用于靶向k63连接的多聚遍在蛋白的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于靶向k63连接的多聚遍在蛋白的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗多聚遍在蛋白(polyubiquitin)抗体领域，更具体的说就是不特异 性结合单遍在蛋白(monoubiquitin)的及能区分具有不同异肽键(isop印tide linkage) 的多聚遍在蛋白的抗多聚遍在蛋白抗体。
背景技术：
遍在蛋白(ubiquitin)是一种在诸多细胞途径中具有重要调节作用的小蛋白质。 这些作用中最为人所共知的是遍在蛋白在蛋白降解中的作用，在此遍在蛋白与靶蛋白共价 连接，使得靶蛋白为26S蛋白酶体识别并受之破坏(参见Wilkinson，Semin. Cell Devel. Biol. 11(3) 141-148 (2000))。不同信号传导途径的蛋白激酶调节也与遍在蛋白化作用 有关(参见 Sun 和 Chen, Curr. Opin. CellBiol. 16 119-126 (2004))。例如，经 I κ B 激酶 的I κ B磷酸化作用使I κ B的遍在蛋白化作用得以可能，并随后通过26S蛋白酶体而降 解；由于IkB是NFkB的抑制剂，因此I κ B的降解激活了 NF κ B (Ghosh和Karin，Cell 109(Suppl.) :S81-S96(2002) ；Palombella 等，Cell 78 :773_785 (1994))。遍在蛋白化作用 还介导 DNA 修复(参见 Sun 和 Chen，Curr. Opin. Cell Biol. 16 119-126 (2004))。在 DNA 损伤后，增殖细胞核抗原的(PCNA)单遍在蛋白化作用激活了不论任何DNA损伤都能合成 DNA的耐损伤聚合酶(Stelter和Ulrich，Nature 425:188-191(2003)。其它其中已知涉 及遍在蛋白化作用的生理过程包括细胞分裂、细胞生长、细胞运动和细胞凋亡/细胞死亡 (Johnson, Nat. Cell Biol. 4 :E295_E298 (2002) ；Pickart, Mol. Cell. 8 :499_504 (2001))。遍在蛋白(一种76个氨基酸的蛋白)与靶蛋白的共价连接是一种三步酶促过程 (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70 :503_533 (2001))。首先，在 ATP-依赖性反应中遍在蛋白 激活酶El形成遍在蛋白-El硫酯。在第二步中，遍在蛋白由遍在蛋白-El硫酯转移至遍 在蛋白蛋白偶联酶(E2)家族的的成员。在第三步中，在遍在蛋白蛋白连接酶(E3)的帮助 下，在遍在蛋白羧基末端和靶蛋白上赖氨酸残基的ε_氨基之间形成异肽键。称为去遍在 蛋白酶的酶类从靶蛋白上将遍在蛋白部分除去(Guterman和Glickman，Curr. Prot. P印. Sci. 5 =201-210(2004)) 0遍在蛋白的突出作用在于作为重要的调节分子，人基因组含有许 多涉及遍在蛋白化作用或去遍在蛋白化作用的不同蛋白迄今为止已鉴定了至少40种不 同的E2、500种不同的E3和80种不同的去遍在蛋白酶(Wong等，Drug. Discov. Today 8 746-754(2003))。遍在蛋白含有7 个赖氨酸残基(Lys6、Lysl 1、Lys27、Lys33、Lys29、Lys48 和Lys63)，因此遍在蛋白自身可作为靶蛋白用于遍在蛋白化作用(Peng等，Nat. Biotechnol.21 921-926 (2003) ；Pickart 禾口 Fushman， Curr.Opin.Chem. Biol. 8 610-616(2004))。遍在蛋白蛋白的遍在蛋白化作用后所产生的分子称为多聚遍在蛋白分 子，并可包含两个或更多个遍在蛋白部分。理论上，遍在蛋白的遍在蛋白化作用可在7个赖 氨酸残基中任何一个上发生(Peng等，Nat. Biotechnol. 21 :921_926 (2003))，以致存在具 有异肽键合至遍在蛋白内不同赖氨酸残基的不同种类的多聚遍在蛋白。有可能具有多于 两个遍在蛋白部分的单个多聚遍在蛋白分子可具有多于一种的赖氨酸键。已有研究表明E2酶影响一个遍在蛋白分子与另一个遍在蛋白分子之间所形成的赖氨酸键的类型(Termo 等，Genes to Cells 9:865-875(2004) ；Deng 等(2000) ；Hofmann 和 Pickart (2001))。多 聚遍在蛋白和遍在蛋白都能作为游离分子以及与靶蛋白共价连接的形式存在。像遍在蛋白一样，已在许多细胞过程中发现涉及多聚遍在蛋白，这些过程包括 细胞内运输、细胞内吞作用、基因表达/沉默、蛋白水解、激酶激活作用、翻译和DNA修复 (Hoege 等，Nature 419 135-141 (2002) ；Spence 等，Mol. Cell. Biol. 15 :1265_1273 (1995)； Hofmann和Pickart，Cell 96:645-653(1999)。然而，在相同途径中与单遍在蛋白和单 遍在蛋白化作用相比，多聚遍在蛋白和多聚遍在蛋白化作用可具有显著不同的生理学作 用。例如，当在DNA损伤后PCNA的单遍在蛋白化作用导致易错DNA聚合酶激活时，在 与单遍在蛋白化作用相同残基处的PCNA的多聚遍在蛋白化作用则被观察到能导致易 错 DNA 修复的激活(Stelter 和 Ulrich，Nature 425 188-191 (2003) ；Hoege 等，Nature 419:135-141(2002) ；Spence 等，Mol. Cell. Biol. 15 :1265_1273 (1995)；以及 Hofmann 和 Pickart, Cell 96 :645_653(1999))。甚至连具有不同赖氨酸键的多聚遍在蛋白都显示具有不同的生理学作用。得 到最多研究的两种多聚遍在蛋白是Lys48连接的和Lys63连接的多聚遍在蛋白，对这两 种多聚遍在蛋白的结构研究提出不同赖氨酸连接的多聚遍在蛋白可采用明显不同的构 象，由此容许与所选择的结合伴侣具有不同的相互作用(Termo等，Genes to Cells 9 865-875 (2004))。虽然通过Lys48连接的多聚遍在蛋白的共价修饰通常标志着靶蛋白能 蛋白水解降解，但是存在着一些证据证明Lys48连接的多聚遍在蛋白还可通过非蛋白水 解方式调节某些蛋白(Chau 等，Science 243 1576-1583 (1989) ；Finley 等，Mol. Cell. Biol. 14 5501-5509(1994) ；Flick 等，Nat. Cell. Biol. 6 :634_641 (2004))。与此相反， Lys63连接的多聚遍在蛋白已与多种非蛋白水解的细胞内途径相关，包括DNA修复(表 达K63R-遍在蛋白的酵母细胞是DNA修复缺陷型的)、激酶激活作用、细胞内运输和翻 译(Pickart 禾口 Fushman，Curr.Opin. Chem. Biol. 8 610-616(2004) ；Hicke 禾口 Dunn，Annu Rev. Cell Dev. Biol. 19 141-172 (2003) ；Spece 等，Mol. Cell Biol. 15 1265-1273 (1995)； Ulrich, Eukaryot. Cell 1 1-10(2002) ；Spence 等，Celll02 67-76(2000) ；Seibenhener 等，Mol. Cell. Biol. 24(18) =8055-8068 (2004)) 在一个特定的例子中，以不依赖于蛋 白酶体的方式通过parkin，synphilin-1为K63连接的多聚遍在蛋白所正常地遍在蛋白 化，但synphilin-Ι亦可为K48连接的多聚遍在蛋白的遍在蛋白化作用所靶向破坏(Lim 等，J. Neurosci. 25(8) :2002_9 (2005))。一项对患有帕金森氏病的受试者的分析显示 synphilin-Ι的K63-多聚遍在蛋白化作用可能涉及与疾病相关的Lewy包涵小体(Lewy body inclusion)的形成(Lim 等，J. Neurosci. 25 (8) :2002_9 (2005))。其它的赖氨酸连接的多聚遍在蛋白还未得到详尽、广泛的研究，原因在于它们之 间难以区分。迄今为止，研究依赖于表达其中一个或多个赖氨酸已除去的经过诱变的遍在 蛋白的细胞、酶促合成的具有特定键合的多聚遍在蛋白或用于区分一种类型和另一种类型 的多聚遍在蛋白的诸如质谱法的技术。对于分析特定赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的正常生 理学行为来说，上述那些方法中任何一种都不适合或麻烦重重。虽然存在与单遍在蛋白相 比特异于多聚遍在蛋白的抗体(Fujimoro等，FEBS Lett. 349 173-180 (1994))，但至今为 止仍然没有能区分具有不同赖氨酸键的多聚遍在蛋白的抗体。
并不令人吃惊的是，由于已知它们在诸多细胞过程中的重要作用，因此遍 在蛋白和多聚遍在蛋白还与许多疾病有关(参见Argiles，Ubiquitin andDisease， R. G. Landes (1998))。在肌肉萎缩中观察到遍在蛋白失调(Mitch和Goldberg，New Engl. J. Med. 335 1897-905 (1996) ；Bodine 等，Science 294:1704-1708(2001))。 已 将一些遗传性疾病与异常的遍在蛋白活性相关联，包括囊性纤维化(Ward等，Cell 83 121-127 (1995)), Angelman' s 综合征(Kishino 等，Nature Genet. 15 70-73 (1997))和利 德尔综合征(Staub等，EMBO J 16:6325-6336(1997))。在免疫和炎症应答中遍在蛋白还 起作用；例如，已发现细胞外遍在蛋白作为一种细胞因子抑制了 TNF α对外周血单核细胞 中内毒素的应答，并调节内毒素低反应性(Majetschak等，Blood 101 1882-1890 (2003)； Ciechanover, EMBO J 17:7151-7160(1998))。同样地，已发现在人血清中具有遍在蛋白和 多聚遍在蛋白，在具有寄生虫病和变应性疾病的患者血清中观察到这两种分子具有较高的 水平(Takada 等，Clinical Chem. 43 1188-1195 (1997))。一些遍在蛋白介导的途径的失调还涉及癌症(Spataro等，Br. J. Cancer77 448-55(1998) ；Beckmann 等，Hum. Mutat. 25 :507_12 (2005))。例如，异 二聚遍在蛋白 连接酶BRCAI-BARDl中的突变就与乳腺癌相关(Hashizume等，J. Biol. Chem. 276 14537-40 (2001))，破坏Myc要被遍在蛋白途径所降解的能力的突变激活了 c-Myc的致癌 潜力(Salghetti等，EMBO J. 18 :717_726 (1999))，并且转化的v-Jun无法被遍在蛋白化 并降解为其非致癌的相关物c-Jim，由此导致不受控制的生长(Ciechanover，EMBO J. 17 7151-7160(1998) ；Trier 等，Cell 78:787-798(1994))。在上下文的神经系统疾病中已详尽地研究了遍在蛋白和多聚遍在蛋白(Chung 等，TINS 24(llSuppl.)S7-S14(2001))。