br>[0045] 根据S1NZG基因的全长序列，在S1NZG沉默序列之外的序列设计特异性沉默鉴定 引物，同时根据内参基因序列，设计特异性定量引物，其序列如下：
[0046] qNZG-F;5, -aggcaaacaaaagttcacatatta-3，（沈QID NO. 6);
[0047] qNZG-R;5,-ttcggagagaaggaggacc-3，（沈QID NO.7);
[0048] qCAC-F;5, -cctccgttgtgatgtaactgg-3，（沈QIDNO.8);
[0049] qCAC-R;5,-attggtggaaagtaacatcatcg-3，（沈QIDNO. 9);
[0化0]分别取SINZG基因沉默番茄阳性植株和野生型番茄植株的B+4时期的果实，提取 总RNA，按照RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0试剂盒说明书，W oligodT为引物将总RNA反转录 为cDNA，再W所得cDNA为模板，分别W qNZG-F和qNZG-R，qCAC-F和qCAC-R为引物进行 qPCR，检测S1NZG基因在S1NZG基因沉默番茄阳性植株中的表达，qPCR反应程序如下；95°C 预变性2111111;951：变性153,601：退火403，共40个循环；951：保温1111111;651：，23，每个循 环上升0. 5°C至95°C。然后统计S1NZG基因表达情况，结果如图4所示。结果显示，S1NZG 基因沉默番茄阳性植株中S1NZG基因的表达都较野生型番茄植株显著降低，基因沉默效率 较高。
[0化1] 实施例6、S1NZG基因沉默番茄阳性植株的耐贬性分析
[0化2] 将上述筛选出的S1NZG基因沉默番茄阳性植株和野生型番茄植株按常规方法培 育，待果实成熟之后观察分析S1NZG基因沉默番茄阳性植株果实的耐贬性。B+4时期果实在 常温贬藏两个月后，野生型果实明显腐烂；而SINZG基因沉默植株果实仍然未发生腐烂，而 且颜色鲜亮，表现出更优良的耐贬性和抗病性，结果如图5所示。
[0053] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：将 SEQIDNO. 3所示核苷酸序列反向连入pBinl9载体Sac I和Xba I酶切位点处，得RNAi载 体pBinl9: :S1NZG ;然后将pBinl9: :S1NZG载体转化农杆菌，获得农杆菌工程菌，再以农杆 菌工程菌转染经过切割并预培养的番茄外植体，经共培养、诱导生芽及生根培养，最后筛选 转基因番茄植株，得耐贮性番茄植株。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SEQIDNO. 3所示核酸序列由以下 方法制备：以SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示序列为引物，番茄cDNA为模板进行PCR扩 增，扩增产物经纯化后得SEQIDNO. 3所示核酸序列；所述PCR扩增的程序为94°C预变性 5min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C后延伸lOmin。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RNAi载体pBinl9: :SlNZG的构建方 法为将SEQIDNO. 3所示序列用KpnI和XhoI双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL 载体连接，获得RNAi中间载体pHANNIBAL::SlNZG(i)，然后用SacI和SpeI双酶切中间载 体pHANNIBAL: :SlNZG(i)，再与经SacI和XbaI双酶切的pBinl9载体连接，得RNAi载体 pBIN19::SlNZGo
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：制备农杆菌工程菌的方法是将农杆菌单 菌落、含有游动质粒PRK2013的大肠杆菌单菌落和含有重组质粒pBinl9: =SlNZG的大肠杆 菌DH5a单菌落依次重叠均匀涂在含有I. 2% (w/w)琼脂的pH7. 2的YEB固体培养基中央 直径为Icm的圆圈中，28±2°C黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌 团，在含有质量分数为1. 2 %的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的 pH7. 2的YEB固体培养基中划线，28±2°C黑暗条件下倒置培养2-2. 5天至长出单菌落，挑取 3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的pH7. 2的YEB液 体培养基，在28±2°C、黑暗、200rpm条件下摇床培养1. 5天至菌液均匀且006(|(|为1. 8-2. 0， 提取重组质粒，用EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，阳性重组子即为农杆菌工程菌。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预培养番茄外植体的步骤如下： a. 用体积分数为75%的酒精浸泡番茄种子2min，无菌水冲洗3次；再用灭菌的饱和 Na3PCV^泡种子20min，然后用无菌水冲洗3次；接着用1% (V/V)的NaClO水溶液浸泡种 子lOmin，无菌水冲洗7次；再用无菌水浸泡种子4h后将番茄种子播种在MS固体培养基上， 然后于28°C光照16h和18°C黑暗8h的培养箱中培养，且光照强度为1000-20001x，所述MS 固体培养基为蔗糖终质量浓度3%、琼脂终质量浓度0. 6-0. 8%的pH5. 9的MS培养基； b. 待种子萌发长出子叶得番茄外植体，然后将番茄外植体的子叶切下，在MS液体培养 基中浸泡lh，滤纸吸干残留液体培养基并放置在质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8% 的琼脂、lmg/L吲哚乙酸、I. 75mg/L玉米素、pH为5. 9的MS固体培养基中，28°C光照16h和 18°C黑暗预培养Id得预培养番茄外植体。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转染为将预培养番茄外植体置于农 杆菌工程菌中浸染15分钟。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养为将转染后的番茄外植体于 质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8%的琼脂、lmg/L吲哚乙酸、I. 75mg/L玉米素、pH为 5. 9的MS固体培养基中，在28±2°C黑暗条件下共培养48小时。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述诱导生芽为将共培养后的番茄外植 体于含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8%的琼脂、I.Omg/L吲哚乙酸、I. 75mg/L玉 米素、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5. 9的MS固体培养基中，在28°C光照 16h、18°C黑暗8h、光照强度1000-20001x条件下诱导生芽。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生根培养为将长至2~3cm的芽 切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、250mg/L羧苄青霉素和 50mg/L卡那霉素、pH为5. 9的MS固体培养基中，在28°C光照16h、18°C黑暗8h、光照强度 1000-20001x条件下培养至生根。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选转基因番茄植株的方法是以 SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5所示序列为引物，生根番茄植株基因组DNA为模板进行PCR扩 增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR产物在900bp位置出现目标DNA条带则为转基因 番茄植株；所述PCR扩增程序为94°C预变性5min;94°C变性30s;56°C退火30s;72°C延伸 lmin，共35个循环；72°C后延伸lOmin。
【专利摘要】本发明公开了通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法，包括将SEQ ID NO.3所示核苷酸序列反向连入pBin19载体Sac I和Xba I酶切位点处，得RNAi载体pBin19::SlNZG；然后将pBin19::SlNZG载体转化农杆菌，获得农杆菌工程菌，再以农杆菌工程菌转染经过切割并预培养的番茄外植体，经共培养、诱导生芽及生根培养，最后筛选转基因番茄植株，得耐贮性番茄植株；获得的耐贮性番茄植株SlNZG基因沉默表达，经果实耐贮性实验发现，SlNZG基因沉默的番茄果实耐贮性大大提高，该方法能够用于耐贮性番茄品种的培育。
【IPC分类】C12N15-29, A01H5-00, C12N15-84
【公开号】CN104774869
【申请号】CN201510187504
【发明人】胡宗利, 陈国平, 李安洲, 郭旭虎, 朱智国, 王玲玲
【申请人】重庆大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月20日