专利名称：生物反应器平台的腔室的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中等尺寸的生物反应器，包括用于生物细胞的腔室、流入流的通 道和流出流的通道、以及水不混溶性流体层作为所述腔室上的封闭物，其中所述通道分别 与液体储存器和废物容器相流体连通。本发明还涉及改变所述腔室中内容物与周围环境的 相互作用的方法，和培养生物细胞的方法。所述中等尺寸生物反应器适用于培养生物细胞； 尤其适用于培养哺乳动物细胞，例如胚胎或干细胞。该中等尺寸生物反应器更特别适用于 体外受精操作。
背景技术：
目前在用于胚胎培养的体外受精(IVF)中所用的方法依赖静态条件下胚胎在培 养皿中的培养。这样的方法是劳动密集的，因为更换生长培养基需要大量的人工操作。人 工操作总会有引入污染的风险，而且静态条件与体内条件的相似性不高，其难以满足胚胎 不断改变的需求。与当前体外静止条件相比，体内胚胎处于不断改变的环境，而且一个发育 阶段中胚胎的需求可能与另一个发育阶段中胚胎的需求有很大不同。一个发育阶段的体内 条件甚至可能对后面发育阶段的胚胎有害。基于培养皿的系统的静态条件可以使用开放的生长腔室，其可以用移液管等直接 进入。对于IVF过程，开放的系统是方便的，因为这样的系统既可以替换缓冲液，而且重要 的是，容易在培养之后移出胚胎。为了最小化污染的风险和防止从生长腔室的挥发，一般腔 室中的水性培养基上有水不混溶液体的顶层，例如石蜡油，作为“盖子”或“封闭物”。基于静止的培养皿培养系统的一些缺点可以通过下述而避免在能够向胚胎灌注 适合其发育阶段的生长培养基的培养系统中培养胚胎。这种系统应该有与胚胎尺寸相匹配 的适当尺寸并且更近似于体内条件。此外，以小规模进行运作是重要的，以最小化此类哺乳 动物细胞通常所需的昂贵的生长培养基的消耗。现在许多所谓的微流体装置已经被描述用于进行各种类型的分析或用于培养细 胞。这些装置常常用各种原理制造，这些原理通常受到二十世纪七十年代基于硅的微电子 学技术的发展的启发。微流体应用的实例为DNA分析，涉及的原理如用于例如检测单核苷 酸多态性的聚合酶链反应或使用例如毛细管电泳法的蛋白质分析。然而，‘真正的’微流体装置(例如具有约100 μ m或更小级别直径的流体通道)确 实具有许多缺点，其中一些缺点对于为灌注型操作设计的细胞培养装置特别明显。正如从 Hagen-Poiseuille (哈根-泊肃叶)方程(见下文)可见，在有液流的例如100 μ m通道中 压力降变得很大，对于意在此规模运行的泵提出了高要求，因为这样的泵必须能对抗相当 大的反压精确地泵出很小的体积。由于这个原因，在此规模经常使用所谓的电渗流产生液 流，其在盐水溶液中通过暴露于巨大的电位下生成液流。但是这样的电渗流不适于涉及活 (哺乳动物)细胞的系统。微流体中遇到的另一个问题是关于“与外界的联接”的问题。生物学实验室中所 用的大部分设备，如泵和分析设备，比微流体设备大得多以至于两个级别的集成变得问题重重。如250 μ m直径(容易得到的)这样小的管与芯片的联接点对于实验室工作人员而 言难以操作，而且可能迅速引入几倍于微流体系统体积大小的死体积。这个问题对于灌注 型细胞培养装置尤其重要，其中操作复杂性和流体在联接至微流体系统的管中的长滞留时 间增加了逆流污染的风险。在培养哺乳动物胚胎的情况下，培养时间可能达五天或更长。对于以小规模工作的生物反应器系统，当然能够根据预设的事件序列在不同的生 长培养基和条件之间切换。但是，为了更充分地优化生物反应器中细胞的生长条件，生物反 应器可装备适当的可与电脑通信或类似的能够发送命令到生物反应器的执行元件的传感 器。这样可生成反馈系统以对环境的变化做出反应，例如用于维持恒定的环境条件。在文献中已经记载了许多生化或生物微流体设备。总的来说，这样的设备目的是 利用小规模存在的快速扩散速率从样品得到数据，以便从即使是非常小的样本体积来快 速得到数据。诸如DNA或RNA等核酸的分析是特别有利的，因为核酸的稳定性质使含有 核苷酸的液体可以用电渗流操作。但是，也已经记载了微量发酵罐，当暴露于多种实验条 件时，其中可生长并观察或者分析到微生物细胞，例如细菌。参见例如W02005/123258或 W02007/044699。这样的系统所提供的一个典型优点是仅仅需要非常小体积的样品液体，可 能是包含昂贵的测试化合物的样品液体，来诱导和研究对细胞的影响。但是迄今为止记载的大部分微流体设备是分析设备，其目的在于提供关于设备中 样品液体的细胞或生物学化合物的抽象数据。