一种鹿茸生物反应器的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鹿茸生物反应器的构建方法，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来，由于分子生物学研宄领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃发展。目前研宄成功并能够产业化生产的生物反应器主要有细菌反应器、昆虫杆状病毒系统、真菌系统、哺乳动物细胞和活体生物反应器等。已有的生物反应器各有各的特点，如细菌反应器表达量大，成本低廉，但所表达的许多哺乳动物的基因产物都不具生物活性；哺乳动物细胞的表达系统成本极高，表达量很低，但能表达那些低等表达系统不能表达的哺乳动物的活性因子。以动物乳腺反应器为代表的活体表达系统，一经建立，不但表达量大、成本低、表达的时间长。然而乳腺反应器也并非十全十美，如乳腺反应器研制周期受到动物生长繁殖周期的限制。另外，也不是所有的生物活性因子都适合用乳腺反应器来表达。
[0003]鹿茸是鹿头部的衍生物，生长速度极快(可达2cm/d)，在60天的生长期中可生产20-30kg重的茸组织。研宄表明，鹿一生中所生长的约130kg鹿茸组织全部来源于头部生茸区骨膜。该骨膜含有大约5百万个细胞。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术的不足，本发明提供了一种鹿茸生物反应器的构建方法，采用的技术方案如下:
[0005]本发明的目的在于提供一种鹿茸生物反应器的构建方法，该方法是制备含有外源基因的慢病毒颗粒，将慢病毒颗粒结合磁性载体后感染生茸区骨膜，检测标记基因或外源基因的表达情况，获得鹿茸生物反应器。
[0006]所述方法，步骤如下:
[0007]I)构建含有外源基因的质粒，提取质粒DNA，将DNA与转染试剂混合共转染包装细胞制备慢病毒颗粒，测定慢病毒颗粒的滴度；
[0008]2)将含有磁性载体的PBS溶液与步骤I)获得的慢病毒颗粒混合，制备磁性载体偶联的慢病毒载体，作为病毒液；
[0009]3)将步骤2)所得病毒液注射到生茸区骨膜与骨质之间，磁板覆盖在注射位置，静置30min，将目标基因导入骨膜干细胞，一周后重复操作，重复操作3次；
[0010]4)当生茸区发育到5?8cm高时，麻醉鹿后取下两侧茸尖，检测标记基因或外源基因的表达情况，获得鹿茸生物反应器。
[0011]步骤I)所述包装细胞，为293t细胞。
[0012]步骤I)所述质粒，为质粒pLVTHM、质粒pCMV_dr8.91和质粒pMD2.G，质粒质量之比为 pLVTHM:pCMV-dr8.91:pMD2.G = 2:1.5:0.75。
[0013]步骤I)所述转染试剂，为Lipofectamine 2000 ;所述DNA和转染试剂，用无血清Opt1-MEM进行稀释；所述转染，是在37°C，5% CO2孵箱中进行。
[0014]步骤I)所述测定慢病毒颗粒的滴度，是利用梯度稀释法进行测定。
[0015]步骤2)所述慢病毒颗粒，滴度为I X 108TU/mL。
[0016]步骤2)所述磁性载体，为ViroMag R\L。
[0017]步骤4)所述标记基因，是位于质粒pLVTHM上的GFP基因。
[0018]所述方法具体步骤为:
[0019]I)构建含有外源基因的质粒，提取质粒pLVTHM、质粒pCMV_dr8.91和质粒pMD2.G的DNA，将经过无血清Opt1-MEM稀释的DNA和Lipofectamine 2000室温孵育5min后混合，混合液在室温孵育30min ;所述质粒质量比为pLVTHM:pCMV-dr8.91:pMD2.G = 2:1.5:
0.75 ；
[0020]2)将步骤I)所得混合液与293t细胞置于已用多聚赖氨酸包被的培养皿中，在37°C,5% CO2的孵箱中进行共转染，获得浓缩病毒液，_80°C或液氮保存；
[0021]3)将293t细胞消化并计数后稀释，加入96孔板中孵箱培养，12h后利用梯度稀释法进行测定滴度；
[0022]4)将PBS和磁性载体ViroMagR\L混合后冰上孵育，加入滴度为I X 108TU/mL的慢病毒颗粒，冰上孵育制备磁性载体偶联的慢病毒载体，作为病毒液；
