专利名称：生物反应器的制作方法
生物反应器相关申请的交叉参考本项申请是得益于美国临时申请号码61/183，387(2009年6月2日立案的题为新型生物反应器)，美国临时申请号码61/216，193(2009年5月14日立案的题为血液培养生 物反应器)，美国临时申请号码61/192,515(2008年9月19日立案，题为新型生物反应器)， 和美国临时申请号码61/132，190(2008年6月16日立案，题为新型反应器)等。每一个申 请均以参考文献的形式出现在整个文章中。
背景技术：
氧气对生物有机体来说是十分重要的营养物质。对于细胞来说，许多种类的细胞 生存都依赖其生存环境持续不断地提供氧气。对于动物组织器官来看，血液中缺乏氧气，甚 至短期的缺氧，都可能导致非常灾难性的后果，例如大脑损伤，肺衰竭甚至是死亡。因此，对 动物细胞培养来说，非常必要创造一个富氧的环境；并且对于治疗相关疾病来说，提供一个 富氧的血液也是十分必要的。发明概述本申请涉及到细胞培养和血液溶氧的方法和系统。本发明总体上是发明了一种细胞培养器，包括拥有特殊内壁的能够旋转的容器， 该容器定义为培养室，培养室壁上有进液口能够使细胞培养室和外部液体交换。在某些情 况下，细胞培养室壁表面有一个进口能促进容器气体接触。连接到培养室的制动器可以使 容器围绕中心轴转动，以提高培养室中液体的溶解氧。为了具体化这一方面，还包括下面一个或多个特征。这个容器还有个出液口，能使液体在培养室和传感器之间传递信息。这个传感器 是用来测量培养室中液体的环境，比如，可以测定培养室中液体的溶氧和PH水平。该仪器使用了一个控制系统，它可以接收来自传感器的信号，根据此信号来决定 转动的速度。外部流动来源包括液体来源和气体来源。在系统中提供了一个阀门，可以选择性 地将液体源和气体源和转动的容器进口连接。液体源包括培养液，气体包括一种或几种气 体空气、氧气、二氧化碳、及氮气。该仪器使用了 一个罐体来连接容器和驱动器。一个可以移动的平台连接罐体来使 容器沿第二个轴转动。容器内壁的表面是经过显微结构或纳米结构鉴定过的。在至少部分封闭的环境中，如孵育器，可以控制温度或控制气体组成的环境中，容 器能够处于健康的状态。本发明另一个方面的特点在于其使培养液充氧的方法，如使用上面所介绍的细胞 培养设备来实现。该方法包括把培养液引入至少部分含有气体的培养室，在其中培养室被 定义为一个有壁的容器，并且内壁表面可以促使气体与内壁更多的接触。这种方法也包括 容器的转动来产生一个培养液与容器内壁相对的运动，而提高培养液中的溶氧水平。
这个方法的具体表现包括以下一个或多个特征。在转动的容器中，能够产生出微小的含有氧气分子的气泡。这个方法同时也包括检测培养液的流动情况，根据检测的流动情况控制转速。流体的情况包括以下一个或多个pH水平、溶氧水平、二氧化碳水平和温度。该发明的第三个特征是培养系统，它拥有一个可以使培养液增加更多溶氧的传氧设备。传氧设备包括一个容器，它带有一个进口可以接收培养液使其氧化，和一个出液口能 输出富氧的培养液，一个内表面可以促使气体和内表面更多的接触；一个和容器连接的驱 动器可以使容器转动来增加培养液中溶氧水平。培养设备还可以从传氧设备中获得溶过氧 的培养液。培养设备包括一个可以接收生物材料进入培养设备内部的通道；和一个在培养 设备内部进行液体交换的进口，它可以传输溶过氧的培养液更多的与生物材料接触。具体表现包括以下一个或多个方面的特征。培养设备所涉及到的生物材料包括细胞和组织。培养设备包括灌注柱，这是一种适合细胞培养的具有生物相容性的基质。生物相 容性基质包括，比如微载体和酯片载体。其中一些基质是包括聚合纤维的材料，它可以是纺 织的也可以是无纺的。