件可从NCBI匿名的FTP服务器获得，以及可从美国生物技术信息中 心（NCBI)、美国国家医学图书馆（National Library of Medicine)，38A 楼，8N805 房间， Bethesda，MD20894 获得。BLASTN算法 Version 2. 0? 6 [9 月-10-1998]和 Version 2. 0? 11 [1 月-20-2000]，其设置为文档所示的默认参数并按算法进行分布，该算法优选地用于根据本 发明所述的变体的确定。包括BLASTN算法的BLAST家族算法的使用，在NCBI网站以及在 出版物 Altschul,等，"Gapped BLAST and PSI_BLAST:a new generation of protein database search programs, "Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997 中进行了阐述。 [0094] 通常变体序列仅通过保守替换、删除或修饰而与特异地鉴定的序列不同。本文中 所使用的与氨基酸序列相关的，"保守替换"是指其一个氨基酸被具有相似特征的其它氨 基酸替换，以使得肽化学领域的技术人员能够预期其多肽的二级结构和亲水性基本没有改 变。总之，以下一组氨基酸体现了保守性改变：（1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨 酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；（2)半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；（3)缬氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)赖氨酸、精氨酸、组氨酸；和（5)苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。变体可能还，或可选地，包含其它包括对抗原性质、多肽的二 级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸的删除或添加等的修饰。例如，多肽可能在蛋白的N 末端与信号（前导）序列相连，该蛋白共翻译或后翻译地指导蛋白的转移。该多肽还可能 与连接子或其它序列相结合，从而方便了多肽（如多-His)的合成、纯化或鉴定，或以增强 多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区域相结合。
[0095] 在另一个实施方案中，变体多肽由在严格条件下与公开的多核苷酸杂交的多核 苷酸序列进行编码。用来确定互补性的严格杂交条件包括，小于约1M，更通常地小于约 500mM，以及优选地小于约200mM的盐条件。杂交温度可以低至5°C，但通常高于约22°C，更 优选地高于约30°C，以及最优选地高于37°C。较长的DNA片段可能需要较高的杂交温度从 而能够特异性杂交。既然严格性杂交可能受例如探针组合物、有机溶剂的存在和碱基误配 程度等其它因子的影响，那么将参数的组合进行测量比使用任意单一参数进行完全测量更 为重要。"严格条件"的一个实例是，在6X SSC，0. 2%SDS的溶液中预洗；在65°C，6X SSC， 0. 2% SDS溶液中过夜杂交；然后在65°C，IX SSC，0. 1% SDS溶液中洗两次，每次30分钟， 以及在65°C，0. 2X SSC，0. 1% SDS溶液中洗两次，每次30分钟。
[0096] 生物样品中的一种或多种RNA生物标志物的表达水平能够使用例如对RNA生物标 志物具有特异性的一种或多种寡核苷酸进行确定。在一个方法中，本文所述的一种或多种 RNA生物标志物的表达水平通过以下步骤进行确定：首先从客体中收集尿液，然后进行DRE 检测，或通过bicycle或exocycle进行前列腺按摩从而确定。从尿液样品中分离RNA，并且 如下所述的使用修饰的RNA-seq技术结合对感兴趣的RNA生物标志物具有特异性的寡核苷 酸，来对RNA生物标志物的表达频率进行确定。
