一种混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别设及一种利用混菌发酵生产1，3-丙二醇的 方法。
【背景技术】
[000引 1，3-丙二醇仰0)是一种重要的化工原料，广泛应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、 抗冻剂等行业，还可用作医药和有机合成的中间体。1,3-丙二醇还可作为聚合物单体合成 高分子材料，特别是合成性能优异的新型聚醋纤维聚对苯二甲酸丙二醋（PTT)。PTT被认为 是一种兼具聚对苯二甲酸己二醋（阳T)的高性能和聚对苯二甲酸了二醋（PBT)的易加工性 的新型聚醋材料，并且具有自然循环的可生物降解特性，是目前合成纤维新品种开发的热 点。该些都表明1,3-丙二醇有着良好的应用前景，但价格偏高却阻碍了其广泛应用。
[0003] 1，3-丙二醇的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学法是用化工原 料经过一系列化学催化反应，最终合成1，3-丙二醇；生物法是指微生物利用可再生的原 料甘油或者葡萄糖转化为1，3-丙二醇，相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再 生、污染小和成本低等优点，故成为现在1,3-丙二醇生产研发的热点。至今所有被发现的 1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌化lebsiellapneumoniae)、弗氏巧樣酸 杆菌（CitrobacterfreudU)和了酸梭菌（Clostridiumbutyri州m)具有较高的 1,3-丙 二醇转化率和生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性，因此具有较高的开发前景， 从而得到了较多关注。目前生产1，3-丙二醇的微生物法大致可分为=类；一是用肠道细 菌将甘油歧化为 1，3-丙二醇扣SP5254467 ;EP0373230A1 ;ZL01117282. 7);二是W葡萄糖 为底物利用基因工程菌生产 1，3-丙二醇（PCT/US96/06705 ;USP5599689 ;USP6025184 ;W0 96/35796 ;W09821340 ;W09821339 ;ZL96195288) 是将生产甘油和生产 1,3-丙二醇的两 株菌混合培养扣SP5599689)。该些方法各有优缺点，第一种方法的产物转化率较高，但菌种 对甘油的耐受性较低，产物浓度有待提高；第二种方法可W降低原料成本，产物浓度较高， 但基因工程菌的稳定性还有待进一步验证；第=种方法有助于减少两步发酵的时间，但由 于两种菌的生长条件不尽相同，如产甘油菌通常在好氧条件下生长，而产1,3-丙二醇菌通 常在厌氧条件下生长，前者的底物葡萄糖对后者有抑制作用，二者的最适抑和温度也存在 差异，因此很难取得较为理想的效果。
[0004] W廉价的粗甘油（如生物柴油的副产物）为底物，通过从活性污泥中筛选出的混 菌发酵生产1, 3-丙二醇被证明是可行的。如MargaridaF.Temudo等人炬iotechnology andBioengineering, 2008, 100化）：1088-1098)利用从酒厂废水和±豆淀粉加工厂污泥中 的混菌进行甘油发酵，其利用的甘油浓度仅为4~25g/l，且其主产物为己醇，1，3-丙二醇 的转化率相当低，仅为 0. 16mol/mol;PriscillaA.Selembo等人炬iotechnologyandBio engineering, 2009, 104化）：1098-1106)利用来自±壤、堆肥和污泥中的混菌来生产氨气和 1，3-丙二醇，但其可利用的甘油浓度很低，仅为3g/L。另有学者将1，3-丙二醇菌和甲烧菌 在一个发酵罐的两侧同步发酵炬ioprocessBiosystEng, 2010, 33:507-523)，利用甲烧菌 解除有机酸对甘油发酵的抑制，有利于后续分离，但发酵效果并不显著。