灌注柱中培养液的流速控制是基于灌注柱子的高度的。培养液进入灌注柱的速度 控制是与其流出灌注柱的速度相等。并且，灌注柱是安装在一个可以调节的支架上来调节 灌注柱的高度。系统还包括一个泵，它是用来推动富氧的培养液进入培养设备。控制系统能够用来控制溶氧的培养液的流速，也可以进一步用来控制溶氧设备容 器的转速。在某些例子中，该设备容器有个倒置的圆锥形底部或锥形圆底。该发明的第四个的特征是该培养细胞系统包括一个罐体，该罐体有个第一个终端 和与第一个终端相反的第二个闭合的终端，第一个终端有个通路可以接收和排出培养液。 在罐体内部有个管状部件；该管状部件有第一个开口末端，在罐体第二个终端有第二个闭 口末端；圆盘膜与第一个开口末端相连接，这样至少可以部分套入第二个管状部件内部。第 二个管状部件定义为细胞培养室，圆盘状部分至少包括一个开口，可以使得培养室和第二 个管状部分的外部进行液体流通。驱动器与罐体连接来使罐体转动增加培养室中液体的溶 氧水平。这个方面的具体还包括下面一个或多个特点；这个管状部件是可以在罐体中拆分的，通过其第一个开口末端可以接收适合细胞 生长的生物相容性基质。管状部件的内壁可以促进气体和内表面的接触。第五个有关该发明的特征是，该细胞培养设备包括管状部件，它具有第一个末端 和与第一个末端是相反的第二个封闭末端，第一个末端有个通路可以进液和出液；生物相 容性的基质可以放在管状部件的内部；管状部件内部有一个可拆卸的圆盘状部件，它是用 来充分限制培养室中的这些生物相容性基质的圆盘状部件与管状部件第二个末端之间。圆 盘状部件包括至少一个开口允许培养液进入培养室。在一个具体表现中，一个帽可以连接管状部件的第一个末端用来堵住管状部件内 部。
该发明的第六个特征是，该细胞培养系统包括一个可以延长的部件，它有第一个 关闭终端和与第一个封闭末端相反的第二个封闭终端，培养室的内壁至少部分充满气体， 并且壁上有个进口，能够获得培养液。在培养室里配置了一个杆，其第一个和第二个末端均 位于延长的部件的通信末端。一套一个或多个圆盘状部件均同心地位于杆上。驱动器与杆 是机械连接的，可以转动圆盘状部件围绕杆的经向转动，促进培养液与延长组件的内表面 进行相对运动。传感器可以检测培养室中培养液的溶氧水平。 这一方面的具体表现包括以下一个或多方面生物相容性基质放置于延长组件内部的下部。生物相容性基质可包括聚合纤维。控制系统是用来接收来自传感器的信号，可以显示培养液中的溶氧水平，并且根 据收到的传感器信号进一步调整转速。延长组件还包括了第二个进口，它是用来引入气体进入延长部分的内部。控制系统同时也可以在延长组件的内部控制气体的组分。该发明的第七个特征是，这个系统可以给血液传氧，并输送这些血液给实验对象。 这个系统包括(1)适合输血的血液泵装置；(2)血液传氧装置与血液泵装置相连接；(3)传 输装置；(4)控制装置。血液传氧装置可以从血液泵装置中获取血液，并给血液传氧。例如，血液传氧装置 有一个血液生物反应器/传氧器，它包括(a)含壁的容器；(b)在容器中第一个入口适合含 氧气体的传输以使气体更多的接触到内壁；(c)容器的第二个进口是适用于输送血液更多 的与第二个表面壁接触，在此血液生物反应器/传氧器可以使血液流动以便可以血液与第 一层表面接触而产出含氧的血液；同时(d)第一个出口和第二个出口分别是用来排除含二 氧化碳的气体的和输送溶氧过的血液。输送装置连接到第二个出口，并且它适合将输送溶 过氧的血液给实验对象；控制装置是与血液传氧装置连接的。一个具体表现是，血液生物反应器/产氧器，可以血液运动起来，因此，血液和含 氧的气体重复不断的与第一表面接触。例如，这一运动是个循环运动。