R反应剂。如必要，使用标准方法 将cDNA片段化，并且使用标准方法修复cDNA末端，其中使用了 T4DNA聚合酶将cDNA末端 的任意突出端转化为平端。通过使用Klenow片段在平端DNA片段的3'末端加入突出的腺 嘌呤（A)碱基，以辅助测序过程所需的衔接子的连接。使用标准过程将所述衔接子连接在 cDNA片段的末端，并且然后纯化该cDNA片段，以去除多余的衔接子。使用衔接子引物将该 cDNA进行扩增、纯化、变性和进一步稀释，以使得簇生成并且进行测序，例如根据Illumina Corporation的标准操作方法（208个循环的测序程序，配对末端具有指示）在HisSeq2000 上进行测序。将cDNA文库进行测序，并且确定癌症患者和健康对照中的特异性RNA生物标 志物的表达的相对频率。
[0121]方法 3
[0122] 如必要，本方法使用总RNA或去除了 rRNA的RNA。使用标准方法合成第一 cDNA 链。然后使用一组特异性寡核苷酸引物（即，对感兴趣的RNA生物标志物具有特异性的寡 核苷酸引物）直接扩增第一 cDNA链，从而使用引物限制或循环限制的PCR对特异组的PCR 扩增子进行扩增。通过清除过程纯化该cDNA以去除多余的PCR反应剂。如必要，使用标准 方法将所述cDNA片段化，并且使用标准方法修复cDNA末端，其中，该使用了 T4DNA聚合酶 使cDNA末端的任意突出端转化为平端。通过使用Klenow片段，在平端DNA片段3'末端加 入突出的腺嘌呤（A)碱基，以辅助测序过程所需的衔接子的连接。使用标准过程，将所述衔 接子连接在cDNA片段的末端，并且纯化cDNA以去除多余的衔接子。然后使用衔接子引物 对该cDNA进行扩增并纯化。如必要，该cDNA可通过使用标准方法的凝胶电泳进行尺寸选 择。将cDNA文库进行测序，并且确定癌症患者和健康对照中的特异性RNA生物标志物的表 达的相对频率。
[0123]方法 4
[0124] 方法4与方法3的不同在于，下一代测序所必需的所有序列均通过一或两步PCR 扩增进行了合并。
[0125] 本方法中可选的第一步骤是，如必要，使用工业提供的试剂盒去除总RNA中的 rRNA。然后使用标准方法合成第一 cDNA链。使用一组也包含了下一代测序（NGS)引物位点 的特异性寡核苷酸引物（即，对感兴趣的RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物），并 使用引物限制或循环限制的PCR直接扩增该第一 cDNA链。然后通过清除过程纯化该cDNA 以去除多余的PCR反应剂，以及如必要，用其他组引物以进一步增加NGS所需的位点，并使 用引物限制或循环限制PCR对该cDNA再次进行扩增。然后将该cDNA进行纯化以去除多余 的PCR反应剂并且，如必要，使用衔接子引物对该cDNA再次进行扩增并且纯化。使用衔接 子引物对该cDNA进行扩增、纯化、变性和进一步稀释，以使得簇生成并进行测序，例如根据 Illumina Corporation的标准操作方法（208个循环的测序程序，配对末端具有指示）在 HisSeq2000上进行测序。将cDNA文库进行测序，并且确定癌症患者和健康对照中的特异性 RNA生物标志物的表达的相对频率。
[0126] 前列腺癌牛物标志物的鉴宙
[0127] 使用注释（annotation)方法和在NCBI数据库的GSE6919和GSE38241数据集中 的公众可获得的RNA表达图谱数据的分析对RNA的生物标志物进行选择，使用该数据库进 行分析的原因在于这些数据集还包括了来自无癌症的捐赠者的数据。以下表1显示的生物 标志物是指在患有前列腺癌的客体中鉴定为过表达的一个特殊的集合。类似地，表2中显 示的生物标志物是在患有前列腺癌的客体中鉴定为低表达的第二个RNA生物标志物的特 殊组合。
[0128] 由University of Pittsburgh开发的NCBI数据库GSE6919,其包括了来自三个 △打71^壮11芯片卬954、冊58、冊5〇的数据，代表了超过36,000个报告基因。该数据已经 由 Chandran 等（BMC Cancer 2005, 5:45 ;BMC Cancer 2007, 9:64)，和 Yu 等（J Clin Oncol 2004,22:2790-2799)进行了分析，其包含来自超过200位个体前列腺肿瘤样品，以及结合 了邻近的"正常的"或"健康的"组织，或来自认为不患有前列腺癌的个体的前列腺组织的 RNA图谱。
[0129] 表1 :在前列腺癌患者中具有增加的表汰7k平的RNA牛物标志物
[0130]
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【主权项】
1. 一种检测客体中病症存在和/或监视客体中疾病发展进程的方法，包括如下步骤： (a) 确定从客体中取得的生物样品中的至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率， 其中使用RNA测序确定表达的频率；和 (b) 将所述生物样品中的至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率与规定的阈值进 行比较，其中，增加的或减少的生物样品中的至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率， 其指示客体中病症的存在和/或病症的发展进程。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括如下步骤： (a) 确定生物样品中多种RNA生物标志物的表达的相对频率；和 (b) 将所述生物样品中多种RNA生物标志物的表达的相对频率与规定的阈值进行比 较，其中，增加的或减少的生物样品中的至少两种RNA生物标志物的表达的相对频率，其指 示客体中病症的存在。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率 通过以下步骤进行确定： (a) 从生物样品中分离总RNA; (b) 使用对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的第一寡核苷酸引物，从总RNA中 生成第一cDNA链； (c) 合成第二cDNA链以提供双链cDNA; (d) 在所述双链cDNA中添加至少一种测序衔接子； (e) 扩增所述双链cDNA以提供cDNA文库； (f) 对所述cDNA文库进行测序，并确定所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频 率。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物从由SEQIDNO:76-223和 293-326组成的组中选择。
