一种利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于微生物应用与纳米砸合成领域，具体地，涉及利用水生拉恩氏菌制备生物纳米砸的方法。
【背景技术】
[0002]砸(Se)是动物和人类所必需的一种微量元素，与人体内抗氧化功能，甲状腺激素代谢，和免疫系统等密不可分。缺砸会造成人类肌肉萎缩，心血管、骨骼或免疫系统疾病，增加癌症的风险，但过量砸也会对人体产生毒害。然而，在我国砸的分布极不均匀，缺砸地区占有相当大的比例，迫切需要解决。目前，通过补食植物富砸产品的应用最为广泛，其生产主要是依靠施用砸肥补充砸盐，但砸盐具有较高的毒性，会对环境带来潜在风险。
[0003]据研宄纳米材料可表现出新的特征，比如表面活性高，比表面积大，活性位点多，及较高的催化效率等，应用范围广泛。而纳米砸作为一种有益的低毒元素逐渐成为研宄热点，用纳米砸作为抗氧化剂可以降低砸毒害风险，纳米砸颗粒与C = O，COO和C-N组蛋白结合时会表现出重要的生物活性，可用于生物、化学、医药等领域，比如可以生产砸-维生素、食品添加剂、新型抗生素衣料，纳米砸医用材料以及在防治癌症方面的应用等。纳米砸还能够抑制人类乳腺癌细胞(MCF-7)的生长以及致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长。并且纳米砸具有很好地光电学和半导体特性，已广泛应用于太阳能电池、整流器、传感器，静电复印等光电元件。所以纳米砸在工业、保健品产业及富砸农作物产业中具有极大地应用潜力。
[0004]纳米砸通常通过化学反应，结晶技术，反向胶束法等技术生成，但这些技术会受到高温、高压、催化剂等条件限制，而且会对环境造成危害，生产的纳米砸性质也不稳定。进而需要一种清洁，无毒，环保的方法来生产稳定的纳米砸。
[0005]细菌对砸在自然界中的循环发挥着重要作用，尤其是根际促生菌(PGPR)可促进植物对砸的吸收。已发现许多细菌如如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、深红红螺菌(Rhodospirillum Molisch)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、焚光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)等可将氧化态砸还原为无毒高效的红色纳米砸，而且这种纳米砸性质稳定，活性高。由于细菌具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点，所以利用微生物转化砸不受季节和气候的影响，生产周期短，故利用细菌合成生物纳米砸被认为是一种高效砸的生物转化和降低环境风险的解决方式之一。其中水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2具有很好的溶解磷作用，产生植物促生物质IAA和PQQ，同时能够产生植物抗菌物质，对植物具有防病促生效果，目前还未见利用水生拉恩氏菌合成生物纳米砸的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种生物纳米砸的制备方法。
[0007]本发明的另一个目的在于提供水生拉恩氏菌在制备生物纳米砸中的用途。
[0008]本发明的生物纳米砸的制备方法，是以砸酸盐或亚砸酸盐为原料，以水生拉恩氏菌为发酵菌，发酵生产生物纳米砸。
[0009]本发明的生物纳米砸的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)活化的水生拉恩氏菌接种于LB液体培养基中，加入砸酸盐溶液；
[0011](2)振荡培养。
[0012]本发明的生物纳米砸的制备方法，还包括步骤(3)收集培养液，离心，冲洗沉淀，向沉淀中加入氢氧化钠溶液，沸水浴，静置至室温，再加入正己烷溶液，静置分层后取下层的红色溶剂相。
[0013]其中步骤(3)中，离心条件为8000_12000r/min，离心5_15min ;向沉淀中加入IN氢氧化钠溶液，沸水浴15-25min，再加入总溶液1/2体积的正己烷，搅拌均匀，静置分层后取下层的红色溶剂相。
[0014]优选地，离心条件为10000r/min，离心1min ;沸水浴20min。
[0015]本发明的上述方法，还包括步骤(4)用盐酸调红色溶剂相pH值7.5-7.0，离心去上清，重复操作多次后，将沉淀悬浮于去离子水中，得到生物纳米砸悬浮液。
[0016]优选地，步骤(4)用盐酸调红色溶剂相pH值7.2。
[0017]进一步地，步骤(4)中，盐酸浓度为6M，离心条件为8000-12000r/min，30min。