相反地，体外受精操作的目标是培养过程中 得到的胚胎。因此，为灌注细胞如未受精或受精的卵母细胞设计的设备，应该使得易于进 入培养腔室以能够在该腔室中放置细胞，而且尤其在培养期后也能轻柔地移动细胞。这种 特征在仅设计用于数据采集的流体设备中是非必需的，其中适当的传感器可以集成至设备 中，使数据从系统中导出而无需物理移动细胞。如下面所讨论，为解决上述问题已采取了一些手段。W007/047826描述了微流体细胞培养设备，其使用油覆盖层以阻止液体从微流体 室中蒸发并使得可以进入该设备中的生长室。W007/047826的设备可以含有光学传感器、电 传感器或机电传感器以测定微流体设备元件的状态或液流特性。所述设备包含漏斗形的生 长腔室和经第一微通道联接的储存器，第一微通道在包含该腔室的PDMS基底的底部中。该 储存器和生长腔室进一步通过位于第一微通道之上的微通道连接。在由弹性材料制成的膜 和所谓的销式(Pin)传动设备的帮助下，在腔室间产生液体的蠕动是可能的。因此，当液体 从储存器通过底部通道蠕动到生长腔室时，生长腔室中水性液体上的油层会通过上层通道 推动到储存器中，从而保持两个腔室间的质量平衡。该蠕动可用于产生“往复型流体供应， 其中孔中的流体水平周期性地增加和减少”。但是，也可用外部液体供应向W02007/047826 的设备的生长室供应液体。考虑该双通道设计的“质量平衡缓冲”效果，不清楚如何修改该 设计以使用这样的外部液体供应，而且该设备似乎不适于传导长期灌注型生长实验，因为 需要利用外部流体供应。因此，这样的系统主要用在仅仅两个腔室包括在流体系统中时。特 别地，在所有的腔室不连续连接的设计中，当两个或更多个储存器腔室供应同样的培养腔 室时，该设计很少适用。W02006/089354记载了用于培养细胞的设备，特别是用于IVF的设备。该设备包括 至少一个向上开口的培养腔室和流体储存器，其中该培养腔室与该流体储存器流体连通。 细胞培养腔室的培养基可以用细胞培养油覆盖，例如石蜡类油，以使蒸发最小化。该细胞培养腔室进一步具有锥形的侧壁。该流体储存器通过该培养腔室的缝隙与该培养腔室连接。 该缝隙小于要培养的细胞直径，由此该细胞保持在细胞培养腔室中。细胞培养介质被注入到该流体储存器中。细胞培养介质从流体储存器优选通过 毛细管流或通过流体通路施加压力差流向细胞培养腔室的该缝隙，随后填满该细胞培养腔 室。细胞培养腔室的流体水平通常直接取决于注入的流体体积。流体水平可以通过例如重 力平衡。所以，例如当一定体积的液体注入到该储存器中时，该液体流入培养腔室中，直至 两个腔室的液体水平相同。W02006/089354的流体储存器可用于培养腔室的流体流入和流出。在操作中，培养 介质可直接加入到W02006/089354的培养腔室中，多余的液体可通过从储存器中吸出液体 从培养腔室去除。因此，看来W02006/089354中记载的系统不适于灌注操作，特别是长期的 灌注操作。W02006/089354的培养腔室缺乏专用的流体入口和专用的流体出口。这种专用 功能的缺失使其难以预测和控制培养腔室当前的条件，而且培养腔室流出的流体的分析也 有问题，因为W02006/089354的设备的流出液将不可避免地与新鲜的培养基混合。当流体 流可以通过W02006/089354的腔室传导时，培养腔室不会同时具有入口和出口通道。所以， 该系统看来不适用于灌注该培养腔室，特别是不能达到腔室中液体水平的稳定状态。不管以上讨论的成果怎样，仍需要解决设计简单的流体设备问题的系统，所述流 体设备用于在适合哺乳动物细胞，例如胚胎的规模和时间上进行灌注型操作，在操作中可 容易地进入该生长腔室。本发明的目的是提供向上开口的腔室，其在操作中可物理地达到， 而且保持该腔室中的液体与周围环境的分离；这种分离用于防止该腔室中溶剂的挥发，并 同时防止腔室中的液体被颗粒污染，特别是微生物病菌或病原体。向上开口的腔室可进一 步允许气体，例如O2或CO2扩散到腔室中的液体中，提供附加的装置来控制腔室中的条件， 例如PH。将在胚胎发育期间对生长条件的不同需求以及这样的培养所需的时间考虑在内， 并进一步考虑到应可以在腔室的灌注期间进入腔室来放置细胞或从腔室移出细胞，这样的 腔室适用于培养哺乳动物卵母细胞和胚胎。
发明内容
