用于诊断前列腺癌的靶向RNA-Seq的方法和材料的制作方法

用于诊断前列腺癌的靶向RNA-Seq的方法和材料的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月28日提交的美国临时申请61/665, 849、2012年8月21 日提交的美国临时申请61/691，743和2012年10月4日提交的美国临时申请61/709, 517 的权益，上述所有美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于诊断和界定例如前列腺癌的病症的分期或发展进程的方法和组 合物。
【背景技术】
[0004] 美国联邦药品管理局（US Federal Drug Agency)在1994年批准了使用前列腺特 异性抗原（PSA)作为用于前列腺癌的诊断性生物标志物。自从该批准之后的近二十年来， PSA测试一直是用于诊断前列腺癌、监视前列腺癌的复发以及跟踪治疗功效的主要工具。尽 管PSA测试被广泛应用，但其存在许多缺点，已经导致了晚期前列腺癌引起的死亡率仅有 很小的改变。为了降低前列腺癌引起的死亡率和前列腺癌对生活质量的负面影响，需要一 种新的工具，其不仅能够更精确地进行初步诊断、而且还能够用来评估原发性前列腺癌扩 散的风险、以及能够用来监视对治疗性干预（therapeutic interventions)的响应。
[0005] 目前，认为约4ng/ml的PSA的血清水平能够指示前列腺癌，而认为10ng/ml以上 的PSA水平能够高度地提示前列腺癌。当进行前列腺癌检查时不单独使用PSA血液测试， 通常还要进行直肠指检查（DRE)。在PSA测试或DRE检查结果为异常时，通常要进行活体组 织检查（biopsy)，该检查是从前列腺取下少量组织样品并进行检查。在结果为前列腺癌阳 性时，可能需要进一步检测以确定癌症的发展进程的分期，该检测例如为骨骼扫描、计算机 断层（CT)扫描或骨盆淋巴结解剖检查。
[0006] 尽管PSA测试具有良好的敏感度（80% )，但该测试具有接近75%的假阳性率。例 如，已经估算了对于4-10ng/ml的PSA值，在进行的约四例活体组织检测中，发现仅有一例 是真实的前列腺癌诊断（Catalona等，J. Urol. 151 (5) : 1283-90, 1994)。计算游离的PSA占 全部的（即，游离的加束缚的）PSA的比率的检测，该检测不具有比标准PSA检测显著更高 的特异性或敏感度。
[0007] 更高的PSA水平往往需要进行活体组织检测，来确定在前列腺中是否存在癌细 胞，并且可能需要进行局部前列腺手术来切除。尽管手术能够去除局部肿瘤，并且通常能够 改善前列腺癌-特异性死亡率，但是其也掩盖了以下事实：在许多患有前列腺癌的患者中， 甚至在没有进行手术的情况下，该患者不会经历其疾病发展为转移癌或经历死亡。
[0008] 与PSA检测相关的高假阳性率导致需要进行许多不必要的活体组织检查。除了与 活体组织检查相关的身体不适和心理困扰之外，还已经提示了进行活体组织检查可能促进 癌组织的炎症反应并且增加肿瘤转移的风险。
[0009] 目前，由活体组织检查的结果所构建的病理分级和癌症分期的预后因子，和诊断 的血液中的前列腺-特异性的抗原水平，其并不足以将具有高风险的癌症发展进程的前列 腺癌患者与那些可能死于其他原因的前列腺癌患者进行分离。
[0010] 一旦诊断出了前列腺癌的高风险性或恶性形式，其控制策略可能涉及以下治疗： 如是在肿瘤转移之前发现，则进行手术以去除该前列腺体，进行辐射治疗以消灭前列腺内 的癌细胞，以及进行通常称为雄激素消除治疗（androgen depletion therapy)的基于药物 的睾丸酮抑制治疗。这些不同的治疗在某些情况下可能能够治愈，或者推迟死亡时间。但 是，对于那些具有最恶性形式的前列腺癌的患者，其癌症往往在手术之后或放疗之后再次 复发，并且其癌症发展为对雄激素消除治疗具有抗性，通常以死亡为结果。
[0011] 早期发现前列腺癌的恶性形式是非常关键的，但是专家医生的结论是：仅靠PSA 检测不足以将那些癌症会变成恶性癌且发展为危及预期寿命的患者，与那些患有发展缓慢 的癌症的患者进行区分。