积聚在亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、朊病 毒脑病、皮克病、Lewy小体病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病中的包涵物、小体以及神经 原纤维缠结对单遍在蛋白和/或多聚遍在蛋白是免疫染色阳性(Alves-Rodrigues等， Trends Neurosci. 21 516-520(1998) ；Cammarata φ, Neurosci Lett. 156 96-98(1993)； Kalchman 等，J. Biol. Chem. 271 19385-94 (1996) ；Holmberg 等，Human Mol. Genet. 7 913-918 (1998) ；Yedidia EMBO J. 20 5383-91 (2001) ；Mori Science 235 1641-44(1987) ；Leigh 等，Acta Neuropathol. (Berl.)79 :61_72(1989)；和 Kuzuhara 等，Acta Neuropathologica 75:345-353(1988))。虽然已将一些类型的帕金森氏病与 遍在蛋白羧基末端水解酶Ll (UCH-Ll)基因、去遍在蛋白酶中的突变相关联(Leroy等， Nature 395 :451_452 (1998))，但是其它类型的帕金森氏病却与Parkin (—种已知与遍在 蛋白偶联酶UbcH7相互作用并遍在蛋白化synphilin-Ι的E2-依赖性遍在蛋白蛋白连接 酶)中失活突变相关联(Shimura 等，NatureGenet. 25 302-305 (2000)，Zhang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 13354-13359 (2000) ；Lim 等，J. Neurosci. 25 (8) :2002_9 (2005))。这 两种类型的突变都导致异常的蛋白水解加工和不适当的蛋白积聚(参见McNaught等， Nature Rev. Neurosci. 2 :589_594(2001))。还已发现UCH-L1突变与亨廷顿病是孤立的 (Naze等，Neurosci. Lett. 328 1 1-4 (2002)) 已鉴定了阿尔茨海默氏病人脑中的遍在 蛋白突变体，其非常有效地掺入多聚遍在蛋白链中，但一旦形成就很难被去遍在蛋白化， 潜在地导致正常细胞蛋白水解加工系统的突出抑制(Lam等，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 9902-9906(2000))ο
显然不但拥有能区分具有不同赖氨酸键的多聚遍在蛋白的组合物和方法，而且拥 有能有效地靶向并调节遍在蛋白和多聚遍在蛋白介导的途径的组合物和方法应当是有益 的。在此提供的本发明涉及上述组合物和方法。所有在此引用的包括专利申请和出版物在内的参考文献以其全文并入作为参考。发明概述本发明提供能够结合多聚遍在蛋白和/或调节与多聚遍在蛋白有关的生物学活 性的新抗体。在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分离 的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体不特异性结合K48连接的多聚遍在蛋白或单遍在蛋 白。一方面，本发明提供一种分离的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO 59-110 和 112 任一之 HVR-H2 和 SEQID NO :7_58 和 111 任一之 HVR-L2 的高变(HVR)序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在 蛋白或单遍在蛋白，其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个HVR-H2序列，其中HVR-H2包 含氨基酸序列a bcdefghijklmno p(SEQ ID NO :221)，且其中氨基酸a选自氨 基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是异亮氨酸；氨基酸c选自氨基酸丝氨酸、苏氨 酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪氨酸；氨基酸f 选自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和组氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基酸h选自氨基酸 丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是苏氨酸；氨基酸j是丝氨酸；氨基 酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是丝氨酸；氨基酸ο是 缬氨酸；而氨基酸P是赖氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合Κ63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体不特异性结合Κ48连接的多聚遍在蛋白或单遍在蛋 白，且其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID Ν0:59-110和112之HVR-H2 序列的HVR-H2序列。一方面，该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID NO :60、63、 和66之HVR-H2序列的HVR-H2序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合Κ63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合Κ48连接的多聚遍在 蛋白或单遍在蛋白，且其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个HVR-L2序列，其中HVR-L2 包含氨基酸序列q r s t u ν w x(SEQID NO :222)，其中氨基酸q选自氨基酸酪氨酸和苯丙 氨酸；氨基酸r选自氨基酸丙氨酸和丝氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t选自氨基酸丝氨 酸、精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是丝氨酸；氨基酸ν是 亮氨酸；氨基酸w是酪氨酸；而氨基酸χ是丝氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在 蛋白或单遍在蛋白，且其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID N0:7-58和 111之HVR-L2序列的HVR-L2序列。一方面，该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID NO :8、11、和 14 之 HVR-L2 序列的 HVR-L2 序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分
9离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在 蛋白或单遍在蛋白，其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自HVR-H2和HVR-L2的序 列，其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a b cd e fg h i j k 1 m η ο ρ (SEQ ID Ν0:221)，其中 氨基酸a选自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是异亮氨酸；氨基酸c选自氨基 酸丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪 氨酸；氨基酸f选自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和组氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基 酸h选自氨基酸丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是苏氨酸；氨基酸j 是丝氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是丝氨 酸；氨基酸ο是缬氨酸；而氨基酸ρ是赖氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r s t u ν w χ (SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q选自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r选自氨基酸丙 氨酸和丝氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t选自氨基酸丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、 丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是丝氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是酪氨酸； 而氨基酸χ是丝氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍 在蛋白或单遍在蛋白，其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个HVR-H2序列和至少一个 HVR-L2 序列，其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a bcdefghijklmno ρ (SEQ ID NO: 221)，其中氨基酸a选自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是异亮氨酸；氨基酸c 选自氨基酸丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基 酸e是酪氨酸；氨基酸f选自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和组氨酸；氨基酸g是甘氨 酸；氨基酸h选自氨基酸丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是苏氨酸； 氨基酸j是丝氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸 η是丝氨酸；氨基酸ο是缬氨酸；而氨基酸P是赖氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r stuvw χ (SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q选自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r选自 