[0018]进一步地，本发明的生物纳米砸制备方法中，步骤(I)的砸酸盐为砸酸钠或亚砸酸盐为亚砸酸钠；当为砸酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为50-575mM ;当为亚砸酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为5-75mM。
[0019]更进一步地，当为砸酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为80mM ;当为亚砸酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为15mM。
[0020]优选地，本发明方法中所用的水生拉恩氏菌为保藏编号为CGMCC N0.1896的水生拉恩氏菌HX2。该菌已于2006年12月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis。
[0021 ] 本发明的方法中，步骤⑵振荡培养的条件为26-28 0C，160-200r/min,培养72-96ho
[0022]优选地，步骤(2)振荡培养的条件为28°C，180r/min，培养72_96h。
[0023]本发明还提供了水生拉恩氏菌在制备生物纳米砸中的应用。
[0024]本发明制备生物纳米砸的方法清洁无毒，环保高效，合成的纳米砸性质稳定，杂质少，粒径均一，分散度好，可用于生产富砸产品。本发明方法弥补传统方法生产纳米砸及富砸产品方式的不足，从而达到环保高效的效果，可广泛应用于富砸产品的开发等领域，同时该生物纳米砸在工业、保健品产业应用潜力巨大，具有较好的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0025]图1为不同浓度亚砸酸钠对水生拉恩氏菌HX2菌的影响图。
[0026]图2为不同浓度砸酸钠对水生拉恩氏菌HX2菌的影响；
[0027]图3为添加15mM亚砸酸钠所得纳米砸与水生拉恩氏菌混合液检测图，其中图3A为环境扫描电子显微镜(ESEM)照片，图3B为透射电子显微镜(TEM)照片，图3C为纳米砸能谱(EDX)分析图，箭头所指为纳米砸颗粒分析；
[0028]图4为添加200mM砸酸钠所得纳米砸与水生拉恩氏菌混合液检测图，其中图4A为环境扫描电子显微镜(ESEM)照片，图4B为透射电子显微镜(TEM)照片，图4C为纳米砸能谱(EDX)分析图，箭头所指为纳米砸颗粒分析；
[0029]图5为分离纯化所得生物纳米砸颗粒透射电子显微镜(TEM)照片；
【具体实施方式】
[0030]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0031 ] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]实施例1水生拉恩氏菌对亚砸酸钠(Na2SeO3)的耐受实验
[0033]1、1^液体培养基为:似(:1 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去离子水1L，121°C高压灭菌20min。
[0034]LB固体培养基:NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，去离子水1L，分装至10mL的三角瓶中(25mL/瓶)，121°C高压灭菌20min。
[0035]分别向上述高压灭菌后的LB固体培养基中加入提前过滤除菌的IM的亚砸酸钠母液配制成以下浓度 OmM(CK)、60mM、70mM、75mM、85mM、95mM、105mM、115mM 的含亚砸酸钠的 LB
培养基。
[0036]2、吸取100 μ L活化好的水生拉恩氏菌ΗΧ2菌液(OD6tltl= 0.8)，用0.85 %的生理盐水梯度稀释，最终得到稀释度分别为10_3、10_4、10_5、10_6的菌液待用。
[0037]3、分别吸取2.5 μ L上述梯度(10_3、10_4、10_5、10_6)的菌液滴加到含不同砸浓度的平板上，每个梯度重复三次，待菌滴晾干后，将平板倒置于，28°C条件下静置培养96h。
[0038]4、结果如图1所示:培养96h后将平板取出观察①颜色:60?115mM的7个处理中，稀释度为10_3、10_4、10_5均有红色菌落长出，当处理浓度高于75mM时，随着处理浓度的增加，红色显著变淡单个菌落大小:当处理浓度高于75mM之后，各处理条件下单个菌落的尺寸相对于空白对照CK(不添加亚砸酸钠的LB平板)明显变小；③菌落个数:当稀释度为10_5时，砸浓度为75mM的处理下的单菌落个数与空白对照CK的菌落个数之间具有显著性差异(P〈0.05)。
[0039]5、最小抑制浓度的确定:综合上述步骤4中的分析，得到亚砸酸