[0097] 在其他实施方案中，在Southern杂交、原位杂交、或实时定量PCR扩增（qRT-PCR) 中使用寡核苷酸，能够检测与本发明所述的对应于前列腺癌生物标志物的mRNA水平。能够 有效地用于该测定的固相底物、或载体为本领域技术人员所公知，其包括但不限于例如硝 化纤维素膜、尼龙膜、聚二氟乙烯、聚酯纤维膜、醋酸纤维素膜、混合的纤维素酯和聚碳酸酯 等构建的微孔膜。合适的微孔膜包括例如美国专利申请公开号US2010/0093557A1中所述 的膜。用于进行该测定的方法为本领域技术人员所公知。
[0098] 本发明方法中使用的寡核苷酸通常是例如合成的反义分子或cDNA片段的单链分 子，并且该寡核苷酸的长度是例如，6-60nt、15-30nt或20-25nt。
[0099] 对本发明公开的多核苷酸、或RNA、生物标志物具有特异性的寡核苷酸使用了本领 域技术人员所公知的技术进行制备。例如，可以使用已知的计算机算法设计寡核苷酸，以鉴 定对多核苷酸独特的、具有在适合杂交的范围内的GC内容、以及缺少可能干扰杂交的预测 的二级结构的确定长度的寡核苷酸。可以使用本领域公知的方法合成寡核苷酸。在具体的 实施方案中，本发明方法中使用的寡核苷酸和组合物从由SEQ ID N0:76-223和293-326构 成的组中选择。
[0100] 为检测RNA表达水平中所涉及的变化，保证足够的标准化是至关重要的。相应地， 在例如本文所述的调整的RNA-seq技术、实时定量PCR或小规模寡核苷酸微阵列的测试中， 使用了至少一个表达标准。能够在这些方法中使用的表达标准包括但不限于以下表3列举 的那些标准。
[0101] 本发明进一步提供了使用本文所述的对多种前列腺癌的RNA生物标志物具有特 异性的多个寡核苷酸的方法。
[0102] 以下实施例旨在说明而非限制本发明。
【具体实施方式】
[0103] 材料和方法
[0104] RNA 提取
[0105] a)细朐系
[0106] 使用 ZYMO Direct-Zol?试剂盒（Ngaio Diagnostics Ltd.)按照制造商说明书 从培养细胞中收获的LNCaP和A549细胞系中分离RNA，并且将其储存在Trizol中。使 用 Agilent BioAnalyser 和 Agilent RNA 6000 纳米分析操作测定 RNA 的质量。LNCaP 和A549RNA分别具有9. 5和9. 8的RIN值。还通过NanoDrop2000分光光度计（Thermo Scientific)对检测该RNA，并且通过Qubit? 2.0焚光测定计（Life Technologies)确定其 浓度。
[0107] b)FFPE前列腺切除组织
[0108] 由临床组织病理学家对来自客体的组织学切块进行检查，并且对肿瘤和视为"正 常"的组织学相邻区域进行鉴定。然后切除了这些部分并放置于石蜡膜上。然后使用Qiagen RNeasyFFPE试剂盒（Cat No: 74404, 73504)将约15个新鲜切割的厚度为10微米的部分 进行处理。在所有去石蜡步骤的提取中所使用的方法是来自Cat no :74404试剂盒的原始 方法，并且按照制造商说明书进行该操作的其余部分。用NanoDrop检测该RNA，并且通过 Qubil.? 2.0焚光测定计（Life Technologies)确定其浓度。
[0109] c)尿液
[0110] 通过使用4°C下，1000g，5分钟离心的细胞材料沉淀，从来自捐赠者的一种或多种 分离的新鲜尿液样品中分离RNA。将尿液倒出并且将细胞颗粒重悬于1. 8ml冰制冷的含有 2. 5%小牛血清的IX PBS中（Invitrogen)。将细胞悬液转移至2ml Eppendorf试管中，并 且通过4°C下，400g，5分钟离心收集该细胞材料。去除上清液（保留约50 y 1)，并且将细胞 颗粒重悬于1. 8ml冰制冷的含有2. 5%小牛血清的IX PBS中（Invitrogen)。通过4°C下， 400g，5分钟离心再次收集细胞。去除上清液（保留约50 y 1)，并且将细胞颗粒重悬于1. 8ml 冰制冷的含有2. 5%小牛血清的IX PBS中（Invitrogen)。通过4°C下，400g，5分钟离心收 集细胞，并且去除几乎1〇〇y 1的上清液。将细胞重悬于余留的1〇〇y 1上清液中，并且取 8 y 1用于显微镜分析。添加总量为300 y 1的Trizol LS (Invitrogen)和5 y g的大肠杆菌 5S rRNA，并且将细胞悬液在-80°C储存。使用Direct-Zol?试剂盒的ZYM0或Invitrogen 所述的方法提取RNA，并且使用Qiagen RNeasy?离心柱进一步纯化该RNA。使用前将RNA 在_80°C储存。