氨基酸丙氨酸和丝氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t选自氨基酸丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是丝氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是 酪氨酸；而氨基酸χ是丝氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在 蛋白或单遍在蛋白，其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID N0:59-110和 112之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一个选自SEQ ID NO :7_58和111之HVR-L2序列 的HVR-L2序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在 蛋白或单遍在蛋白，其中该抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID N0:60、63、和66 之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一个选自SEQ ID NO :8、11、和14之HVR-L2序列的 HVR-L2 序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分 离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在蛋白或单遍在蛋白，其中该抗体或抗原结合片段包含选自表B中Apu3. A8-Apu3. HlO任一所 列HVR-H2和HVR-L2氨基酸序列的HVR氨基酸序列。一方面，该HVR氨基酸序列选自表B 中 Apu3. A8、Apu3. A12、和 Apu3. B3 任一所列 HVR-H2 和 HVR-L2 氨基酸序列。一方面，任何上述抗体或抗原结合片段包含至少一个选自SEQ ID NO :5之HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4 之 HVR-L3 序列的HVR序列。另一方面，任何上述抗体或抗原结合片段包含至少两个选自SEQ ID NO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-L 1 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。另一方面，任何上述抗体或抗原结合片段包含至少三个选自 SEQ ID NO :5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO :3 之 HVR-Ll 序列 和SEQ ID N0:4之HVR-L3序列的HVR序列。另一方面，任何上述抗体或抗原结合片段包含 SEQ ID NO :5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO :3 之 HVR-Ll 序列 和 SEQ ID NO 4 之 HVR-L3 序列。一方面，任何上述抗体或抗原结合片段具有相对于亲本Fab Apu2. 16对K63连接 的多聚遍在蛋白的亲和力有改善的对K63连接的多聚遍在蛋白的亲和力。另一方面，任何 上述抗体或抗原结合片段具有小于或等于IOnM的对K63连接的多聚遍在蛋白的Kd值。在另一个实施方案中，本发明提供一种与任何上述抗体或抗原结合片段结合多聚 遍在蛋白上相同抗原决定簇的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不 特异性结合单遍在蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供一种与任何上述抗体或抗原结 合片段竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合 片段不特异性结合单遍在蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供一种结合K63连接的多聚遍在蛋白中表位的分 离的抗体或抗原结合片段。一方面，该表位包括K63连接的多聚遍在蛋白的第一遍在蛋 白亚基和第二遍在蛋白亚基二者中的残基。另一方面，该表位包括至少一个选自Glu-18、 Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61、禾口 Gln-62 的 第一遍在蛋白亚基中的残基。另一方面，该表位包括至少一个选自Leu-8、Thr-9、Glu_34、 Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74、和 Gly-75 的第 二遍在蛋白亚基中的残基。另一方面，该表位包括至少一个选自Glu-18、Pro-19、Ser-20, Asp-21、Thr-55、Leu-56, Ser-57, Asp-58、Asn-60、Ile-61、和 Gln-62 的第一遍在蛋白亚基 中的残基，和至少一个选自 Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、 Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74、和Gly-75的第二遍在蛋白亚基中的残基。另一方面， HVRH3的N端部分接触来自供体遍在蛋白的C端残基和Q40。另一方面，HVRH3的远端部分 接触K63-受体遍在蛋白的50s环。在另一个这样的方面，HVRH3的N端部分接触来自供体 遍在蛋白的C端残基72-74和Q40，而HVRH3的残基R102和Y103接触K63-受体遍在蛋白 的50s环。另一方面，供体遍在蛋白的C端残基接触抗体或抗原结合片段。在另一个这样 的方面，接触所涉及的供体遍在蛋白残基是L73和R74。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或抗原结合片段，其包含其轻 链与K63-受体遍在蛋白表面之间改善的静电相容性。一方面，该抗体或抗原结合片段包含 HVRL2第52位Arg。另一方面，该抗体或抗原结合片段包含轻链框架区第66位Arg。另一 方面，该抗体或抗原结合片段包含HVRL2第52位Arg和轻链框架区第66位Arg。
在另一个实施方案中，任何上述抗体或抗原结合片段特异性结合K63连接的多聚 遍在蛋白化的蛋白质。一方面，该抗体或抗原结合片段抑制K63连接的多聚遍在蛋白化的 蛋白质降解。另一方面，该抗体或抗原结合片段调控至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号 传导途径。另一方面，该抗体或抗原结合片段抑制至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传 导途径。另一方面，该抗体或抗原结合片段刺激至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传导 途径。在另一个实施方案中，本发明提供一种编码任何上述抗体或抗原结合片段的核酸 分子。在另一个实施方案中，本发明提供一种包含此类核酸分子的载体。在另一个实施方 案中，本发明提供一种包含此类载体的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供一种能 够生成任何上述抗体或抗原结合片段的细胞系。在另一个实施方案中，本发明提供一种生 成任何上述抗体或抗原结合片段的方法，包括在该抗体或抗原结合片段生成的条件下培养 包含编码该抗体或抗原结合片段的核酸分子的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供一种包含有效量的任何上述抗体或抗原结合片 段和药学可接受载体的组合物。一方面，该组合物包含两种或更多种上述抗体或抗原结合 片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种鉴定样品中K63连接的多聚遍在蛋白或 K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括使该样品与至少一种上述抗体或 抗原结合片段接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患者中与多聚遍在蛋白失 调有关的疾病或状况的方法，包括对该患者施用有效量的至少一种上述抗体或抗原 结合片段。一方面，该患者是哺乳动物患者。另一方面，该患者是人。另一方面，该 疾病选自癌症(cancer)、肌肉病症(muscular disorder)、遍在蛋白途径相关遗传病 症(ubi qui tin-pathway-re lated genetic disorder)、免疫 / 炎 生病症(immune/ inflammatory disorder)、禾口神经学病症(neurological disorder)。另一方面，该疾病 选自癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、白血 病(leukemia)、肌营养不良(musculardystrophy)、多发性硬化(multiple sclerosis)、 M^^M'MM'it (amyotrophiclateral sclerosis) ,MH^fi^it'M (cystic fibrosis) > Angelman 氏综合征(Angelman，s syndrome)、禾丨J 德尔综合征(Liddle syndrome)、阿尔 茨海默氏病(Alzheimer，s disease)、帕金森氏病(Parkinson，s disease)、皮克氏病 (Pick，sdisease)、禾口佩吉特氏病(Paget' s disease)。在另一个实施方案中，本发明提供依照测定怀疑含有K63连接的多聚遍在蛋白或 K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的样品中K63连接的多聚遍在蛋白或K63连接的多聚 遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括将该样品暴露于至少一种上述抗体或抗原结合片 段并测定该至少一种抗体或抗原结合片段对该样品中K63连接的多聚遍在蛋白或K63连接 的多聚遍在蛋白化的蛋白质的结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的K63连接的多聚遍在蛋白化的 蛋白质与非K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与至少一种上 述抗体或抗原结合片段接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种测定细胞中K63连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞与至少一种上述抗体或抗原结合片段接触并评估所述 接触步骤对该细胞的影响。在另一个实施方案中，本发明提供一种测定样品中K63连接的 多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该样品与至少一种上述抗体或抗原结合片 段接触并评估所述接触步骤对该样品的影响。本发明的抗体可以是任何数目的形式。例如，本发明的抗体可以是嵌合抗体、 人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体不是人抗体，例如它不是在 xenomouse (例如W096/33735中所记载的)中生成的抗体。本发明的抗体可以是全长抗体 或其片段(例如包含抗原结合构件的片段)。在另一个实施方案中，本发明提供任何上述抗体的抗原结合片段。附图简述

