码该突变型酶的基因，达到了 93. 5 %的总F0S相应于1-蔗果三糖，当该酶在 550g/L的蔗糖浓度下反应时（Nakamura等人，2010,专利US7655449)。
[0009] 然而，还未找到技术上可行的FTF生产系统（其允许所述酶的商业可得 性），以用于F0S的工业生产，更特别地说用于特异地生产1-蔗果三糖（Vega和 Ziiniga-Hansen.，2011，Bioresource Technology, 102(22)，10180-10186)。真菌的培养以 及随后的内源性FTF的提取和/或纯化是主要的限制，因此需要调查研宄其他宿主的使用。
[0010] 作为旨在揭示和描述在植物中果聚糖的合成机制的基础性调查研宄的结果， 已经发表了与编码作用于作为底物的蔗糖的酶FTF的基因的分离有关的工作。所述基 因来源于各种不同的植物物种，例如：菊苣（Cichorium intybus)(De Halleux和van Cutsem.，1997,Plant Physiol, 113:1003-)、大麦（Hordeum vulgare)(Hochstrasser 等 人，1998，FEBS Letters，440:356_360)、菊芋（Helianthus tuberosus)(Van der Meer 等人，1998，Plant J.，8 月 15 日，（4) :489_500)、_ 状羊茅（Festuca arundinacea) (Luscher 等人，2000, Plant Physiology, 124 (3) : 1217-1227)、特基拉龙舌兰（Agave tequilana) (Avila-Fernandez 等人，2007,