一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蔗糖-6-乙酸酯的制备方法技术领域，特别涉及一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法。
【背景技术】
[0002]三氯蔗糖是迄今为止人类开发的一种最完美的强力甜味剂，蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖合成的关键中间体。此外，蔗糖酯由于其卓越的应用性能和良好的生物降解性能及毒理学性质已被广泛应用于食品、医药、化妆品和洗涤剂中，蔗糖-6-乙酸酯属于一种重要蔗糖酯。本发明的非水相反应体系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯，在生物工程和医药领域具有重要的工业应用价值。
[0003]目前，蔗糖-6-乙酸酯的合成方法包括化学法和生物酶法。化学法主要有直接酯化法和二丁基氧化锡法合成蔗糖-6-乙酸酯。Mufi等(美国专利n0.4380476)用乙酸酐在吡啶催化下将蔗糖进行6位羟基的单酯化，生成蔗糖-6-乙酸酯；王小强等(中国专利200710074157.9)将在蔗糖极性非质子溶剂中，加入乙酰化试剂乙酰腈进行酯化生成蔗糖-6-乙酸酯。这两种直接酯化法易产生多乙酰化的蔗糖衍生物，且蔗糖-6-乙酸酯难以分离、收率较低。Navia等在US4950746中将二丁基氧化锡用于蔗糖_6_乙酸酯的制备中，该方法缺点是收率不高，含量偏低，对反应条件和分离设备要求高。
[0004]生物酶法相对于化学合成法最大优势是其高效专一性，具有广阔的应用前景。专利200680034904.X利用固定化Aureobasidium pullulans全细胞催化鹿糖和葡萄糖-6-乙酸酯形成蔗糖-6-乙酸酯，但转化率较低，仅为32%;魏远安等(中国专利201210112625.8)利用巨大芽孢杆菌固定增值细胞和固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯，产率达到80 %，但操作步骤较多，需多个菌株和酶参与反应，且成本较高。
[0005]鉴于目前蔗糖-6-乙酸酯合成方法的不足，提出一种在非水相反应体系中利用米曲霉果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的新方法。
【发明内容】
[0006]针对目前合成技术的不足，本发明提供一种利用米曲霉果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法。本发明包括果糖基转移酶制备、固定化酶技术、在非水相反应体系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯以及蔗糖-6-乙酸酯分离纯化。
[0007]一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其包括如下步骤:
[0008]S1、果糖基转移酶的制备；
[0009]S2、固定化果糖基转移酶的制备；
[0010]S3、非水相反应体系中果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯；
[0011]S4、蔗糖-6-乙酸酯的分离纯化。
[0012]在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤SI包括如下子步骤:
[0013]SI 1、选择菌种及培养基
[0014]其中菌株为:米曲霉Aspergillus oryzae ZZ-Ol ；
[0015]培养基的制作如下，在IL的培养基中:土豆200g，葡萄糖20g，加水lOOOmL，在加热器上加热至沸腾，沸腾时间为20min，并且用3层纱布过滤，滤渣弃取；在滤液中加入NaNO3为 2g，K 2ΗΡ04为 lg, KCl 为 lg, MgSO 4为 0.5g，补充水分至 100mL,将 pH 值调节至 7.0 ；28°C恒温振荡培养48h，其中转速200rpm/min，获得菌液；
[0016]S12、果糖基转移酶制备
[0017]菌液培养48h后，将培养物在14，000rpm/min的条件下离心20min，收集上层清液；使用85%硫酸钱对收集上层清液进行分级沉淀，经14，000rpm/min离心20min后，将沉淀重悬于0.02M的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液pH值为7.2，为下一步离子交换层析做准备;