图1显示遍在蛋白的一级结构和某些多聚遍在蛋白异肽键的示意图。图IA显示人 遍在蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :223)，其中赖氨酸残基以粗体、带下划线的中文标示。 图IB显示在第一遍在蛋白分子的赖氨酸-48或赖氨酸-63与第二遍在蛋白分子的C端甘 氨酸残基之间形成的键的示意图。图2A-E描绘实施例4中讨论的有关分子的晶体结构。图2A描绘K63连接的双遍 在蛋白(图的上部)与Apu2. 16Fab片段(图的下部，其中轻链在左、重链在右)之间的复合 物，并且显示重链⑶R3( “H3”)接触异肽键任一侧两条遍在蛋白链。距双遍在蛋白4.2入 内的H3侧链和距H34. 2人内的遍在蛋白侧链以棍显示。以粗体标示的残基是遍在蛋白残 基，而以其它方式(非粗体)标示的残基是Fab残基。受体遍在蛋白中的K63以球体显示。 图2B描绘K63连接的(上部)和K48连接的(下部)双遍在蛋白结构的比较。在这两种 情况中，赖氨酸受体遍在蛋白在图的左边，而供体遍在蛋白在右边。与K63 二聚体(其中链 以更加延长的方式延伸)相比，K48连接的双遍在蛋白形成更加紧凑的形状，链垂直于遍在 蛋白二聚体延伸。图2C是图2A中所示Apu2. 16晶体结构叠加在Apu3. A8晶体结构上的叠 印，显示了用于创建Apu3.A8的亲和力成熟过程期间在L2(S52R)和H3 (S52T)中引入的两 处变化的位置。图2D显示Apu2. 16、Apu3.A8和一种人源化4D5变体(pdb 1FVE)的结构比 较。Apu2. 16和Apu3. A8的Fv区以管显示并叠加在人源化抗Her2抗体4D5变体的Fv区 上。在顶视图中，标记了⑶R区；在底视图中，Fv区旋转90度以显示N端。图2E描绘Apu3. A8(下部)和双遍在蛋白(上部)之间的电荷互补性。静电表面是用PyMol计算的。正电 位的区域用阴影标示；负电位的区域用阴影标示并用虚线指示。图3A-D描绘实施例1 (E)中描述的Western印迹实验的结果。图3A显示亲本抗 K63连接的多聚遍在蛋白Fab Apu2. 16对固定化的K63连接的双遍在蛋白的结合及对固 定化的K48连接的双遍在蛋白的结合的缺失。图3B显示抗K63连接的多聚遍在蛋白Fab Apu3. A8对固定化的K63连接的双遍在蛋白的结合及对固定化的K48连接的双遍在蛋白的 结合的缺失。图3C显示抗K63连接的多聚遍在蛋白Fab Apu3. A12对固定化的K63连接的 双遍在蛋白的结合及对固定化的K48连接的双遍在蛋白的结合的缺失。图3D显示抗K63 连接的多聚遍在蛋白Fab Apu3. B3对固定化的K63连接的双遍在蛋白的结合及对固定化的 K48连接的双遍在蛋白的结合的缺失。图4描绘实施例2中描述的Western印迹实验的结果。该图显示亲本Apu2. 16IgG 对固定化的K63连接的双至七遍在蛋白或固定化的K48连接的双至七遍在蛋白的弱结合。该图还显示每种亲和力成熟的抗1(63连接的多聚遍在蛋白抗体4 113]124 113.83、和 Apu3. A8对固定化的K63连接的双至七遍在蛋白的结合及对固定化的K48连接的双至七遍 在蛋白的结合的缺失。图5描绘实施例2中描述的Western印迹实验的结果。该图显示在Western印迹 形式中，虽然亲本抗K63连接的多聚遍在蛋白抗体Apu2. 16不能够检测K63连接的遍在蛋 白化的Traf6，但是亲和力成熟的抗体Apu3. A12、Apu3. B3、和Apu3. A8能够特异性检测K63 连接的遍在蛋白化的Traf6。图6A-B描绘Western印迹实验的结果，用于评估各种抗K63连接的多聚遍在蛋白 抗体自细胞溶胞物免疫沉淀K63连接的TrafO的能力，如实施例2中所描述的。亲和力成 熟的抗体Apu3. A8、Apu3. B3、和Apu3. A12比亲本抗体Apu2. 16更好地能够免疫沉淀K63连 接的多聚遍在蛋白化的Traf6。图7A-K描绘验证性质谱术实验的结果，如实施例3中所描述的。图7A描绘质谱 术实验的结果，用于验证由亲和力成熟的抗体Apu3.A8、Apu3.B3、和Apu3. A12免疫沉淀的 蛋白质主要是K63连接的遍在蛋白化的，如实施例2中所描述的。图7B显示使用这种办法 不富集K48连接，由此显示K63抗体对K63链连接的特异性。图7C-F显示自使用抗K48连 接的多聚遍在蛋白抗体Apu2. 07、抗K63连接的多聚遍在蛋白抗体Apu3.A8、或同种型对照 抗体(抗Her2)的免疫沉淀实验，接着进行质谱术分析获得的数据的棒图，该质谱术分析用 于确定免疫沉淀的遍在蛋白总量(图7C)，以及溶胞物中存在的多聚遍在蛋白连接类型(图 7D)和抗体特异性免疫沉淀物(图7E中的抗K48连接的多聚遍在蛋白；图7F中的抗K63连 接的多聚遍在蛋白)。图7G示意性描绘在体外用WT、K48R或K63R遍在蛋白实施的MuRFl 自我遍在蛋白化反应，接着用々 112.074 113^8、或同种型匹配的对照抗体免疫沉淀。圆括 号中的数字指示图7H-K中有关的道和柱。图7H显示Western印迹，包括图7G中示意性描 绘的反应。该印迹是用泛遍在蛋白抗体探查的。水平的虚线指示切出来并提交质谱术分析 的凝胶部分。图7I-K显示自实验获得的质谱术数据的棒图，该实验用于确定图7G示意性 描绘的自我遍在蛋白化反应和免疫沉淀中的多聚遍在蛋白连接。图8A示意性描绘在体内受结合至肿瘤坏死因子受体I(TNFRl)的肿瘤坏死因子 α (TNFa)刺激的信号传导途径。图8Β示意性描绘在体内受结合至IL-1R1的IL-I β刺激 的信号传导途径。图9Α显示来自免疫沉淀实验的Western印迹，用于检测RIP的遍在蛋白化状态， 如实施例3中所描述的。仅仅为了描述此图的目的，给各印迹指派1到7的连续数字，其中 最上面的印迹指派数字1、最下面的印迹指派数字7。印迹6包括用抗K48连接的IgG(用 于捕捉K48连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质)免疫沉淀的样品。印迹7包括用Apu3. A8和 Apu3. B3的1 1混合物(用于捕捉K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质)免疫沉淀的样 品。两印迹都是用抗RIP抗体染色的。印迹1-3显示对照Western印迹，用于证明RIP和 微管蛋白水平在TNF α处理期间保持相对恒定(印迹1和3)，而I κ B α水平在在TNF α处 理后降低(印迹2)。印迹4和5显示对照Western印迹，用于证明RIP在针对TNFRl的免 疫沉淀期间共沉淀(印迹4)及TNFRl水平在TNF α处理期间保持恒定(印迹5)。图9Β示 意性描绘Κ63连接的多聚遍在蛋白添加至RIP并被Α20用Κ48连接的多聚遍在蛋白替换的 细胞途径。
图10显示实施例3(B)中描述的实验结果，评估IL-I β刺激细胞后IRAKI的多 聚遍在蛋白化状态。总IRAKl、IicBa和微管蛋白水平显示于图IOA和10B。图IOC显示 Western印迹，评估被K48连接的多聚遍在蛋白(顶部小图)或K63连接的多聚遍在蛋白 (下部小图)修饰的IRAKI。图IOD显示Western印迹，指示蛋白酶抑制剂MG-132对多聚 遍在蛋白化的IRAKI降解的影响。图11描绘用单独的抗K48连接的多聚遍在蛋白抗体或抗K63连接的多聚遍在蛋 白抗体(分别为图IlA或图11D)染色或进一步包括识别20S蛋白酶体亚基的多克隆抗体 (分别为图IlB和11E)的HeLa细胞免疫荧光显微术图像，如实施例5中所描述的。箭指示 中体(mid-body)染色。在合并的图像(图IlC和11F)中，很亮的染色指示潜在的共定位， 而不太亮的染色对应于DAPI标记的核。每幅图中的棒代表50 μ m。图12A和12B和图13描绘供实施本发明中使用的例示性受体人共有框架序列，序 列标识符如下可变重链(VH)共有框架(图12A和12B)人VH 亚组 I 共有框架减 Kabat CDR (SEQ ID NO 113-116)人VH亚组I共有框架减延长的高变区(SEQ ID NO 117-128)人VH 亚组 II 共有框架减 Kabat CDR(SEQ ID NO 129-132)人VH亚组II共有框架减延长的高变区(SEQ ID NO 133-144)人VH 亚组 III 共有框架减 Kabat CDR(SEQ ID NO 145-148)人VH亚组III共有框架减延长的高变区(SEQ ID NO 149-160)人VH 受体框架减 Kabat CDR (SEQ ID NO 161-164)人VH受体框架减延长的高变区(SEQ ID NO 165-172)人VH 受体 2 框架减 KabatCDR (SEQ ID NO 173-176)人VH受体2框架减延长的高变区(SEQ ID NO 177-188)可变轻链(VL)共有框架(图13)人VL κ 亚组 I 共有框架(SEQ ID NO 189-192)人VL κ 亚组 II 共有框架(SEQ ID NO: 193-196)人VL κ 亚组 III 共有框架(SEQ ID NO: 197-200)人VL κ 亚组 IV 共有框架(SEQ ID NO :201_204)图14描绘huMAb4D5_8轻链和重链的框架区序列。上标/粗体的数字指示依照 Kabat的氨基酸位置。 图15描绘huMAb4D5_8轻链和重链的经修饰/变体框架区序列。上标/粗体的数 字指示依照Kabat的氨基酸位置。发明详述一般技术除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、 细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分 阐述了这些技术，诸如“Molecular Cloning =ALaboratory Manual，，，第三版(Sambrook et al.,2001) ；"OligonucleotideSynthesis" (Μ.J. Gait, ed. ,1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney 编，1987) ；“Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)；"Current Protocols inMolecular Biology"(F. Μ. Ausubel et al.编，1987,and periodic updates) ；“PCR :The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al. H, 1994) ；PCR 2 :A PracticalApproach(M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor 编(1995)) ；Harlowand Lane 编(1988)Antibodies, A Laboratory Manual ；"A Practical Guide toMolecular Cloning，，(Perbal Bernard V. , 1988)；及"Phage Display :A LaboratoryManual，，(Barbas et al.，2001)。