[0012] 以下是PSA检测为何不能够满足男性健康需求的一些关键原因：
[0013] i?癌症类型
[0014] 前列腺癌中至少涉及两种基本的细胞类型。腺癌是前列腺中的表皮细胞癌症，其 解释了约95%的前列腺癌。神经内分泌肿瘤可能是从前列腺的内分泌（激素）细胞和神 经系统中产生，其解释了约5%的前列腺癌。神经内分泌细胞具有例如特异性分泌颗粒、产 生生物胺和多肽激素以及在肠、肺、唾液腺、脑垂体腺、胰腺、肝脏、胸和前列腺中最为常见 等共同特征。神经内分泌细胞与恶性腺癌共-增殖，并且该细胞分泌表现为刺激腺癌细胞 生长的因子。神经内分泌肿瘤是罕见的，并且认为其生长非-PSA分泌且具有抗原-非依赖 性。
[0015] ii?无症状男性
[0016] 15% -17%的患有前列腺癌的男性，其癌症能够生长但不产生增加的或者较高的 PSA血液水平。在这些称为无症状的患者中，其PSA检测往往随着癌症的生长产生假阴性的 检测结果。
[0017] iii. BPH、前列腺炎和 PIN
[0018] 良性前列腺肥大（BPH)，是一种上皮细胞的非恶性生长，它和前列腺炎均是前列腺 类疾病，该类疾病通常由前列腺的感染引起。BPH和前列腺炎均常见于50岁以上的男性， 并且均能够导致增加的PSA水平。发病率从每年每1000名45-49岁男性中有3例发生， 增加到每年每1000名75-79岁男性中有38例发生。尽管对于45-49岁男性，其患病率为 2. 7%，但是这个数字在80岁男性中增加到至少为24%。尽管前列腺癌是由上皮细胞的增 殖失调所引起，而BPH却通常是由正常的上皮细胞增殖所引起，并且其通常并不导致恶性 化（Ziada等（1999)Urology53(3增刊3D) : 1-6)。仅在约10%的患有慢性前列腺炎/慢 性盆腔疼痛综合征症状的男性中，能够显示具有前列腺的细菌性感染。能够从患有慢性细 菌性前列腺炎的患者中进行培养的细菌主要是革兰氏-阴性尿路病原体。例如葡萄球菌和 肠球菌的革兰氏-阳性菌，以及例如衣原体、尿素病原体、支原体的非典型菌的角色至今仍 存在争议。
[0019] 另外一种情况，称为前列腺上皮内肿瘤（PIN)，其可能早于前列腺癌5~10年发 生。尽管检测和监视这种潜在的癌症前期状况的能力，对于早期检测前列腺和增加前列腺 癌的生存率均有贡献，但是目前并没有针对PIN的特异性诊断检测。
[0020] iv.前列腺癌的表型
[0021] 前列腺癌的表型在不同患者中各不相同。更具体地，在不同的前列腺癌患者个 体中，表现出异质性的细胞形态、生长率、对雄激素和雄激素药理阻滞剂的反应性以及不 同的转移能力。每一个前列腺癌具有其独特的涉及多步骤的发展进程，该多步骤包括 从局部肿瘤发展到侵袭性癌症再发展到转移瘤的进程。如同在其他癌症中所见的，前 列腺癌的进程可能通过以下事件而发展，这些事件包括例如肿瘤抑制子、细胞循环和凋 亡调控子、参与代谢和应急反应的蛋白质以及转移相关分子等的细胞调控子的功能缺 失（Abate-Shen 等 Polypeptides Dev.14 (19):2410-34,2000 ;Ciocca 等 Cell Stress ChaperoneslO(2):86-03, 2005) 〇
[0022]目前，卫生主管部门并不普遍推荐使用PSA检测进行前列腺癌的普遍筛选。其担 忧在于，根据被筛选的结果，一些男性可能被诊断为前列腺癌并且以高额的医疗系统的花 费进行不必要的治疗，以及使患者面临例如失禁或阳瘘等生活质量变差的风险。尽管存在 以上担忧，前列腺癌仍是新西兰、澳大利亚和北美的男性中最为普遍的癌症形式，并且是导 致癌症死亡的第二常见的原因（Jemal等CA Cancer J. Clin.，57(1) : 43-66, 2007)。在现实 中，由于国民筛选的经济费用、避免不必要的过度治疗的需求，和/或仅产生较低的或背景 PSA水平的渐进性癌症的存在，导致至少某些潜伏有危及生命的前列腺癌形式的男性，在其 癌症发展为晚期癌之前错过了治疗。对更好的诊断性检测的需求再清楚不过。