另一个体现，这个罐 体定义为在下部分有一个含倒置圆锥的底部或圆锥形的圆形底部的容器。在上述的系统中，血液生物反应器/传氧器进一步还包括pH电极、温度电极、及溶 氧电极。一方面，这个系统同时还有一个治疗装置，它可以从血液中去除不需要的组分。这 些组分包括化学试剂、生物分子、抗体、病毒或细胞。另外一个方面，该系统还包括光/辐射 源，用来杀死血液中不需要的细胞。 利用以上所描述的系统，本发明进一步提供了一种给人类或动物血液传氧的方法 和一种从实验对象的血液中去除不想要组分的方法。本发明还发明了一种利用以上所描述的系统来治疗血液溶氧有缺陷的症状患者 的方法。这些症状包括心血管紊乱(如心肌梗塞)、肺部衰竭、其他的呼吸性紊乱比如急性 呼吸困难综合症。本发明也突出了用来治疗癌症和肿瘤转移患者的方法，比如白血病、淋巴 瘤、恶性毒瘤等。本发明还突出一种治疗受微生物感染的方法，比如细菌、酵母细胞或病毒 的感染。每一种方法都包括了利用上述系统从血液中去除不需要组分的步骤(比如癌细 胞、细菌细胞、酵母细胞或病毒)。其他关于本发明的特点和优势，从下面的描述和权利要求中详细介绍。
图1是带转动生物反应器的细胞培养系统的第一个具体体现示意图。图2A和2B是图1的生物反应器的一个具体实施例示意图。图3是图2A的生物反应器内部表面的一张图片。图4是带转动生物反应器的细胞培养系统第二个具体体现示意图。图5是带转动生物反应器的细胞培养系统第三个具体体现照片。图6带转动生物反应器的细胞培养系统第四个具体示意图。图7A 7B是细胞培养系统的第五个具体的照片。图8A-8C是带有溶氧装置(“人工肺”)的灌注细胞培养系统的三个具体体现和一 个纸片载体包括柱体(A和B)或是有圆锥形底部(C)的培养容器的纸片载体示意图。图9是安装在洁净细胞室内的带溶氧装置的细胞培养系统的另一个具体体现的 照片。图10是一个带纸片载体的柱子用来灌注生物反应器系统图9和图8A-8C的照片。图11是一张容器内部一次性使用的塑料袋子的照片，这些袋子是用于图9和图 8A-8C生物反应器的。图12是图10中培养容器内部的纸片载体的电子显微照片。图13是一个以经典搅拌浆和鼓泡为溶氧装置的细胞培养灌注系统第二具体体现 的照片。图14是带有一个氧气传递转轮的细胞培养系统的一个具体体现示意图。图15是一个带有氧气传递转轮的细胞培养系统和容器内部堆有纸片载体的培养 容器的第二个具体体现示意图。图16是血液传氧系统第一个具体体现的结构图。图17是图16血液传氧、培养、再循环系统的第一个具体体现的示意图。图18是图16血液传氧、培养、再循环系统的第二个具体体现的示意图。图19是血液传氧使用的第二个具体体现的照片。图20是在溶氧环境中，微载体与CHO细胞粘附一起的照片。图21是在溶氧环境中，微载体与VERO细胞粘附一起的照片。图22A和B是在图8细胞培养系统中CHO-S (A)和CHO-Kl⑶细胞生长的照片。图23A和B是在图8A或8B的细胞培养系统中MDCK (A)和VERO⑶细胞生长的照 片。图24A和B是在图8A或B细胞培养系统中BHK-21 (A)和MARC145⑶细胞生长的 照片。发明详述1 总述氧气是细胞生长必需的营养成份，短暂的缺氧状态都可能导致细胞损伤，这会导 致器官紊乱或出现故障。比如心脏病和中风患者都是经历了血管堵塞或转换，这种变化阻 止了氧气输送到致病组织的细胞中。同时，由于缺氧，心脏和大脑会出现日益增多的恶化反 应。严重缺氧会导致器官完全衰竭，甚至死亡。较轻的，也需要住院专家，专门治疗，需要很 长时间才能复原。在许多生物临床情况中，在培养液或血液中的氧气水平是通过检测其中的溶氧(DO)浓度来反映的，DO就是说媒介中含有或携带有氧的一个相对值。