本发明涉及一种中等尺寸的生物反应器平台，包括用于生物细胞的向上开口的腔 室，所述腔室通过第一端口与传导进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，并通过 第二端口与传导从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通，所述腔室具有包含水不 混溶性液体的封闭物，其中所述第一通道与液体储存器流体连通，所述第二通道与废物容 器流体连通。因此，本发明描述了具有用于生物细胞的腔室的生物反应器平台。通常生物反 应器平台应包括多个腔室用作培养生物细胞的腔室，或者进行生物学或生化反应的腔室， 例如培养细胞、杂交核酸或进行酶反应；参与这样的反应的生物学或生化实体可固定到该 腔室的表面上，或可游离悬浮在该腔室中的液体中。生物反应器平台中的腔室还可作为液 体储存器，例如缓冲液或培养基容器，生物反应器平台通常可包括在所述腔室之间传导液 体的通道。类似的生物反应器平台通常包括废物容器。根据本发明，任何这些腔室，即用于 生物细胞的腔室、液体储存器和废物容器，可以是向上开口的，而且它们可具有包含水不混 溶性液体的封闭物。当其目的是能够以便利的方式物理达到所述腔室时，包含在本发明的中等尺寸生物反应器平台中的腔室特别适用。向上开口的腔室在该腔室中的水性液体顶上具有水不混 溶性液体层的封闭物。水不混溶性液体将形成大体均质的相，与限定所述腔室开口表面的 周边的腔室侧壁接触，从而基本上防止了液体从腔室的挥发，并预防了该水性液体被来自 所述生物反应器平台的外部环境的颗粒的污染，例如微生物病菌或病原体。该封闭物也可 控制溶剂和其他挥发性化合物例如CO2和O2的挥发。这将有效阻碍所述水性液体或培养基 中的一些成分逸出所述腔室，例如水蒸气，而其他成分则可通过该封闭物交换，例如CO2和 02。通过控制0)2跨过水不混溶性液体封闭物的传输，pH可保持在相关水平。因此，可以说 该水不混溶性液体为所述腔室提供了半透性的封闭物。适宜的水不混溶性液体通常对于可见光是透明的，这进一步使所述腔室中的细胞 可以可视观察，例如通过显微镜。作为流体，该水不混溶性相易于用例如移液器等穿过，从 而允许达到所述腔室及其内容物，因此例如受精的卵母细胞可放置到所述腔室中用来培养 和在培养之后轻柔地移出。本发明的中等尺寸生物反应器平台中包含的腔室与通道通过端口连通。通过向水 不混溶性相上表面施加正向相对压力，可将腔室中的液体从该腔室推出，从而形成流出的 流。相似地，通过对所述通道施加负向相对压力创建流，使得腔室中的液体被吸出该腔室。 因此，可以说该水不混溶性相构成了腔室的可变形的盖子。本发明的中等尺寸生物反应器 平台包括腔室，所述腔室具有第一端口和第二端口，第一端口与用于进入所述腔室的液体 的流入流的第一通道连通，第二端口与用于从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连 通。第一和第二通道使得液体可施加到腔室中和从腔室除去液体，从而可保持相对于例如 腔室底部的液体水平的稳定状态。第一通道与另一个腔室或包含液体的储存器流体连通， 这种液体可从该储存器吸出或驱散到该腔室中。可使用这种操作填满该腔室或保持稳定状 态。当该腔室还与用于流出流的第二通道和用于流入流的第一通道适配时，它可用于灌注 操作，例如IVF过程。该腔室可在底表面包括用来保持生物细胞的凹陷，例如用于IVF和其 他过程，例如培养其他生物细胞。在一些实施方式中，单个腔室包括多个这样的凹陷。当在 单个的腔室中存在多个凹陷时，这些凹陷可以串联连接、并联连接或以串联和并联的组合 连接，在这些凹陷之间存在一个或多个用来传导液体的通道。本发明的中等尺寸生物反应器平台中包含的腔室通常形成在基底中，该基底可以 用任何适宜的材料制备，例如聚合物、玻璃、金属、陶瓷材料或这些材料的组合。这种基底可 限定腔室的底表面和侧壁；当从上方看时侧壁可形成腔室的周边，该周边为圆形、方形、多 角形或矩形等；优选该周边为圆形。该基底可具有上表面，围绕腔室周边的上表面可以是疏 油的或超疏油的，以防止水不混溶性液体铺展到基底的上表面上。疏油或超疏油表面将为 水不混溶性液体和基底表面上的周围空气之间的界面提供大接触角，例如大于90°。大接 触角表示其对于该水不混溶性液体在基底表面上的铺展在能量方面是不利的，而且该水不 混溶性液体反而会在腔室中水性液体之上形成凸出的弯月面。通常在水性环境中发生生物或生化反应，所以，在一个实施方式中，用于生物细胞 的该腔室包括在该腔室中形成下层相的水性液体，从而该水不混溶性液体形成上层相。