通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及通过沉默番茄基因S1NZG培育耐贬番茄植株 的方法。
【背景技术】
[0002] 番茄是一种深受人们所喜爱的世界性蔬菜，而番茄营养丰富，具特殊风味。具有减 肥瘦身、消除疲劳、增进食欲、提高对蛋白质的消化、减少胃胀食积等功效。在自然界中，果 实软化有利于种子的传播和物种的稳定；而在农业和商业生产中，果实软化有利于改善口 感和营养价值。但是，果实过度软化后易发生腐烂、变质，造成巨大的经济损失。在自然条 件下，番茄未成熟果实可W室温保持2个月左右，而成熟的红果实只能保持30天左右。在 番茄成熟到运输转卖W及贬藏过程中，会有大量的番茄腐烂浪费。而近年来，随着基因工程 的迅速发展和RNAi技术体系的日益完善，基因工程技术在提高番茄耐贬性性方面显示了 极大的潜力。目前，基因工程技术已广泛的用于番茄品种的改良和育种中。利用基因工程 技术快速获得稳定遗传的番茄新品种必将是当前和未来的发展趋势。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供通过沉默番茄基因S1NZG培育耐贬番茄植株的 方法，该方法简单，能够获得耐贬番茄品种。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0005] 通过沉默番茄基因S1NZG培育耐贬番茄植株的方法，包括如下步骤：将SEQID NO. 3所示核巧酸序列反向连入地inl9载体SacI和甜aI酶切位点处，得RNAi载体 地inl9: :S1NZG;然后将地inl9: :S1NZG载体转化农杆菌，获得农杆菌工程菌，再W农杆菌 工程菌转染经过切割并预培养的番茄外植体，经共培养、诱导生芽及生根培养，最后筛选转 基因番茄植株，得耐贬性番茄植株。
[0006] 优选的，所述SEQIDNO. 3所示核酸序列由W下方法制备；WSEQIDNO. 1和SEQ IDN0.2所示序列为引物，番茄cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经纯化后得SEQID NO. 3所示核酸序列；所述PCR扩增的程序为94°C预变性5min;94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸Imin，共35个循环；最后72°C后延伸lOmin。
[0007] 优选的，所述RNAi载体地inl9::SlNZG的构建方法为将SEQIDNO. 3用Kpn I和化oI双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得RNAi中间载体 pHANNIBAL: :SlNZG(i)，然后用SacI和SpeI双酶切中间载体pHANNIBAL: :SlNZG(i)，再与 经SacI和甜aI双酶切的地inl9载体连接，得RNAi载体地IN19::S1NZG。
[0008] 优选的，制备农杆菌工程菌的方法是将农杆菌单菌落、含有游动质粒PRK2013的 大肠杆菌单菌落和含有重组质粒地inl9: :S1NZG的大肠杆菌D册a单菌落依次重叠均匀涂 在含有1. 2% (w/w)琼脂的抑7. 2的YEB固体培养基中央直径为1cm的圆圈中，28 + 2°C黑 暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团，在含有质量分数为1.2%的 琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的抑7. 2的YEB固体培养基中划 线，28±2°C黑暗条件下倒置培养2-2. 5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/ L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的抑7. 2的YEB液体培养基，在28±2°C、黑 暗、200巧m条件下摇床培养1. 5天至菌液均匀且ODe。。为1. 8-2. 0,提取重组质粒，用EcoRI 和甜al进行双酶切鉴定，阳性重组子即为农杆菌工程菌。
[0009] 优选的，预培养番茄外植体的步骤如下：
[0010] a.用体积分数为75%的酒精浸泡番茄种子2min，无菌水冲洗3次；再用灭菌的饱 和化3PO4浸泡种子2〇min，然后用无菌水冲洗3次；接着用1% (V/V)的化CIO水溶液浸泡 种子lOmin，无菌水冲洗7次；再用无菌水浸泡种子化后将番茄种子播种在MS固体培养基 上，然后于28°C光照1化和18°C黑暗她的培养箱中培养，且光照强度为1000-20001X，所述 MS固体培养基为庶糖终质量浓度3%、琼脂终质量浓度0. 6-0.8%的抑5. 9的MS培养基；