[0023]5)将步骤4)所得病毒液注射到生茸区骨膜与骨质之间，磁板覆盖在注射位置，静置30min，缝合伤口后解除麻醉；一周后重复操作，共重复3次；
[0024]6)每隔两周进行观测，生茸区发育到5?8cm高时，麻醉实验鹿取下两侧茸尖，制备组织切片，检测外源基因的表达情况，获得鹿茸生物反应器。
[0025]所述的方法适用于构建鹿茸生物反应器。
[0026]所述GFP基因不仅可以作为一种外源基因，同时它也是指示病毒导入成功的标
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[0027]本发明通过构建合适的含有外源基因的病毒载体，利用显微注射的方式将磁性载体偶联的慢病毒载体，使慢病毒在生茸区骨膜组织处停留并最大限度地将目标基因导入骨膜干细胞，从而实现外源标记基因在后生鹿茸中表达，从而构建鹿茸生物反应器。本发明所述方法适用于导入所有外源基因。
[0028]本发明有益效果:
[0029]1.可以人为改造鹿茸中有益成分，如导入合适的干扰片段抑制骨化调节基因CBFAl的表达，从而提高鹿茸中软骨成分的含量，提高鹿茸蜡片产量，提高鹿茸的附加值促进农户增收。
[0030]2.本发明还可以提高鹿茸中某种有益成分的含量，如导入鹿茸中特有的刺激血管生成的多肽A44的编码核酸序列，可以提高改造鹿茸中改蛋白的含量，提取后可以应用于药物研发。
[0031]3.本发明生成的鹿茸生物反应器，可以随着鹿茸每年周期性再生，重复获取，即一次改造终身有效。
[0032]4本发明对鹿个体改造仅局限于决定鹿茸生成的骨膜组织，外源基因仅表达与后生的鹿茸组织中，更符合动物伦理要求。
【附图说明】
[0033]图1三质粒共转染24h后293t细胞生长(左)及GFP表达情况(右)。
[0034]图2慢病毒颗粒结合磁性载体感染生茸干细胞；
[0035](A，备皮后双侧生茸区；B，单侧生茸区发育高度(约1.5cm) ;C，去除皮下结缔组织后生茸区骨膜；D，含磁性载体ViroMag R/L的病毒液；E，病毒液注射到生茸区骨膜中；F，通过磁板将磁性载体绑定的病毒颗粒锁定在注射部位；G，采集前实验茸生长情况，双侧茸发育高度(约6cm))。
[0036]图3鹿茸冰冻切片荧光观测；
[0037](A，实验组荧光观测；B，实验组可见光观测；C，对照组荧光观测；D，对照组可见光观测)
[0038]图4鹿茸冰冻切片荧光观测；
[0039](A，实验组荧光观测；B，实验组可见过观测；C，对照组荧光观测；D，对照组可见光观测)。
[0040]图5LacZ在鹿茸中的表达；
[0041](A，鹿茸纵向切片观察LacZ表达；B，LacZ在鹿茸间充质组织中表达；C，LacZ在鹿茸前软骨组织中表达；D，LacZ在鹿茸软骨组织中表达；E，LacZ在鹿茸骨组织中表达)。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0043]实施例1
[0044]1.慢病毒颗粒的制备及纯化
[0045]取出一定数目的1cm细胞培养皿，每板中加入4mL 0.01 %的多聚赖氨酸，左右颠倒，使液体平铺于板底，室温下孵育1min后去除多聚赖氨酸，每皿加入13mLDMEM培养基(含10% FBS)及一定数量293t细胞，置于细胞培养箱培养(37°C，5% CO2)。对于每板细胞，使用 1.5mL无血清 Opt1-MEM稀释 24 μ g DNA(pLVTHM:pCMV-dr8.91:pMD2.G质粒质量之比为 2:1.5:0.75)，使用 1.5mL 无血清 Opt1-MEM 稀释 51 4 14专染试剂1^口(^6(^3111丨1^2000，室温下孵育5min。将稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000混合于一体，混合液在室温孵育30min。吸去1cm细胞培养皿中的培养液将复合物加入到细胞培养皿中，摇动培养板，轻轻混匀。将细胞培养皿在37°C，5% CO2，孵箱孵育5h，5h后更换DMEM完全培养基(10%FBS、1%谷氨酰胺、双抗100U/mL)。转染后24h时，观测转染情况(图1)，小心吸取1cm细胞培养皿中培养液于一干净无菌的50mL离心管中，1000rpm/min离心5min弃去细胞碎片沉淀。使用0.45 μ m滤膜过滤上清液，将