定义在用于本文时，术语“遍在蛋白(ubiquitin)”(遍在蛋白)和“单遍在蛋白 (monoubiquitin)”可互换使用，定义为所有种类的天然的人的和合成的遍在蛋白，基本上 与在第6位、第11位、第27位、第29位、第33位、第48位、和/或第63位氨基酸处具有至 少一个赖氨酸残基的76个氨基酸的蛋白质相似。在用于本文时，术语“多聚遍在蛋白(polyubiquitin)”定义为所有种类的天然 的人的和合成的遍在蛋白聚合链，其落入遍在蛋白不同聚合连接方式的人的和合成的类 别，包括，但不限于，K6连接的多聚遍在蛋白、Kll连接的多聚遍在蛋白、K27连接的多聚遍 在蛋白、K29连接的多聚遍在蛋白、K33连接的多聚遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白和 K63连接的多聚遍在蛋白。多聚遍在蛋白可以是任何长度的，包括至少两个遍在蛋白模块 (moity)。多聚遍在蛋白有别于最初作为单一蛋白质表达的遍在蛋白串联重复体。在用于本文时，术语“K*连接的多聚遍在蛋白”和“Lys*连接的多聚遍在蛋白”可 互换使用，指在一个遍在蛋白模块的C-末端与另一个遍在蛋白模块中的第*位赖氨酸之间 包含至少一个异肽键的多聚遍在蛋白分子。例如，“K63连接的多聚遍在蛋白”与“Lys63连 接的多聚遍在蛋白”可互换使用，这两个术语都指在分子中一个遍在蛋白模块的C-末端与 分子中另一个遍在蛋白模块的第63位赖氨酸之间包含异肽键的多聚遍在蛋白分子。在用于本文时，表述第一赖氨酸连接“不同”于第二赖氨酸连接指一个遍在蛋白模 块与另一个遍在蛋白模块之间的该第一赖氨酸连接所牵涉的赖氨酸残基(例如，K6、KlU 1(27、1(29、1(33、1(48、和/或1(63)不同于一个遍在蛋白模块与另一个遍在蛋白模块之间的该 第二赖氨酸连接。在用于本文时，术语“遍在蛋白途径”指细胞中的或在体外重建的、包括遍在蛋白 和/或多聚遍在蛋白的生化途径。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然 环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和 其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一个实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如 Lowry法的测定，抗体重量超过95%，在有些实施方案中重量超过99%，(2)足以通过使用 例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还 原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天 然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离 的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。在用于本文时，术语“抗遍在蛋白抗体”和“抗单遍在蛋白抗体”可互换使用，指能 够特异性结合遍在蛋白分子的抗体。在用于本文时，术语“抗多聚遍在蛋白抗体”指能够特异性结合多聚遍在蛋白分子
16的抗体。在用于本文时，术语“抗K48连接的多聚遍在蛋白抗体”指能够特异性结合K48连 接的多聚遍在蛋白的抗体。在用于本文时，术语“抗K63连接的多聚遍在蛋白抗体”指能够结合K63连接的多 聚遍在蛋白的抗体。短语“基本上相似” “基本上(实质上)相同”、“相当”或“基本上(实质上)相当” 在用于本文时表示两个数值(例如，一个与某分子相关，另一个与参照/比较分子相关)之 间足够高的相似程度，以致本领域技术人员会认为在用所述数值(如，Kd值、抗病毒效应、 等)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计 学显著性。所述两个数值之间的差异为，例如，小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于 约20%、和/或小于约10%，作为参照/比较分子的数值的函数。短语“实质性降低(substantially reduced)”或“实质性不同 (substantiallydifferent)”在用于本文时表示两个数值(通常，一个与某分子相关，另一 个与参照/比较分子相关)之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员会认为在用所述 数值(如，Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。所 述两个数值之间的差异为，例如，大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%、大于 约50%，作为参照/比较抗体该数值的函数。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗 原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指 反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1 1相互作用的内在结合亲和力。分子X对 其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方 法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高 亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和 力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab 型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的通过在存在 未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被 的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，et al. , J Mol Biol 293:865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5yg/ml捕捉用 抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2% (w/v)牛 血清清蛋白在室温(约23°C )封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将IOOpM 或26pM[125I]_抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al.，Cancer Res. 57 4593-4599 (1997)中抗VEGF抗体，Fab_12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过， 保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以 进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0. 1 % Tween-20的PBS洗板8次。 平板干燥后，加入150 μ 1/孔闪烁液(MicroScint-20 ；Packard)，然后在Topcount伽马计 数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓 度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定 法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在 25°C 使用
17固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用 盐酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将 抗原稀释至5 μ g/ml (约0. 2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分钟的流速注入至获得约10个响应单位 (RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。在每项实验中，在不 固定化蛋白质的情况中活化并乙醇胺封闭一个斑点，以用于参照扣除。为了进行动力学测 量，在25°C以约25 μ 1/分钟的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续 稀释的Fab(0. 78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k。n) 和解离速率(k。ff)。平衡解离常数(Kd)以比率k。ff/k。n计算。参见例如Chen，Y.，et al.， J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过 IO6M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的 分光光度计(a stop-flowequipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的 抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25°C的荧光发射强 度(激发=295nm;发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。it M H _ 白勺 “g ^ ! “ (on-rate, rate of association, association rate)或“k。n”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIACore -2000或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)在 25°C使用固定化抗原 CM5 芯片在约 10 个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨 基丙基)_碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感 器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至5 μ g/ml (约0· 2 μ Μ)， 然后以5 μ 1/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后， 注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25 μ 1/分钟的流速 注入在含0. 05% Tween-20的PBS (PBST)中两倍连续稀释的Fab (0. 78nM至500nM)。使用 简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3. 2) 通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k。n)和解离速率(k。ff)。平衡解离常数(Kd) 以比率 k。ff/k。n 计算。