[0018]将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，磷酸盐缓冲液(pH 7.2)充分平衡后，将蛋白样品上样；两倍柱体积的起始缓冲液将未吸附成分洗脱后，采用线性梯度0.01-1.0M的NaCl进行洗脱，收集活性成分；
[0019]将葡聚糖凝胶Superdex 200装柱(L 6 X 70cm2)，(λ 02M磷酸盐缓冲液(ρΗ7.2)充分平衡后，将离子交换层析得到的蛋白样品上样；上样量为l_2mL，流速8mL/h ;收集洗脱成分进行活性测定及蛋白电泳。
[0020]SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后的果糖基转移酶为单一条带，分子量约为70KD左右，如图1所示；
[0021]在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤S2包括如下子步骤:
[0022]采用反相悬浮法与溶胶凝胶法结合制备磁性壳聚糖微球，并以此为载体，京尼平为交联剂，对纯化的果糖基转移酶进行固定化。
[0023]磁性壳聚糖微球的制备:在容量为100mL三口烧瓶中，加入油相(150mL煤油+3.5g Tween 80)，开动搅拌器(搅拌速度600r/min)，缓慢加入90g磁性壳聚糖溶液(醋酸浓度为2%，壳聚糖浓度为4% ,Fe3O4含量为5% )，连续搅拌lh，形成均匀的油包水乳化液，再迅速加入凝结液(V(2mol/L NaOH): V (乙醇)=4: I)中，保持磁力搅拌30min，停止搅拌，放置过夜，备用。
[0024]京尼平交联磁性壳聚糖微球的制备:称取多孔磁性壳聚糖微球4g于10mL具塞锥形瓶中，加入16mL 0.6g/L京尼平水溶液，55°C交联8h，二次蒸饱水洗净残余京尼平，放入4 C冰箱中冷减待用。
[0025]果糖基转移酶的固定化:称取京尼平交联多孔磁性壳聚糖微球2g于10mL具塞锥形瓶中，再加入40mL 50mg/L果糖基转移酶溶液，在25°C下静止固定16h，以0.lmol/L硼酸缓冲溶液(pH 8.0)洗至使考马斯亮蓝溶液不变蓝为止，得到的固定化酶放入4°C冰箱中冷藏待用。
[0026]在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤S3包括:
[0027]果糖基转移酶是一类能够将蔗糖或多聚果糖中的果糖基转移到不同受体底物的糖苷转移酶。本发明以葡萄糖-6-乙酸酯和蔗糖作为反应底物，经果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯和葡萄糖，如图2所示。
[0028]近年来，离子液体正被开成成为一种新型的非水生物催化反应的绿色介质。本发明涉及在离子液体与有机溶剂混合反应介质中，利用果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯。反应体系如下:蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯摩尔比4: 1，固定化果糖基转移酶40mg/mL，反应介质离子液体[Dmim] [PF6]与叔丁醇体积比为1: l，5mM磷酸缓冲液(pH 6.0), 55 °C水浴反应20h。在该条件下，蔗糖-6-乙酸酯产量达到57.2g/L,且产率可达到86.2%，固定化酶可以反复使用4-6次。
[0029]通过LC-MS检测酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，其中LC-MC条件为:
[0030]液相色谱条件:色谱柱UPLC HSS T3柱，其中色谱柱UPLC HSS T3柱10cmX2.1mm,1.8ym, waters ;柱温40°C ;流动相乙腈A和0.1 %甲酸B，上样前先用50%流动相B平衡柱子6min，上样后再用流动相30% A和70% B洗脱，流速0.2mL/min ；
[0031]质谱条件:检测模式为ESI+ ;喷雾电压5kV ;锥孔电压30V ;源温100°C ;脱溶剂温度300°C ;全扫描范围m/z 50?1000。
[0032]果糖基转移酶催化合成产物蔗糖-6-乙酸酯分析鉴定。以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，果糖基转移酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，一级与二级质谱表明蔗糖-6-乙酸酯母离子[M+Na，m/z 407]通过断裂糖苷键生成质荷比(m/z)为245(葡萄糖-6-乙酰基)和185(果糖基)的特征碎片离子