水 不混溶性相充当腔室的封闭物，以防止上述水性液体的挥发和污染。为了分别供应给所述 腔室水性液体和从该腔室去除水性液体，优选下层水性相覆盖腔室的第一端口和第二端 口。端口和水性液体的相对定位将保证该水不混溶性相能够作为封闭物保持在水性液体上。优选该生物反应器平台是中等尺寸的，这意味着生物反应器平台的腔室和通道的 大小设定成适于中等数量的生物细胞，例如用于体外受精(IVF)过程，本发明的生物反应 器平台特别适用于体外受精过程。本发明的生物反应器平台可包括两个或更多个用于生物 细胞的腔室，例如，第一腔室与第二腔室通过通道流体连通，该通道用于传导从第一腔室流 出的液体的流出流。形成用于例如培养基、缓冲液等液体的储存器的腔室可包括水不混溶 性液体的封闭物和指向也提供有这样的封闭物的培养腔室的通道。这些腔室中的一个或多 个，优选培养腔室，可以与该生物反应器平台中还包括的废物容器流体连通。虽然在某些实 施方式中，废物容器不包括水不混溶性液体层，但是优选该废物容器还包括水不混溶性液 体层。在一个实施方式中，生物反应器平台还包括一种提供液体驱动力的装置，以通过 第一通道将液体移动入用于生物细胞的腔室中和/或通过第二通道将液体从用于生物细 胞的腔室中移出，例如，通过一个或多个通道从储存器到用于生物细胞的腔室和到废物容 器。所以，可以将液体从作为储存器的腔室驱动到作为培养腔室的腔室。因为生物反应器平 台还包括废物容器，液体还可以从培养腔室进一步被驱动到废物容器。液体驱动力可以通 过向储存器施加正向相对压力来提供，以将液体驱散到培养腔室中，和可选地进一步到废 物容器中。或者，对用于从培养腔室流出的流出流的通道施加负向的相对压力，也可以产生 相同的效果从储存器移动液体到培养腔室中。负向相对压力也可施加到废物容器中。提 供液体驱动力的装置也可集成到生物反应器平台中，例如以蠕动功能的形式作用于通道。 一般来讲，提供液体驱动力的所述装置选自用集成的或外部的泵将液体扩散至腔室中或 从腔室吸出；对腔室中的液体的上表面施加正向相对压力；对腔室中的液体的上表面施加 负向相对压力；相对于水平面，调节第一腔室中的液体的上表面的水平至比第二腔室中液 体的上表面水平更高的水平；或这些的组合。当生物反应器平台的腔室是向上开口时，液体驱动力也可由腔室的液体表面之间 互相的水平位置差来提供。在一个其中腔室包括水性液体的实施方式中，第一腔室如储存 器中水性液体的上表面相对于水平面的水平要高于第二腔室如用于生物细胞的腔室中水 性溶液的上表面相对于水平面的水平。这提供了形成虹吸作用的可能性，以通过用于第一 腔室的流出流的通道从第一腔室将液体移动入第二腔室。从一个腔室到下一个的流速由液 体上表面的高度差所支配，还由由于通道的尺寸和材料造成的任何阻力来支配。也可以组 合提供液体驱动力的不同原理。所以，虹吸作用可以与集成的泵组合，或者可以如上所述使 用正向或负向相对压力，来增加或降低虹吸作用。当生物反应器平台包括至少三个腔室时， 虹吸作用特别适用，例如，一个或两个本发明的腔室分别作为液体储存器和培养腔室，和可 以提供也可以不提供上层水不混溶性相的废物容器。在该实施方式中，储存器的液体上表 面高于培养腔室的液体上表面，培养腔室的液体上表面又高于废物容器的液体上表面。这 可以保证在生物反应器平台操作过程中保持培养腔室中水性液体水平的稳定状态。腔室的 底部也可遵循相同的模式，即，储存器的底部在培养腔室的底部上方，培养腔室的底部又在 废物容器的底部上方。可影响操作的腔室中液体水平之外的其他参数有通道的流动阻力， 其由通道的尺寸限定；以及表面积的大小。生物反应器平台还可包括多个具有储存器功能的腔室和/或用于培养生物细胞的多个腔室。当存在多个这样的培养腔室时，这些培养腔室可以以一个或多个组排列。一 个组中的腔室可以通过用于液流的通道串联连接，各个组可以通过用于液流的通道并联连 接。当生物反应器平台设计为利用如上所述的虹吸作用时，生物反应器平台也可以包括多 个培养腔室。另一方面，本发明涉及一种改变腔室中内容物与环境的相互作用的方法，包括步 骤提供如本发明的中等尺寸生物反应器平台；对所述中等尺寸生物反应器平台的所述腔室施加水性液体，以使得所述水性液体 覆盖所述第一端口和所述第二端口；施加密度小于所述腔室的水性液体密度的水不混溶性液体，以形成下层的水相和 包含所述水不混溶性液体的上层相；诱导水性液体流通过所述第一通道流入所述腔室中，和诱导水性液体流通过所述 第二通道从所述腔室流出。