参见例如 Chen，Y.，et al. ,J Mol Biol 293:865-881(1999)。然而， 如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速率可以使用荧 光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments) 或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在 浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25°C的 荧光发射强度(激发=295nm ；发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类 载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载 体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能 够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳 动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细 胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重 组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使 用，因为质粒是载体的最常用形式。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其 类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核 苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结 构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核 苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”， 将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接 (例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连 接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例 如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如 吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修 饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomericnucleic acid) 等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如 膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制 备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5'和3'末端OH可磷 酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护 基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如 2'-氧-甲基、2' _氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端 基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类 似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二 酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸 酯，，(thioate)),P(S)S( “二硫代酸酯”(dithioate))、(0) NR2 ( “酰胺酯” (amidate)) ,P (0) R> P (O)OR'、⑶或CH2 (“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自独立为H或者取 代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷 基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及 的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度 一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上 文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。“抗体” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现 出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其它抗体 样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或 完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要 它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述 的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。这些结构域 一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。术语“可变的，，指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗 体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中较 保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取 β _折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β _折叠片结构一部分的三个⑶R 连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR —起促成抗体 的抗原结合位点的形成(参见 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 fiji, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 H胃^fi 接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性中 抗体的参与。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有 一个抗原结合位点，及剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理 产生一个F(ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由 紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中， 一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双 链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个⑶R相互 作用而在二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特 异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别 和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab'片段与Fab片段 的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个 或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab' 的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab‘片 段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻 链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋 白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、 δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般记载于例 如 Abbas et al. ,Cellular and Mol. Immunology，第 4 版(2000)。抗体可以是抗体与一种 或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体 而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分存在于完整抗体 中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例 如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项 生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中， 抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含 一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在变异外。如此，修饰语“单 克隆”指明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶 物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物 结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌 体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步 改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产 量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗 体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆 抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们 的特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修 饰语“单克隆”指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定 方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例 如杂交瘤法(例如 Kohler et al.