5-羟甲基糠醛及其衍生物的酶氧化的制作方法
【专利说明】5-羟甲基糠醛及其衍生物的酶氧化
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年7月20日提交的美国临时申请序列号61/673,913的优先 权。该申请的内容全部通过引用结合在此。
[0003] 对序列表的引用
[0004] 本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。 发明领域
[0005] 本发明涉及用于通过用半乳糖氧化酶和/或环化酶进行催化氧化来氧化5-羟甲 基糠醛（HMF)、2, 5-二甲酰基呋喃（DFF)、5-羟甲基-2-呋喃羧酸（HMFCA)、以及甲酰基呋喃 羧酸（FFCA)的工艺。
[0006] 背景
[0007] 不同工业所需的化合物多年来一直源自于石油化学工业。然而，由于原油价格的 增加以及用可再生资源代替石油化学产品的总体意识的存在，对于基于可再生资源生产化 合物一直存在一个希望并且仍然是一个希望。
[0008] 5-羟甲基糠醛（HMF ;CAS :67-47-0)是这样一种化合物的一个实例，因为它源自 于糖的脱水，这使它可以从可再生资源中获得。HMF可以例如被转化为多种有用的产物，例 如经铜-钌（CuRu)催化剂通过氢解C-0键被转化为液体生物燃料2, 5-二甲基呋喃（罗 马-莱西考伍（Roman-Leshkov)Y等人，自然（Nature)，2007, 447, 982)，或通过氧化被转 化为2, 5-呋喃二羧酸（FDCA)(博伊森（B〇isen)A等人，化学工程研宄和设计（Chemical Engineering Research and Design)，2009, 87, 1318-1327)。后面的化合物 FDCA 可在聚 酯（例如聚对苯二甲酸乙二酯（PET)和聚对苯二甲酸丁二酯（PBT))的生产中用作对苯二 甲酸的替代。FDCA的一个缺点是，化学合成需要高压、高温、金属盐以及有机溶剂，使得该 工艺昂贵并且有污染性（库普曼（Koopman)等人，生物资源技术（Bioresource Technolo gy)2010, 101，6291-6296)。
[0009] 2, 5-二甲酰基呋喃（DFF ;CAS :823-82-5)是HMF的一种被氧化的二醛，其可在一 系列不同的应用中用作结构基元和交联剂。例如，DFF可用作用于聚合物生产的一个单体， 例如与脲组合，或可被进一步氧化为有用的结构基元，例如FFCA和FDCA。它还可以代替其 他常用的醛，例如用于皮革交联的戊二醛或与脲、三聚氰胺和/或苯酚组合的用于木质复 合材料交联的甲醛。然而，难以通过传统化学法将HMF选择性氧化为DFF，因为该反应常不 加选择地氧化，产生多种氧化产物的组合。
[0010] 由于升高的酶-底物特异性，通过酶催化选择性氧化HMF可对化学法提供一个替 代方案。然而，HMF不是一种已知的天然酶底物，所以鉴别具有适合结构的能够选择性氧化 HMF的酶将具有挑战性。
[0011] 德乌尔泽恩（Deurzen)等人，碳水化合物化学杂志（J Carbohydrate Chemistry) 1997, 16, 299-309描述了使用氯过氧化物酶催化剂用过氧化氢将HMF氧化为 DFF。W0 2009/023174表明使用例如芳基醇氧化酶和氯过氧化物酶将HMF氧化为DFF和其 他HMF氧化产物。W02008/119780表明了使用真菌环化酶从吡啶产生N-氧化物。
[0012] 然而，由于酶特性（例如在不同条件下的稳定性和活性）上的变异性，在本领域中 鉴别能够产生HMF氧化产物（例如DFF、FFCA和FDCA)的可替代酶会是有利的。本发明尤 其提供了用于制备这类氧化产物的方法。
[0013] 概述
[0014] 此处描述了使用半乳糖氧化酶和/或环化酶来氧化5-羟甲基糠醛（HMF)和HMF 衍生物的酶法。
[0015] 在一个方面是一种氧化5-羟甲基糠醛（HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下 在反应混合物中使HMF接触一种半乳糖氧化酶，以提供2, 5-二甲酰基呋喃（DFF)。在一些 实施例中，该半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在 一些实施例中，该半乳糖氧化酶是在对应于SEQ ID勵:2的位置326、329、330、以及406的 一个或多个（若干个）位置处包括取代的一个变体。在实施例中，该反应混合物进一步包括 一种环化酶，并且DFF被进一步氧化为甲酰基呋喃羧酸（FFCA)、2, 5-呋喃二羧酸（FDCA)、其 盐、或前述各项的一种混合物。在这些实施例中的一些中，该环化酶与SEQ ID N0:9、10、ll、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或 32 中任一项的成熟 多肽序列具有至少60%序列一致性。在一些实施例中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO: 10 的位置76、134、以及201的一个或多个（若干个）位置处包括取代的一个变体。
[0016] 在一个方面是一种氧化HMF的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中 使HMF接触一种环化酶，以提供DFF、HMFCA、FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。 在一些实施例中，该环化酶与 SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在 一些实施例中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO: 10的位置76、134、以及201的一个或多个 (若干个）位置处包括取代的一个变体。
[0017] 在一个方面是一种氧化DFF的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中 使DFF接触一种环化酶，以提供FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在一些实施例 中，该环化酶与 SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在一些实施例中， 该环化酶是在对应于SEQ ID NO: 10的位置76、134、以及201的一个或多个（若干个）位置 处包括取代的一个变体。
[0018] 在一个方面是一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸（HMFCA)或其盐的方法，该方法包 括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种半乳糖氧化酶，以提供FFCA或 其盐。在一些实施例中，该半乳糖氧化酶与SEQ ID N0:2的成熟多肽序列具有至少60%序列 一致性。在一些实施例中，该半乳糖氧化酶是在对应于SEQ ID N0:2的位置326、329、330、 以及406的一个或多个（若干个）位置处包括取代的一个变体。在一些实施例中，该反应 混合物进一步包括一种环化酶。在这些实施例中的一些中，FFCA被进一步氧化为FDCA或 其盐。在这些实施例中的一些中，该环化酶与SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60%序 列一致性。在这些实施例中的一些中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO: 10的位置76、134、 以及201的一个或多个（若干个）位置处包括取代的一个变体。
[0019] 在一个方面是一种氧化HMFCA或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应 混合物中使HMFCA或其盐接触一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸FFCA、FDCA、其盐、或前 述各项的一种混合物。在一些实施例中，该环化酶与SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少 60%序列一致性。在这些实施例中的一些中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO: 10的位置 76、134、以及201的一个或多个（若干个）位置处包括取代的一个变体。
[0020] 在一个方面是一种氧化FFCA或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应 混合物中使FFCA或其盐接触一种环化酶，以提供FDCA或其盐。在一些实施例中，该环化酶 与 SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、 或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在这些实施例中的一些中，该环 化酶是在对应于SEQ ID NO: 10的位置76、134、以及201的一个或多个（若干个）位置处包 括取代的一个变体。
[0021] 附图简要说明
[0022] 图1显示5-羟甲基糠醛（HMF)的氧化产物