[0005] 目前，使用高浓度甘油发酵生产1,3-丙二醇也有了一些研究。CN102421907A 公开了一种经遗传修饰的丙酬了醇梭菌，W90-120g/l，优选约105g/L的初始甘油浓度 连续发酵，产物中1,3-丙二醇仅为32.68g/l，生产强度为2g/(L.h)。DonnaDietz等人 (BioprocessBiosystE：ng, 2014, 37:225-233)利用选自沼气池污泥中的混菌进行高浓度 甘油发酵，但其最高耐受甘油浓度仅为95g/l，且在2化左右仅能消耗约50g/L甘油，随后便 不再消耗。马彬彬等考察了甘油浓度对克雷伯氏杆菌的生长及合成1，3-丙二醇的影响，经 多次甘油耐受后消耗最高甘油浓度113. 98g/l，产生1，3-丙二醇51. 89g/l，摩尔转化率为 0. 55mol/mol，生产强度为0. 72g/(L.h)，而副产物较多，乳酸11. 19g/l，己酸10. 61g/l，了 二酸7. 09g/L(食品与发酵工业，2008, 34(3) : 37-39)。赵红英等也研究了初始甘油浓度对 克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇的影响，其最高耐受甘油浓度仅为102.Ig/l，且在长达 6化后仅能消耗约36.8g/L甘油，随后便不再消耗。此文中克雷伯氏杆菌W11. 7~102.Ig/ 以优选约59.Ig/L的初始甘油浓度存在，此时1，3-丙二醇浓度和转化率分别可达19.8g/L 和0.492mol/mol;在较高甘油初始浓度（72.6g/L)的情况下，经驯化培养获得的耐底物抑 制菌株，可将最终1，3-丙二醇浓度和转化率分别提高到22. 9g/L和0. 530mol/mol;采用流 加甘油发酵工艺，1，3-丙二醇浓度和转化率分别可提高到30. 2g/L和0. 625mol/mol(现代 化工，2002, 22(7) :：34-38)。
[0006] 在克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中，细胞的生长受到底物甘 油和多种产物的抑制作用。克雷伯氏肺炎杆菌在利用甘油合成1,3-丙二醇的同时还 合成2, 3- 了二醇、己偶姻（3-哲基-2- 了酬）、己醇、班巧酸、己酸和乳酸等副产物，畐U 产物的合成消耗大量的底物，降低了转化率，同时给1,3-丙二醇的分离提取带来沉重 的负担（Appliedmicrobiologyandbiotechnology, 2008, 78(6):917-926;生物技 术，2014, 24(1) :92-96)。在副产物中，有机酸使得发酵过程中发酵液的pH值不断下降，影 响菌体的生长（生物工程学报，2011，27 (3) :493-501)，其中W乳酸的产量最多，野生型克 雷伯氏菌发酵甘油产生1，3-丙二醇的过程中乳酸产量可达40g/LW上；副产物己酸对发酵 的抑制作用最强烈，6g/L的己酸即能显著抑制细菌生长与发酵，研究报道7.6g/L己酸能减 少50%细菌生长，培养基中15g/L己酸可完全抑制细菌生长。大量副产物的生成不但对细 胞生长不利，还会造成底物甘油的浪费（CN103146740A)。
[0007] 需要特别提出的是2, 3-了二醇，因其与1,3-丙二醇的结构和性质相似，沸 点比较接近，导致二者分离难度很大。化ang等通过基因工程手段敲除2, 3-了二醇 途径来增加1,3-丙二醇的转化率，但与野生菌株相比，其副产物也明显增加（Appl BiochemBiotechnol, 2012, 168:116-128)。Qii等也证明敲除 2, 3- 了二醇途径更 趋于增加乳酸的产量，而过量的乳酸会阻止细胞利用敲除2, 3-了二醇途径得到的过 量NADH，并且会抑制细胞生长，从而影响1, 3-丙二醇的产生（JournalofApplied Microbiology, 2014, 117:690-698)。Wu等通过插入甲酸脱氨酶基因使己偶姻还原酶失 活，从而使2, 3-了二醇和甲酸减少，但并没有完全阻止其产生（JournalofBiotechnolo gy,2013, 168:194-200)。
[000引综上所述，分离筛选底物耐受性好、副产物少、PDO发酵性能优、生产强度高的菌 种，采用批式或连续发酵生产PD0仍然具有重要的实用价值。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用混菌发酵甘油生产1，3-丙 二醇的方法，该方法具有良好的底物耐受性，且发酵产物中副产物较少，尤其是不含 2, 3- 了二醇，有利于主产物1，3-丙二醇的分离等特点。
[0010] 本发明所述的混菌是从大连