腔室的内容物(例如细胞、缓冲液或培养基成分、液体等)与周围环境之间的任 何相互作用都适用于用本发明的方法改变。一方面，水不混溶性层提供了对不希望的成分 (例如病原菌、颗粒污染物等)进入腔室的障碍，所以，通过将腔室的内容物与周围环境的 污染物分离开来而改变了上述相互作用。这种相互作用还可以通过改变或调节腔室中存在 的其他条件、和利用上述水不混溶性层形成对液体蒸发或热扩散的障碍来改变。所以，当腔 室的温度升高或降低时，水不混溶性层会为腔室中的液体提供绝缘层，从而能够控制温度。 同样，该水不混溶性层可以防止液体从腔室的蒸发。对于一些生物操作，例如IVF过程，对 含细胞的生长或培养腔室必需具有物理进入。在这种情况下，从受精的卵母细胞形成的胚 胎是该过程的目的产物。所以，必需有可能从该培养腔室移出胚胎。并且，要培养的受精卵 母细胞的确切鉴定是重要的，所以在培养腔室中放置受精的卵母细胞的便利方法同样也是 目的所在。对于要在灌注条件(即具有穿过培养腔室的液流)下操作的生物反应器平台，已 经建议使用可关闭的部件，例如盖子，来提供对腔室的进入。但是，使用盖子时必需切断液 流来进入腔室，并且，当打开盖子时，腔室中的内容物有被潜在的病原实体污染的风险。盖 子还增加了设计的复杂性，使得该生物反应器平台更加昂贵。发明人意外发现了水不混溶性液体层放到生物反应器平台的腔室中水性液体顶 上可用来代替盖子提供对腔室的封闭，即使在液流正在通过腔室灌注时也可以使用。所以， 本发明进一步涉及一种方法，包括步骤提供如本发明的中等尺寸生物反应器平台；对所述中等尺寸生物反应器平台的所述腔室施加水性液体，以使得所述水性液体 覆盖所述第一端口和所述第二端口；在所述腔室的所述水性液体上施加密度小于水密度的水不混溶性液体，以形成下 层的水相和包含所述水不混溶性液体的上层相；诱导水性液体流通过所述第一通道流入所述腔室中，和诱导水性液体流通过所述 第二通道从所述腔室流出，其中腔室中水性液体的水平保持在稳定状态。在又一个实施方式中，本发明的方法进一步包括相对于来源于所述腔室中所述水 性液体的气体压力，控制所述腔室上方的气体压力的步骤，以控制所述气体向所述水性液体的扩散进入或从所述水性液体的向外扩散。该气体优选为CO2或02。水不混溶性液体也可以在施加水性液体之前，施加到或者包括流出流通道或者既 包括流出流通道又包括流入流通道的腔室。这不会损害该与水不混溶液体的封闭物功能， 因为水性液体的更高密度会保证这些液体以所需的形式分层。在另一方面，本发明涉及使用水不混溶性液体作为用于中等尺寸生物反应器平台 中腔室的封闭物。此处，在向中等尺寸生物反应器平台的腔室施加水性液体之前，提供包括 向上开口的液体腔室和通过第一端口与该腔室连通的第一通道的中等尺寸生物反应器平 台，以使得该水性液体覆盖第一端口，在该腔室中的水性液体上施加密度小于水密度的水 不混溶性液体，以形成下层水相和包括该水不混溶性液体的上层相，诱导所述水性液体流 从腔室进入所述第一通道，形成流出流，相对于源于腔室中所述水性液体的气体的压力，控 制腔室上方的气体压力，以控制气体向所述水性液体内的扩散和从所述水性液体向外的扩 散。该水不混溶性液体形成的封闭物允许气体穿过它扩散。但是，该水不混溶性液体 不表示对这种扩散和对溶剂穿过该层的蒸发的阻碍。所以，当腔室上方的气体压力相对于 源于该水性液体的气体压力存在梯度时，气体会依据该梯度扩散。但是同时该水不混溶性 液体层防止了溶剂从腔室的蒸发，从而能够保持其渗透性。在本发明中，优选控制所述腔室上方的CO2压力。高CO2相对压力会把CO2驱动到 该水性液体内，然后会导致该液体中PH的降低。相反，CO2低压会允许CO2从液体中扩散出 来，从而升高其PH。因此，通过控制腔室上方的CO2压力，有可能调节腔室中该水性液体的 pH。腔室上方气体的浓度优选为预混合了例如2-10% CO2的空气，优选5% C02。还可以是 含有2-20% O2的三种成分的气体(trigas)。腔室上方的总压力可比正常的大气压稍微升 高，CO2的压力可以从其浓度和该总压力计算出。在又一方面，本发明涉及一种培养生物细胞的方法，包括步骤提供如本发明所述 的中等尺寸生物反应器平台；将所述生物细胞放到用于生物细胞的所述腔室中；和用水性 液体灌注所述细胞。该生物细胞可以是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母菌细胞、真菌细胞、植 物细胞或昆虫细胞。当该细胞是哺乳动物细胞时，该细胞可以是例如精子、卵母细胞、胚胎、 干细胞、单核细胞、树突细胞或T细胞，不过本方法并不限于这些细胞。在某一个实施方式 中，培养该细胞三天或更长时间。