本申请中，发现多种不同的系统和技术来提供溶氧的细胞培养环境和/或血液， 比如不采用传统的鼓泡或搅拌技术提高液体中的溶氧水平。这些系统和技术在生物医学应 用中相当广泛。2细胞培养系统该部分描述了各种各样具体的细胞培养系统，这些系统能够提供溶氧过的培养 液，并且可以用于很多种细胞的培养。2. 1带有摇床的生物反应器系统图1显示了采用转动的生物反应器的细胞培养系统110的第一个具体体现。这个 生物反应器可以用来培养悬浮或贴壁细胞。为了提高贴壁细胞的生长，可以在生物反应器 110中安装基质，使得细胞粘附在基质的表面生长。这些基质可以包括微载体(如用明胶制 作的基质、胶原、纤维素或其他的一些材料)和纸片载体(如有聚合纤维和丙烯酸胶)。
在这个具体体现中，生物反应器110包括一个壁112，是用来培养的，培养室114， 细胞或组织在其中生长。进口 116是在壁112中的，允许培养液122或气体124通过一个三 通管126进入培养室114中。根据不同的情况，气体124包括空气、氧气、氮气、二氧化碳或 是某些气体的混合气。出口 116，也是设计在壁112中的，是允许培养液进入培养室114的， 也可以选择性的连接到废液袋132上，传感器134进行检测(包括PH，溶氧和温度电极)。生物反应器110能够连接到罐体140上，罐体通过机械方法接到平台150上。驱 动器160连接到罐体140上，来使得生物反应器110绕轴142以一定速度旋转，这个过程可 以由控制系统170来控制。平台150可以固定的或沿XY轴运动(在图中有说明)，这样就 可以使得生物反应器110沿两个方向轮流循环运动了。关于图2A和2B，当生物反应器110绕轴142转动或滚动，或沿χ和y轴移动，培养 室114中的培养液不停的冲刷壁的内表面，比如在162和164之间的表面。在许多例子中， 由于生物反应器110的运动产生的培养液与表面的循环相互作用，能产生出更多的微小的 含有氧分子的气泡。当这些氧分子融入到培养液中，就可以得到高水平的溶氧了。在许多 实验中，采用上述的技术可以有效的提高培养液中溶氧，并且这种方法比直接鼓泡(传统 的搅拌技术)更有效。在许多例子中，生物反应器110是由玻璃或塑料制造的，有一个光滑的内部表面。 生物反应器可以做成一次性的也可以做成能重复使用的。如，生物反应器110包括了一次 性的容器111(塑料袋子)安装在一个可承受压力和一定热的容器内(例如，一个玻璃的罐 体)。在许多实验方案中，为了进一步增加溶氧效果，或为了支持高密度的细胞培养，生 物反应器110是由微米或纳米级的材料做表面的。比如，图2B中的生物反应器有一个不平 的内表面(有一系列不同维数和形状的凹面)，是为了提高气体与表面的接触。在第一个半 圈循环中，当培养液升到内表面的一端的时候，另一端暴露在空气中，在内表面就会形成一 层微小的氧气泡。然后，在第二个半循环中，这些小泡层又被冲进入培养液中，这样就导致 了一个快速的溶氧过程。在一些实验中，这种效果同样可以用内壁光滑的生物反应器来得 到。图3表明一种适合高密度细胞培养和增加溶氧的内表面的照片。
在许多实验中，生物反应器110的壁被认为是像山一样的微观表面，具体的可以通过纳米手段来辨别的(通过电子显微镜)。这样的结构或许在某些应用中可以提供更高 的氧气转换特征。比如，微观的凸凹，直径在1-2000纳米之间(5、10、50、100、200、500、1000 或1500纳米)，与内壁接触，可以破坏培养液的表面张力，因此可以产生出微小的气泡。生 物反应器的内壁可以由各种材料制作而成，包括玻璃、硅玻璃、钢铁、铝和不同型号的塑料。 必须得注意在反应器转动过程中即使产生出了气泡，但他们的大小及空间分布也是不同 的，只有那些含有溶氧的气泡才能提高培养液中的氧的含量。