，Nature256 495(1975) ；Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,第 2 版，1988 ；Hammerling et al., 于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,563-681, Elsevier, N. Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No. 4，816，567)、噬菌体展示技术(参见 例如 Clackson et al.，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 581-597(1992) ；Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338 (2) :299_310 (2004) ；Lee et al.， J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004) ；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOl (34) 12467-12472(2004) ；Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) 119-132 (2004))、及用 于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成 人或人样抗体的技术(参见例如 WO 98/24893 ；W096/34096 ；WO 96/33735 ；WO 91/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemannet al. , Year in Immunol. 7 :33 (1993)；美国专 利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016 ；Marks et al.，Bio/TechnologylO :779_783(1992) ；Lonberg et al.，Nature 368 :856_859 (1994)； Morrison, Nature368 812-813 (1994) ；Fishwild et al. ， Nature Biotechnol. 14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 :826 (1996) ；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍 生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部 分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此 类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567 ；Morrison etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变 区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔 或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框 架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体 抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化 抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环 对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人 源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。 更多细节参见 Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann et al. , Nature 332 323-329 (1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。还可参见以下 综述及其弓I用的参考文献Vaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 105-115(1998) ；Harris, Biochem.Soc.Transactions 23 1035-1038 (1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433(1994)。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/ 或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区三个在VH中(H1、H2、H3)，三 个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(OTR) 是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of
Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and Lesk，J.Mol. Biol. 196 :901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而 且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复 合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
环 Kabat
AbM
Chothia 接触
L1L24-L34
L2L50-L56
L3L89-L97
H1H31-H35B
L24-L34L26-L32L30-L36
L50-L56L50-L52L46-L55
L89-L97L91-L96L89-L96
H26-H35BH26-H32H30-H35B
权利要求
一种特异性结合K63连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合K48连接的多聚遍在蛋白或单遍在蛋白。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID NO :59_110和112 任一之 HVR-H2 和 SEQ ID NO :7_58 和 111 任一之 HVR-L2 的高变(HVR)序列。
3.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个HVR-H2序列，其中HVR-H2包含 氨基酸序列a bcdefghijklmno ρ (SEQ ID NO :221)，其中氨基酸a选自氨基 酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是异亮氨酸；氨基酸c选自氨基酸丝氨酸、苏氨酸、 丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪氨酸；氨基酸f选 自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和组氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基酸h选自氨基酸丝 氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是苏氨酸；氨基酸j是丝氨酸；氨基酸 k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是丝氨酸；氨基酸ο是缬氨 酸；而氨基酸P是赖氨酸。
4.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID Ν0:59-110和112 之HVR-H2序列的HVR-H2序列。
5.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID Ν0:60、63、和66 之HVR-H2序列的HVR-H2序列。
6.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个HVR-L2序列，其中HVR-L2包含 氨基酸序列q r s t u ν w χ (SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q选自氨基酸酪氨酸和苯丙氨 酸；氨基酸r选自氨基酸丙氨酸和丝氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t选自氨基酸丝氨酸、 精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是丝氨酸；氨基酸ν是亮氨 酸；氨基酸w是酪氨酸；而氨基酸Χ是丝氨酸。
7.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID N0:7-58和111之 HVR-L2序列的HVR-L2序列。
8.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID N0:8、ll、和14之 HVR-L2序列的HVR-L2序列。
9.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自HVR-H2和HVR-L2的序列， 其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a bcdefghijklmno ρ (SEQ ID N0:221)，其中 氨基酸a选自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是异亮氨酸；氨基酸c选自氨基 酸丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪 氨酸；氨基酸f选自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和组氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基 酸h选自氨基酸丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是苏氨酸；氨基酸j 是丝氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是丝氨 酸；氨基酸ο是缬氨酸；而氨基酸ρ是赖氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r s t u ν w x(SEQID NO :222)，其中氨基酸q选自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r选自氨基酸丙 氨酸和丝氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t选自氨基酸丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、 丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是丝氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是酪氨酸； 而氨基酸χ是丝氨酸。