下文中，将借助实施方式的实例并参考示意性附图来更加详细地解释本发明，其 中图1是向上开口的腔室的侧视图。图2a是本发明的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室的侧视图，其中所 述腔室的侧壁是亲脂的。图2b是本发明的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室的侧视图，其中所 述腔室的侧壁是疏脂的。图3是本发明的中等尺寸生物反应器平台的侧视图。图4是本发明另一个实施方式的中等尺寸生物反应器平台的侧视图。
图5a是本发明的中等尺寸生物反应器平台的透视图。图5b是本发明的中等尺寸生物反应器平台的透视线框图。图6示出了在本发明的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室中所述水性 液体的PH的曲线。
具体实施例方式本发明涉及中等尺寸生物反应器平台，其包括用于生物细胞的向上开口的腔室， 所述平台包括流入液流的通道、流出液流的通道和作为所述腔室的封闭物的水不混溶性流 体层，以及液体储存器和废物容器。本发明进一步涉及用水不混溶性流体层作为中等尺寸 生物反应器中腔室的封闭物，来改变腔室的内容物与周围环境的相互作用的方法。本发明 还包括培养生物细胞的方法。本发明的术语“生物反应器平台”或“生物反应器”涵盖适于培养生物细胞的系统 和设备。公开的腔室和生物反应器尤其适于哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物 细胞为与体外受精(IVF)相关的细胞，所述细胞将包括精子、卵母细胞和/或胚胎。但是， 对本领域技术人员而言显而易见的是，所述生物反应器平台还可以用于其它哺乳动物细胞 类型，如干细胞或免疫系统细胞如单核细胞、树突细胞、T细胞等等。在优选的实施方案中， 哺乳动物细胞为人细胞。此外，本发明中公开的向上开口的腔室或中等尺寸生物反应器平 台还可用于培养哺乳动物细胞以外的细胞类型。例如，在本文公开的生物反应器平台中还 可培养细菌、酵母、真菌、植物或昆虫细胞。生物反应器可包括多种类型的腔室，例如液体(例如缓冲液或培养基)储存器，培 养腔室(即用于生物细胞的腔室)和/或废物容器。在本发明的上下文中，“腔室”一般是 向上开口的。这意味着，该腔室由底表面和侧壁限定；所述侧壁可基本垂直，或所述腔室可 向下逐渐变细。该腔室还可包括在底部上方垂直放置的“天花板”，虽然这样的天花板不能 完全覆盖所述腔室中液体的表面。废物容器是不含用于流出液流的通道的腔室，从而通过 生物反应器平台中腔室灌注的液体最终会收集在该废物容器中。因此，废物容器从培养腔 室收集了用过的培养基。然而，液体也可以从废物容器移除，例如用来分析该液体，或调节 废物容器中的液体体积。通过向上开口，所述培养腔室提供了向该腔室的方便的物理进入。在该上下文中 术语“物理进入”是指可以将工具插入到培养腔室的液体中，以操作培养腔室的内容物。这 种操作可以是插入或从培养腔室移出一种或多种细胞，或者还可包括对已经存在于培养腔 室中的细胞的操作。这样的操作易于利用工具得到，例如一次性使用的吸管。在水性溶液中最经常发生生物和生化反应。在本发明的上下文中，“水性液体”是 包含溶剂的液体，其可以与水混合。最常用的水性液体仅仅包括水作为溶剂，但是也可存在 某些操作溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、DMS0、甘油等。通常该水性液体还可含有盐和缓冲成 分，例如，NaCl、磷酸盐，以及营养物质或其他成分，例如溶解的氧气(O2)、二氧化碳(CO2)、 葡萄糖、维生素、代谢产物、特殊的蛋白质或酶等。用于IVF过程中的适当介质为本领域所 公知，如可从MediCult A/S (于厄灵，丹麦)得到的所示。与水性液体相反，“水不混溶性液体”包含不能与水混合或溶于水的成分。这些成 分可以是生物来源的油或脂肪，例如植物油等，或矿物油或合成的油，例如石蜡油。水不混溶性液体优选包括石蜡油。水不混溶性液体通常具有比水低的密度，从而当该液体放到水 性液体之上时，会形成两相的系统，其中该水不混溶性液体层在水性液体的顶上。水不混溶 性液体的用量应足以完全覆盖所述水性液体与周围环境空气交界的表面。