5. 根据权利要求3所述的方法，在步骤（b)之后和步骤（d)之前进一步包括以下步骤： 通过使用对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物对的聚合酶链式反 应，来扩增该双链cDNA。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中从由SEQIDNO:76-223和293-326组成的组中 选择至少一种所述寡核苷酸引物对。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率 通过以下步骤进行确定： (a) 从生物样品中分离总RNA; (b) 制备第一cDNA链以提供单链cDNA; (c) 通过使用了对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物对的聚合 酶链式反应，来扩增该单链cDNA，以提供经过扩增的双链cDNA; (d) 在所述经过扩增的双链cDNA中添加至少一种测序衔接子； (e) 使用对所述至少一种测序衔接子具有特异性的引物对所述经过扩增的双链cDNA 进一步扩增，以提供cDNA文库； (f) 对所述cDNA文库进行测序，确定所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中从由SEQIDNO:76-223和293-326组成的组中 选择所述寡核苷酸引物对的至少一个成员。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病症是癌症。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述病症是前列腺癌，所述至少一种RNA生物标 志物包含对应于从由SEQIDNO:1-75和235-287组成的组中选择的DNA序列的RNA序列。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中从由尿液、血液、血清、细胞系、外周血单核细胞、 活体检测组织以及前列腺切除组织构成的组中选择所述生物样品。
12. -种监视客体中的病症的发展进程的方法，包括以下步骤： 确定在第一时间点从客体中取得的生物样品中至少一种RNA生物标志物的表达的相 对频率，并确定在随后的第二时间点从客体中取得的生物样品中该至少一种RNA生物标志 物的表达的相对频率，其中所述表达的相对频率使用RNA测序进行确定；和 (b)将所述生物样品中至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率与规定的阈值进 行比较，其中与在第一时间点相比，在第二时间点增加或减少的生物样品中的至少一种RNA 生物标志物的表达的相对频率，其指示客体中病症的发展进程。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频 率通过以下步骤进行确定： (a) 从生物样品中分离总RNA; (b) 使用对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的第一寡核苷酸引物，从总RNA中 生成第一cDNA链； (c) 合成第二cDNA链以提供双链cDNA; (d) 在所述双链cDNA中添加至少一种测序衔接子； (e) 扩增所述双链cDNA以提供cDNA文库； (f) 对所述cDNA文库进行测序，并确定所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频 率。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中从由SEQIDNO:76-223和293-326组成的组 中选择所述第一寡核苷酸引物。
15. 根据权利要求13所述的方法，在步骤（b)之后和步骤（d)之前进一步包括如下步 骤：通过使用对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物对的聚合酶链式 反应，来扩增所述双链cDNA。
16. 根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频 率通过以下步骤进行确定： (a) 从生物样品中分离总RNA; (b) 制备第一cDNA链以提供单链cDNA; (c) 通过使用对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物对的聚合酶 链式反应，来扩增所述单链cDNA，以提供扩增的双链cDNA; (d) 在所述扩增的双链cDNA中添加至少一种测序衔接子； (e) 使用对所述测序衔接子具有特异性的引物扩增所述双链cDNA，以提供cDNA文库； (f) 对所述cDNA文库进行测序，并确定所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频 率。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中从由SEQIDNO:76-223和293-326组成的组 中选择所述寡核苷酸引物对的至少一个成员。
18. 根据权利要求12所述的方法，其中所述病症是癌症。
19. 根据权利要求12所述的方法，其中所述病症是前列腺癌，所述至少一种RNA生物标 志物包含对应于从由SEQIDNO:1-75和235-287组成的组中选择的DNA序列的RNA序列。
20. 根据权利要求12所述的方法，其中从由尿液、血液、血清、细胞系、外周血单核细 胞、活体检测组织以及前列腺切除组织组成的组中选择所述生物样品。
21. -种寡核苷酸引物，其包含从由SEQIDNO:76-232和293-326组成的组中选择的 序列，其中所述寡核苷酸引物的长度小于或等于30个核苷酸。
22. -种寡核苷酸引物，其由选自SEQIDNO:76-232和293-326所组成的组选择的序 列构成。
【专利摘要】本发明提供了用于诊断客体中的例如前列腺癌的病症的存在的方法，在该方法中包括：使用RNA-Seq技术检测从客体获得的生物学样品中的RNA生物标志物的表达的相对频率，并将表达的相对水平与规定的阈值水平进行比较。高于所述规定的阈值水平的至少两种RNA生物标志物的表达水平，其指示客体中前列腺癌的存在。在所述方法中，在RNA-Seq操作方法的一点中使用至少一种基因-特异性引物，以进行相关的转录本的向测序。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104781415
【申请号】CN201380044811
【发明人】詹姆斯·道格拉斯·沃特森, 克莱尔·埃尔顿, 大卫·雷克斯·马斯格雷夫
【申请人】卡尔德拉健康有限责任公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年6月28日
【公告号】CA2877864A1, EP2867376A1, US20140005058, WO2014003580A1