10.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个HVR-H2序列和至少一个 HVR-L2 序列，其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a b c d ef g h i j k 1 m no ρ (SEQ ID NO 221)，其中氨基酸a选自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是异亮氨酸；氨基酸c 选自氨基酸丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基 酸e是酪氨酸；氨基酸f选自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和组氨酸；氨基酸g是甘氨 酸；氨基酸h选自氨基酸丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是苏氨酸； 氨基酸j是丝氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸 η是丝氨酸；氨基酸ο是缬氨酸；而氨基酸P是赖氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r stuvw χ(SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q选自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r选自 氨基酸丙氨酸和丝氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t选自氨基酸丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是丝氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是 酪氨酸；而氨基酸χ是丝氨酸。
11.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID N0:59-110和 112之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一个选自SEQ ID NO :7_58和111之HVR-L2序列 的HVR-L2序列。
12.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQID NO :60、63、和66 之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一个选自SEQ ID NO :8、11、和14之HVR-L2序列的 HVR-L2 序列。
13.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含选自表B中 Apu3. A8-Apu3. HlO任一所列HVR-H2和HVR-L2氨基酸序列的HVR氨基酸序列。
14.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含选自表B中 Apu3. A8、Apu3. A12、和Apu3. B3任一所列HVR-H2和HVR-L2氨基酸序列的HVR氨基酸序列。
15.权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQIDNO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。
16.权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段，其包含至少两个选自SEQIDNO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。
17.权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段，其包含至少三个选自SEQIDNO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。
18.权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段，其包含SEQID NO 5之HVR-Hl序 列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4 之 HVR-L3 序列。
19.权利要求1-18任一项的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段对K63 连接的多聚遍在蛋白的亲和力相对于亲本Fab Apu2. 16的亲和力有改善。
20.权利要求1-18任一项的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段对K63 连接的多聚遍在蛋白的Kd小于或等于ΙΟηΜ。
21.一种与权利要求1-20任一项的抗体或抗原结合片段结合多聚遍在蛋白上相同抗 原决定簇的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合单遍在 蛋白。
22.—种与权利要求1-20任一项的抗体竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体或 抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不特异性结合单遍在蛋白。
23.权利要求1-20任一项的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段特异性 结合K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质。
24.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段抑制K63连接的 多聚遍在蛋白化的蛋白质降解。
25.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段调控至少一种由 多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
26.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段抑制至少一种由 多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
27.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段刺激至少一种由 多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
28.一种核酸分子，其编码权利要求1-20任一项的抗体或抗原结合片段。
29.—种载体，其包含权利要求28的核酸。
30.一种宿主细胞，其包含权利要求29的载体。
31.一种细胞系，其能够生成权利要求1-20任一项的抗体或抗原结合片段。
32.—种生成权利要求1-20任一项的抗体或抗原结合片段的方法，包括在该抗体或抗 原结合片段生成的条件下培养包含编码该抗体或抗原结合片段的核酸分子的宿主细胞。
33.一种组合物，其包含有效量的权利要求1-20任一项的抗体或抗原结合片段和药学 可接受载体。
34.一种鉴定样品中K63连接的多聚遍在蛋白或K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质 的存在的方法，包括使该样品与权利要求1-20任一项的至少一种抗体或抗原结合片段接 触。
35.一种治疗患者中与多聚遍在蛋白失调有关的疾病或状况的方法，该方法包括对该 患者施用有效量的权利要求1-20任一项的至少一种抗体或抗原结合片段。
36.权利要求35的方法，其中该患者是哺乳动物患者。
37.权利要求36的方法，其中该患者是人。
38.权利要求35的方法，其中该疾病选自癌症、肌肉病症、遍在蛋白途径相关遗传病 症、免疫/炎性病症、和神经学病症。
39.权利要求38的方法，其中该疾病选自癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、肌营 养不良、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、囊性纤维化病、Angelman氏综合征、利德尔综合征、 阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮克氏病、和佩吉特氏病。
40.一种测定怀疑含有K63连接的多聚遍在蛋白或K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白 质的样品中K63连接的多聚遍在蛋白或K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方 法，包括使该样品暴露于权利要求1-20任一项的至少一种抗体或抗原结合片段并测定该 至少一种抗体或抗原结合片段对该样品中K63连接的多聚遍在蛋白或K63连接的多聚遍在 蛋白化的蛋白质的结合。
41.一种将样品中的K63连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质与非K63连接的多聚遍在蛋 白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与权利要求1-20任一项的至少一种抗体或抗原结合片段接触。
42.一种测定细胞中K63连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞 接触权利要求1-20任一项的至少一种抗体或抗原结合片段并评估所述接触步骤对该细胞 的影响。
43.一种测定样品中K63连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该样品 与权利要求1-20任一项的至少一种抗体或抗原结合片段接触并评估所述接触步骤对该样 品的影响。全文摘要
提供抗K63连接的多聚遍在蛋白单克隆抗体，及使用该抗体的方法。
文档编号G01N33/68GK101977934SQ200980109579
公开日2011年2月16日 申请日期2009年1月16日 优先权日2008年1月18日
发明者玛丽萨·L·玛特苏莫托, 罗伯特·F·凯莉 申请人:健泰科生物技术公司