一种体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒学领域，特别是一种采用纯化的草鱼呼肠孤病毒(Grass carpreovirus, GCRV)核心与采用杆状病毒表达系统表达的外衣壳蛋白VP5和VP7进行体外重组形成完整病毒颗粒的方法。所用病毒株为草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873，已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏编号是CCTCC NO:V200414。
【背景技术】
[0002]草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类之一，在幼苗时易感染草鱼呼肠孤病毒，该病毒可引暴流行性草鱼出血病，并造成大批草鱼鱼苗死亡，给淡水养殖业造成严重的经济损失。对于病毒侵染机制的研宄有利于找到抗病毒药物作用的靶点，为抗病毒药物的研制及病毒性疾病的预防提供有效途径。GCRV是由双层衣壳组成的无囊膜病毒，内衣壳包括VP1-VP4和VP6五种蛋白，而外衣壳由VP5和VP7异源三聚体复合物组成。不同于囊膜病毒采用膜融合进入细胞的途径，GCRV的早期感染可能与外衣壳蛋白VP5和VP7介导的膜渗透有关，但对其进入细胞的分子机制知之甚少。
[0003]目前，结构生物学数据已经显示外衣壳蛋白VP5和VP7在GCRV侵染过程中有着重要功能，鉴于GCRV基因组是由11条分段的双链RNA组成，与其他双链分段RNA病毒一样，目前尚无法利用反向遗传学即通过基因水平的改变来实现对蛋白功能的研宄，限制了对外衣壳蛋白在GCRV侵染过程中介导的膜渗透机制的研宄，故有必要提供一种能有效地从分子水平揭示外衣壳蛋白VP5和VP7所介导的GCRV侵染机制的方法。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术存在的问题，本研宄提供一种体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，以便为从分子水平揭示GCRV侵染的分子机制及抗病毒药物的研发以及为草鱼出血病防治开辟新的有效途径。
[0005]本发明解决其技术问题采用以下的技术方案:
[0006]本发明提供的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，是一种草鱼呼肠孤病毒GCRV核心与杆状病毒表达系统表达外衣壳蛋白VP5和VP7的体外组装的方法，该方法包括以下步骤:
[0007](I)增殖 GCRV873:
[0008]采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株;
[0009](2)含有核酸的病毒核心的获取及离心纯化:
[0010]采用胰蛋白酶处理纯化的病毒，以降解外衣壳蛋白VP5和VP7，获得含有核酸的病毒核心，并采用氯化铯(CsCl)密度梯度进行离心纯化；
[0011 ] (3)外衣壳蛋白VP5和VP7的表达:
[0012]采用重组杆状病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染昆虫细胞系即Sf9细胞，以进行外衣壳蛋白VP5和VP7的大量表达；
[0013](4)体外组装:
[0014]将纯化的GCRV核心与在Sf9细胞中表达的外衣壳蛋白VP5和VP7按照合适的化学计量比进行混合孵育，实现GCRV的体外组装；
[0015](5)离心纯化:
[0016]采用CsCl密度梯度对体外组装后的病毒颗粒进行离心纯化，得到纯化的体外组装病毒粒子(R-GCRV)，其为具有感染性的体外组装草鱼呼肠孤病毒颗粒。
[0017]所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒颗粒，其所用核心颗粒浓度或颗粒数应达到1.2mg/mL 或 112个 /mL。
[0018]采用Sf9细胞大量表达外衣壳蛋白VP5和VP7后，其细胞数应达到17个/mL。
[0019]体外组装过程是:采用10mmol/L PBS (磷酸盐缓冲液)将纯化的病毒核心分别稀释成浓度为0.8-1.2mg/mL或颗粒数约为18-1O12个/mL，将vAcGCRV_VP5/VP7感染的Sf9细胞分别稀释成细胞数为15-1O7个/mL，其稀释的细胞经冻融后，将二者按照不同的化学计量比进行混合，28°C孵育3h，完成体外组装。
[0020]离心纯化时，采用30-50% CsCl密度梯度离心进行体外组装病毒的纯化，大约在40% CsCl密度梯度中获得大量体外组装的重组病毒完整颗粒。
[0021]本发明可以采用空斑分析法对R-GCRV的感染性进行测定。
[0022]本发明采用20mM NH4Cl进行阻断实验，对R-GCRV与N-GCRV的感染性进行分析，以验证二者的感染途径。
[0023]本发明将纯化的病毒核心与在Sf9细胞中表达外衣壳蛋白VP5和VP7至少按照101°:1O6个/mL比例混合孵育。
[0024]本发明与现有技术相比，具有以下主要优点:
[0025]其一.此方法简单、操作方便，有效克服了分段基因组病毒难于实施反向遗传学操作技术的局限性；
[0026]其二.此方法包装效率高，将外衣壳蛋白VP5和VP7与纯化的GCRV核心按照最适化学计量比混合孵育，可获取大量具有较高感染性的R-GCRV ；
[0027]其三.实验证实R-GCRV与N-GCRV具有相同的感染机制，该体外组装病毒方法将成为研宄GCRV侵染机制的一个有效工具。