[0011] b.待种子萌发长出子叶得番茄外植体，然后将番茄外植体的子叶切下，在MS液体 培养基中浸泡比，滤纸吸干残留液体培养基并放置在质量分数为3 %的庶糖、质量分数为 0.8%的琼脂、Img/L嘲噪己酸、1. 75mg/L玉米素、抑为5. 9的MS固体培养基中，28°C光照 1化和18°C黑暗预培养Id得预培养番茄外植体。
[0012] 优选的，所述转染为将预培养番茄外植体置于农杆菌工程菌中浸染15分钟。
[0013] 优选的，所述共培养为将转染后的番茄外植体于质量分数为3%的庶糖、质量分 数为0.8%的琼脂、1111径/1嘲噪己酸、1.75111径/1玉米素、抑为5.9的15固体培养基中，在 28±2°C黑暗条件下共培养48小时。
[0014] 优选的，所述诱导生芽为将共培养后的番茄外植体于含有质量分数为3%的庶 糖、质量分数为〇.8%的琼脂、1.〇111肖/1嘲噪己酸、1.75111肖/1玉米素、50〇111肖/1駿节青霉素和 50mg/L卡那霉素、抑为5. 9的MS固体培养基中，在28°C光照16h、18°C黑暗她、光照强度 1000-20001X条件下诱导生芽。
[0015] 优选的，所述生根培养为将长至2~3cm的芽切下，转入含有质量分数为3%的庶 糖、质量分数为0. 8%的琼脂、250mg/L駿节青霉素和50mg/L卡那霉素、抑为5. 9的MS固 体培养基中，在28°C光照16h、18°C黑暗她、光照强度1000-20001X条件下培养至生根。
[0016] 优选的，所述筛选转基因番茄植株的方法是WSEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5所示 序列为引物，生根番茄植株基因组DM为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分 析，PCR产物在900bp位置出现目标DNA条带则为转基因番茄植株；所述PCR扩增程序为 94°C预变性5min;94°C变性30s;56°C退火30s;72°C延伸Imin，共35个循环；72°C后延伸 lOmin。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明利用番茄SINZG基因核屯、片段构建番茄SINZG基 因沉默的RNAi载体，将该RNAi载体转入番茄，所得S1NZG基因沉默番茄阳性植株中S1NZG 基因的表达均较野生型植株显著降低，成功获得了耐贬性番茄品种。与传统育种方法通过 杂交等方法培育高产品种的周期长、耗资多、增产效果不理想且不可稳定遗传相比，本发明 采用基因工程技术，高效并可稳定遗传地提高了番茄果实的耐贬性W及抗病菌感染能力的 特征。为番茄的品种改良作出了积极的探索，也为其他植物的耐贬性育种提供了参考和借 鉴，所得耐贬性番茄新品种具有良好的市场应用前景和经济价值。
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1为番茄S1NZG基因核屯、段和重组质粒pHANNIBAL::SlNZG构建的琼脂糖凝 胶电泳分析图（A为PCR扩增S1NZG基因核屯、片段，1和2为扩增结果，M为Marker;B为 中间载体PHANNIBAL::S1NZG的PCR鉴定结果，1为扩增结果，M为Marker;C为终载体 地IN19: :S1NZG的PCR鉴定结果，1为扩增结果，2为阴性对照，M为DNA分子量标准（Maker, 单位bp))。
[0020] 图2为S1NZG基因沉默番茄植株。
[002U图3为PCR检测NPTII报告基因在S1NZG基因沉默番茄植株中的表达（M为DL2000plus 为7个独立S1NZG基因沉默株系）。
[0022] 图4为S1NZG基因在S1NZG基因沉默番茄阳性植株中的沉默效果鉴定（AC为野生 型番茄，1#-3#为不同的S1NZG基因沉默番茄阳性株系）。
[0023] 图5为S1NZG基因沉默番茄阳性植株果实耐贬性鉴定结果图（AC为野生型番茄 B+4果实，1#和2#为S1NZG基因沉默阳性植株B+4果实，上面是刚采摘果实，下层为常温放 置两个月果实）。
【具体实施方式】
[0024] W下将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例 仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。优选实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第=版，J.萨姆布鲁克等著，黄培 堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。<