当完全覆盖水性 液体的表面时，水不混溶性液体与生物反应器平台的基底限定的腔室的外周接触。在此情 况下，可以说该水不混溶性液体为所述腔室提供了封闭物。水不混溶性液体层的适宜厚度 介于0. 5至3mm之间，例如Imm和2mm之间，例如约Imm或约2mm。“封闭物”是指水不混溶性液体将防止水性液体或其中其他成分从所述腔室的挥 发，例如CO2，并进一步防止颗粒进入该水性液体，例如微生物病菌或病原体。在腔室中的水 性液体上形成的水不混溶性液体形成的封闭物的一个重要特征是气体可通过该水不混溶 性液体扩散。因此，例如，气体(例如CO2)的扩散方向将取决于腔室之上的空气中所述气体 的压力和所述水性液体中该气体的浓度。所以，水性液体的PH可通过调节该腔室之上CO2 的压力来控制。例如，通过提高CO2压力，CO2将被压入水性液体中并降低PH ；同样，CO2低 压力将导致CO2的蒸发，从而升高pH。另外，该封闭物可作为热绝缘层，其可促进该腔室中 水性液体的恒定温度的保持，例如37°C。但是，水不混溶性液体提供的封闭物不会阻碍操作 员对所述腔室内容物的物理进入。所以，操作员可用如移液器穿透水不混溶性液体并达到 对该腔室的进入。在去除移液器之后，该水不混溶性液体将再次形成封闭物。在本发明的上下文中，术语“中等尺寸”意在涵盖一定范围的大小，其中最小的通 道尺寸在约100 μ m至约3mm范围内，虽然这些通道也可包含颈缩。相似地，所述培养腔室 可以具有约500 μ m至约5mm或更大的深度，最大的水平尺寸可以为从约Imm至约50mm。在 一个实施方式中，与水平面相对的腔室中水性液体的上表面在不同水平处。这会反映到相 对于包含这些腔室的基底的上表面的这些腔室的深度上。储存器的大小必须足以在整个培 养过程中给培养在灌注条件下的细胞供应适当的培养基。当目的是能够在培养腔室中物理 操作细胞时，以及目的是能够基于细胞的来源快速地定位包含细胞如胚胎的单个位置时， 中等尺寸范围的生物反应器系统使用起来特别方便。此外，一般可以说，中等尺寸流体系统 中的流体会在层式条件下流动，只要系统中包含的流体在层式条件下流动，不同于上述的 具有通道或腔室的流体系统也可被称为“中等尺寸”。在中等尺寸和更小尺寸，由于流体穿过通道移动产生的压差可变得非常显著，对 于牛顿流体，这种压差可以从Hagen-Poiseuille (哈根-泊肃叶)方程式来估算
权利要求
1.一种中等尺寸的生物反应器平台，包括用于生物细胞的向上开口的腔室，所述腔室 通过第一端口与传导进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，并通过第二端口与传 导从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通，所述腔室具有包含水不混溶性液体的 封闭物，并且其中所述第一通道与液体储存器流体连通，所述第二通道与废物容器流体连 通。
2.根据权利要求1所述的中等尺寸生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室进 一步包括形成下层相的水性液体，其中所述水不混溶性液体形成上层相，并且其中下层的 水相覆盖所述第一端口和所述第二端口。
3.根据权利要求2所述的中等尺寸生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室用 所述水性液体灌注。
4.根据权利要求3所述的中等尺寸生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室中 的所述水性液体的水平处于稳定状态。
5.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述腔室在基底中 形成，所述基底限定所述腔室的底表面和侧壁，所述基底具有上表面，其中围绕所述腔室的 周边的所述上表面是疏油的或超疏油的，以防止所述水不混溶性液体铺展到所述基底的所 述上表面上。
6.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述液体储存器和 /或所述废物容器是向上开口的腔室。
7.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，其中用于生物细胞的 所述腔室在所述底表面包括凹陷以保持所述生物细胞。