【附图说明】
[0028]图1是空斑实验测定体外重组病毒的感染性示意图。
[0029]图中:A行1、2列为R-GCRV感染CIK细胞的结果，为实验组；3、4列为GCRV核心感染CIK细胞的结果，为阴性对照组；
[0030]B行1、2列为N-GCRV感染CIK细胞的结果，为阳性对照组；3、4列为VP5和VP7的细胞裂解液上清感染CIK细胞的结果，为阴性对照组。
[0031]从图中可以看出R-GCRV及N-GCRV感染CIK贴壁细胞后，培养皿底部出现了很多明显的分布均匀的空斑或空洞(图A，B;1、2列)，表明R-GCRV感染CIK细胞后，病毒可以在敏感细胞中复制，导致细胞裂解产生空斑。这一感染特征与N-GCRV —样。而图中A行、B行的3、4列为采用GCRV核心及表达VP5和VP7的细胞裂解液上清感染CIK细胞，无空洞产生，表明细胞未能受到感染。
【具体实施方式】
[0032]本发明提供的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，是在已实现了利用杆状病毒表达系统大量表达GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基础上进行的(专利号:200710168642.2)。采用表达的外衣壳蛋白VP5和VP7与纯化的GCRV核心进行体外组装，由此获得具有感染性的重组病毒颗粒。此方法可用于研宄外衣壳蛋白VP5和VP7在GCRV侵染宿主细胞过程中的作用，从而揭示GCRV侵染的分子机制。
[0033]本发明提供的上述体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，包括以下步骤:
[0034](I)采用CIK细胞(草鱼肾细胞系)进行病毒增殖，获得大量感染CIK细胞的草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873的病毒悬液；
[0035](2)通过离心法，对感染了 GCRV873的细胞病毒悬液进行浓缩和纯化；
[0036](3)采用胰蛋白酶处理纯化的病毒，使完整病毒外衣壳蛋白VP5和VP7完全降解，形成含有核酸的病毒核心颗粒，通过25-55% (w/v)CsCl密度梯度离心纯化，在50% CsCl梯度溶液中得到大量的病毒核心颗粒；
[0037](4)采用重组杆状病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染Sf9细胞，大量表达外衣壳蛋白VP5和 VP7 ；
[0038](5)将 vAcGCRV-VP5/VP7 感染的 Sf9 细胞经 _80°C及 37°C反复冻融 3 次，4000g 离心15min沉淀细胞碎片；
[0039](6)将纯化的病毒核心与杆状病毒表达系统大量表达的外衣壳蛋白VP5和VP7细胞裂解液上清按照不同化学计量比进行混合孵育，28°C孵育3h，完成体外组装；
[0040](7)采用30-50% (w/v)CsCl密度梯度离心纯化，在大约40% CsCl梯度中得到大量纯化的R-GCRV颗粒；
[0041](8)采用电镜技术，SDS-PAGE及空斑测定，进行R-GCRV形态结构、蛋白组分及感染性分析。结果表明，R-GCRV与N-GCRV在形态结构、蛋白组分和感染性等方面极为相似。
[0042]下面结合实施例对上述制备方法作进一步说明。
[0043]一.GCRV873的增殖及核心制备
[0044]采用CIK细胞(草鱼肾细胞系)进行GCRV873增殖。
[0045]1.CIK细胞培养:
[0046]细胞培养液为含10%胎牛血清的Eagle’s MEM培养基(MEM-10, Invitrogen公司产品)，PH 7.2。取液氮中保存的CIK细胞，37°C温育融化。在台式离心机上以5000g离心Imin后转移至T25细胞培养瓶(Corning公司产品)中，加5mL的MEM-10培养液进行培养。CIK细胞最适培养温度为28 °C，待细胞基本铺满培养瓶底后，采用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，进行传代培养。
[0047]2.GCRV873 的增殖:
[0048]传代的CIK细胞基本铺满培养瓶底时进行接毒，首先用10mmol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered salient,简称PBS)将预接种的CIK细胞冲洗2-3次，以除去牛血清蛋白组分；然后将GCRV悬液用无血清的MEM稀释后，按照病毒的感染复数MOI (Multiplicity of infect1n)约为lPFU/cell加入适当培养体积的病毒悬液至单层细胞培养瓶中，吸附细胞30min后倒掉上清液，再用lOmmol/L PBS清洗细胞2_3次，去除未吸附的病毒粒子。随后加入约1/10细胞瓶体积的含2%胎牛血清的MEM(MEM-2)维持液进行病毒增殖。待85%左右的细胞产生细胞病变(cytopathic effect, CPE)后，收集病毒悬液，于4°C保存备用。
[0049]3.GCRV873 的纯化:
[0050]将4°C保存的病毒悬液，以3800g低速离心30min，除去游离的细胞碎片。将除去细胞碎片的病毒悬液置超速离心机(Beckman公司产品)以100，OOOg超速离心2h,沉淀GCRV873颗粒。弃上清液，沉淀按1:250倍体积溶于10臟01/1 PBS中。随后在台式离心机上再以12，OOOg高速离心5min，除去残余的细胞碎片。
[0051]4.GCRV