要注意反应器旋转和滚动的速度是能够根据培养液中的溶氧水平进行调整的。 如，溶氧感应器134可以用来实时监测溶氧水平，然后将测定结果反馈给电脑180。电脑180 对比DO实测值与设定值，来决定是否增加或减少传动器160的转速。在一些试验中，反应 器的转动是被控制的，这样内部的培养液看起来是相对静止的，因此减少了或限制了机械 应力对粘附在支架上的细胞的影响。这是一种在某些应用中想要得到的特征，基于搅拌浆 的反应器会产生剪切力或搅动力，这样会伤害到悬浮细胞。在进一步实验中，反应器的转动 和滚动速度是取决于想得到的冲刷力的大小(或基于内部培养室的中液体的流动速度)这 样可能符合反应器特殊的表面特征。图4给出细胞培养系统400的第二个特征，该系统采用了一个可以旋转的生物反 应器410.与第一个特征相似，生物反应器410是连接到容器440上的，通过发动机460，该 容器可以进行转动或滚动。机器410包括壁412定义为细胞培养室414，细胞可以在培养室 中生长。进口 416是在壁上的，可以使培养液，气体，或生物材料(包括细胞和组织)通过， 进入培养室414.图5给出了细胞培养系统500的第三个特征，就是它能使一套完整的转动生物反 应器510进入单一的系统。在这个特征中，每个生物反应器是由塑料制成的。生物反应器 安装在外罩上并连接到起动机，这样反应器既可以单独运行也可以同时一起运行。整个系 统可以放置于至少一个特殊的封闭环境中，(如孵育器)，同时可以控制温度，气体组分和湿度。图6给出了一个细胞培养系统600的第四个特征，它采用了一个可转动的生物反 应器610.这个反应器610采用了一个两层的结构，包括620的外罩，它有第一个终点622 和第二个闭合终点624，管子630处于外罩620的内部。管子630包括一个开口末端632， 一个闭合末端634，圆盘636连接到开口末端632上，为了在里面进行细胞培养。圆盘636 包括至少一个开口能够用来在培养室和外面交换培养液。在许多实验中，管子630可以从外罩620上拆卸下来，让细胞和组织进入管子630 的里面。在其他实验中，管子630固定在外罩620的里面，这样的话，细胞和组织能够通过 内部的通道650注射进入其中.培养液也能够通过内部通道650注射到培养室中，在一些 实验中，随着反应器610的转动和滚动，培养室内的培养液可以保持相对的水平。图7A和7B，给出了细胞培养系统700的第五个特征，它采用的三个可转动的反应 器710，连接到单一发动机760上。在此，生物反应器710包括了一个管子730 (塑料材质)， 在它的里面是生物相容性基质740。生物相容性基质包括微载体和纸片载体，这些在之前部 分已经讲到过。圆盘部分720是可拆卸的，处于管子内部的，这样圆盘部分720可以确保生 物相容性基质处于培养室内部。根据不同的操作，细胞或生物组织可以通过圆盘720的开口注射进入培养室。一些试验中，随着生物反应器710的转动和滚动，培养室内部的培养液可以保持相对水平。注意，以上所述的特征，能够放置于一个与图5相似的可控环境中。2.2 “人工肺”系统图8A给出了细胞培养系统800的第一个特征，它采用了溶氧装配(“人工肺”)820， 可以产生溶过氧的培养液输送给细胞培养设备840。溶氧装配820包括有一个进口 824的反应器822，可以获得由储水池810提供的培 养液，这些培养液经溶氧过进入反应器。反应器822安装了一个马达828，这个可以提高反 应器的转速，因此可以提高培养液中的溶氧。反应器822的结构和它的操作在2006年9月 递交的国际申请
发明者惠觅宙 申请人:美国安普公司;杭州安普生物工程有限公司