[0023] 缺乏能够将非_危及生命的癌症与潜在的危及生命的癌症进行区分的诊断性检 测，这就提出了重要的临床问题，即对患有局部前列腺癌症的患者，应该如何剧烈地进行治 疗。针对侵袭性更强的癌症进行的治疗选择是侵入性的，并且该治疗选择包括根治性前列 腺切除和/或放射治疗。目前设计有例如使用促性腺激素释放激素激动剂（如，亮丙瑞 林、戈舍瑞林等）的雄激素消除治疗方法，以减少进入前列腺的睾丸酮的量，并且该治疗方 法用于患有转移性疾病的患者、某些具有升高的PSA且选择不进行手术或放疗治疗的患 者、以及某些具有术后或放疗后升高的PSA的患者。治疗选择通常取决于前列腺癌的分 期。对于具有10年或更短的寿命预期，其活体组织检测中具有较低的格里森分数（Gleason score)并且其癌症尚未扩散到前列腺之外的男性，通常不进行治疗。对于具有较低的格里 森分数和具有前列腺-限制性癌症的更加年轻的男性，则可以进入"观察等待"期，直到其 中检测出癌症进程发展的征兆时再给予治疗。但是，这些预测性指示并不能为个体患者进 行精准地临床结果预测。
[0024] 尽管已经检测出在个体病例中可能起重要作用的一些候选基因和通路，但是与许 多癌症类型不同，在前列腺癌进程中尚未一致地检测到基因表达的特异性图谱（Tomline 等，Annu. Rev. Pathol. 1:243-71，2006)。一些研宄小组已经尝试了通过将原发癌的基 因表达与正常前列腺组织进行比较，从而对前列腺癌的发展进程进行检验。由于技术、 使用的组织样品的完整性以及前列腺癌的生物异质性方面的差异，因此这些研宄已经报 告出对于数以千计的候选基因，其仅具有中度共同序列。而且样品类型的差异对解释这 些研宄中所见的共同序列的缺乏也有贡献。例如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)的组 织使得能够方便地将肿瘤与邻近组织进行比较，但是许多cDNA微阵列研宄已经使用了 急冻组织进行研宄（Bibikova 等，Genomics 89:666-72, 2007 ;van't Veer 等，Nature 415:530-6, 2002)。此外，一些研宄已经包含了将事故受害者捐赠者作为对照，从而克 服潜在的场效应（Aryee 等，Sci Transl Med5，169ral02013;Chandran 等 BMC Cancer ，5:45doi: 10. 1186/1471-2407-5-45,2005)。但是，已经出现了通过实验显示其在前列 腺肿瘤发生中可能扮演角色的少数基因，这些少数基因包括丝氨酸蛋白酶（HPN ;Rhodes 等，Cancer Res. 62:4427-33, 2002)、a -甲基酰基-辅酶 A 消旋酶（AMACR ;Rubin 等，JAMA 287:1662-70, 2002, Lin 等 Biosensors 2:377-387, 2012)、Zeste 同源 2 增强剂（EZH2 ; Varambally 等 Nature, 419:624-9, 2002)、L-多巴脱羧酶（DDC ;Koutalellis 等 BJU In ternational, 110: E267-E273, 2012)以及前-梯度蛋白 2 (AGR2 ;Hu 等 Carcinogenesis 33:1178-1186, 2012)〇
[0025] 最近，使用通过微阵列和RNA-seq技术从基因表达图谱中得到的数据的生物信 息学方法，已经生成了一系列在前列腺癌中失调的基因的清单。RNA-seq是一种基于使 用下一代测序方法计算RNA转录本的技术。但是，由于其不同的试验方法，这些研宄已 经显不出少量共有基因，（Aryee 等 Sci Transl Med5, 169ral0, 2013 ;Chandran 等 BMC Cancer, 5:1471-24072005 ;Pflueger 等 Genome Res 21:56-67, 2011 ;Prensner 等 Nature Biotechnology 29:742-749,2011 ;Shancheng Ren 等 Cell Research 22:806_821，2012)〇
[0026] 许多研宄还已经示出了可根据其基因表达