[0111] cDNA制各
[0112] 从来自细胞系、活体检测组织或尿液提取物的约1-1. 5ug的总RNA中生成cDNA，其 中使用Superscript?VIL0? cDNA合成试剂盒（Life Technologies)用随机引物生成第一 cDNA链，或者使用对RNA生物标志物具有特异性引物生成第一 cDNA链。使用前将cDNA的 制备物在_80°C进行储存，并且然后在qPCR之前在蒸馏水中稀释1/5。
[0113]aRT-PCR 方法
[0114] 使用对RNA生物标志物具有特异性的引物，从细胞系_、活体检测组织-或尿 液-获取的cDNA中进行实时SYBR green PCR定量，其中使用了 Roche Lightcycler 480 以及使用标准操作方法，以确定扩增的特异性和效率。通过比较循环阈值（Ct值：SYBR绿 色荧光信号在扩增曲线的指数生长期内以越过超过本底水平的阈值所需的PCR循环数）确 定每一个检测的样品中的标记基因的相对量。然后进行30个循环的RT-PCR反应，将扩增 子在2%琼脂凝胶中进行电泳，并且使用Applied Biosystems 3130x1 DNA测序仪进行标准 Sanger化学测序。
[0115]RNA牛物标志物扩增子的牛成
[0116] 使用在以下所述的四个方法的一或多个方法中分离的RNA确定特异性RNA生物 标志物的表达的相对频率。这些方法的每一个均包括常规RNA-seq技术的至少一种改 进。常规RNA-seq技术是本领域技术人员公知的，并且在例如Wang等（Nat. Rev. Genet. (2009) 10:57-63)和Marguerat 和 Bahler (Cell. Mol. Life Sci. (2010)67:569-579)的文章 中进行了描述。
[0117]方法 1
[0118] 在第一个方法中，在第一 cDNA链生成的过程中使用序列特异性引发。在本方法 中，可选的第一步骤是，如果需要，使用工业提供的试剂盒去除总RNA中的rRNA。使用工业 提供的第一链cDNA试剂盒，将总RNA或去除了 rRNA的总RNA与至少一条链特异性寡核苷 酸引物（即，对感兴趣的RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物）相结合，并且按照制 造商的操作生成第一 cDNA链。然后使用标准技术以无偏差的方式合成第二cDNA链。如果 必要，使用标准方法将生成的双链cDNA片段化，并且使用标准方法修复cDNA末端，其中使 用T4DNA聚合酶将cDNA末端的任意突出端转化为平端。通过使用Klenow片段在平端DNA 片段的3'末端加入突出的腺嘌呤（A)碱基，以辅助测序过程所需的衔接子的连接。使用标 准过程将所述衔接子连接在cDNA片段的末端，并且然后在凝胶上跑cDNA片段，以进行纯化 以及去除多余的衔接子。使用衔接子引物对cDNA进行扩增、纯化、变性和进一步稀释以使 得簇生成并进行测序，例如根据Illumina Corporation的标准操作方法（208个循环的测 序程序，配对末端具有指示）、在HiSSeq2(KK)上进行测序。将cDNA文库进行测序，以及确定 癌症患者和健康对照中的特异性RNA生物标志物的表达的相对频率。
[0119]方法 2
[0120] 如在方法1中那样，在第一 cDNA链生成过程中使用序列特异性引发。这是按照制 造商的操作方法，通过使用工业提供的第一 cDNA链试剂盒和至少一种链特异性寡核苷酸 引物，在总RNA(或如必要，去除了 rRNA的总RNA)中生成第一 cDNA链而实现。第二cDNA 链可使用标准技术以无偏差的方式进行制备，或可使用一组特异性寡核苷酸引物（即，对 感兴趣的RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物）直接进行扩增，从而通过引物限制 或循环限制的PCR对特定组的PCR扩增子进行扩增。在优选的实施方案中，用来生成第一 cDNA链的寡核苷酸引物可以与用来扩增双链cDNA的寡核苷酸引物对中的一个相同。然后 通过清除（cleanup)过程纯化该cDNA以去除多余的PC