8.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，包括两个或更多个用 于生物细胞的腔室。
9.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，包括两个或更多个储 存器，其中每个储存器通过通道与用于生物细胞的所述腔室流体连通。
10.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，进一步包括提供液 体驱动力的装置，以将液体通过所述第一通道移动入用于生物细胞的所述腔室中，和/或 通过所述第二通道将液体从用于生物细胞的所述腔室移出。
11.根据权利要求10所述的中等尺寸的生物反应器平台，其中提供液体驱动力的所述 装置选自用集成的或外部的泵将液体扩散至腔室中或从腔室吸出；对腔室中的液体的上 表面施加正向相对压力；对腔室中的液体的上表面施加负向相对压力；相对于水平面，调 节第一腔室中的液体的上表面的水平至比第二腔室中液体的上表面水平更高的水平；或这 些的组合。
12.根据权利要求10或11所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述腔室包含水性液 体，并且其中第一腔室中所述水性液体的上表面相对于水平面的水平高于第二腔室中所述 水性液体的上表面相对于水平面的水平。
13.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述储存器的体 积是用于生物细胞的所述腔室体积的至少10倍大。
14.一种改变腔室中内容物与环境的相互作用的方法，包括步骤提供根据权利要求1-13中任一项所述的中等尺寸生物反应器平台；对所述中等尺寸生物反应器平台的所述腔室施加水性液体，以使得所述水性液体覆盖 所述第一端口和所述第二端口 ；在所述腔室的所述水性液体上施加密度小于水密度的水不混溶性液体，以形成下层的 水相和包含所述水不混溶性液体的上层相；诱导水性液体流通过所述第一通道流入所述腔室中，和诱导水性液体流通过所述第二 通道从所述腔室流出。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述腔室中的所述水性液体的水平保持在稳定 状态。
16.根据权利要求14或15所述的方法，进一步包括步骤相对于所述腔室中源于所述水性液体的气体的压力，控制所述腔室上的气体压力，以 控制所述气体向所述水性液体的扩散进入或从所述水性液体的向外扩散。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述气体为CO2或02。
18.一种培养生物细胞的方法，包括步骤提供根据权利要求1-13中任一项所述的中等尺寸生物反应器平台；将所述生物细胞放置在用于生物细胞的所述腔室中；以及用水性液体灌注所述细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物细胞为哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母 细胞、真菌细胞、植物细胞或昆虫细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为精子、卵母细胞、胚胎、干 细胞、单核细胞、树突细胞或T细胞。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中培养所述细胞三天或更长时间。
全文摘要
本发明公开了一种中等尺寸的生物反应器平台，包括用于生物细胞的向上开口的腔室，所述腔室通过第一端口与传导进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，并通过第二端口与传导从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通，所述腔室具有包含水不混溶性液体的封闭物，其中所述第一通道与液体储存器流体连通，所述第二通道与废物容器流体连通。另外，本发明还公开了改变腔室内容物与环境相互作用的方法和培养生物细胞的方法。
文档编号C12M1/22GK102112593SQ200980130816
公开日2011年6月29日 申请日期2009年6月18日 优先权日2008年8月1日
发明者乌尔里奇·克鲁内, 雅各布·莫伦巴赫·拉森 申请人:智能生物系统公司