一种前列腺癌靶向腺病毒的制备及应用的制作方法

专利名称：一种前列腺癌靶向腺病毒的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种前列腺癌靶向免疫溶瘤双功能 腺病毒载体系统的建立及其在前列腺癌治疗中的应用。
背景技术：
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一。2005年，前列腺癌高居美国男性癌症发病 率的第一位和死亡率的第二位。在我国，随着人口老龄化的进程，前列腺癌发病率也呈逐年 上升趋势，严重影响了老年男性的生活质量。手术、激素、放化疗和冷冻等传统治疗方法对 于复发、转移及激素抗拒型的患者往往不敏感。因此，探索一种新的、更加有效针对前列腺 癌的免疫基因治疗方案，对于前列腺癌的治疗具有重要的理论价值和现实意义。近年，前列腺癌治疗的研究主要集中于免疫基因治疗和溶瘤病毒治疗。其中，犹以 腺病毒介导的治疗方式发展迅速。两种治疗方式能通过不同的机制实现一定的抗肿瘤效 应，但也存在着一些不足和缺陷。(一)免疫基因治疗免疫基因治疗，主要通过病毒或非病毒载体携带具有免疫激活功能的目的基因， 激活机体抗肿瘤免疫反应，通过免疫系统杀灭肿瘤细胞。目前，常见的免疫基因治疗主要通 过载体携带一些免疫共刺激分子或免疫调节分子，激活机体的免疫反应。但是，这种反应是 非特异性的，只有机体免疫耐受被打破后，才能激发特异性的免疫反应。因此，其杀伤效应 和特异性往往不高。细胞免疫在肿瘤免疫治疗中占据主要地位，但是肿瘤病人往往形成对肿瘤抗原的 免疫耐受。因此，直接以肿瘤抗原作为免疫原，其效果往往不佳。2001年，Xiang等将人癌 胚抗原(hCEA)胞外区和CD40L胞外区的融合表达框构建到质粒载体中，以减毒沙门氏菌为 载体，口服给药，能通过CD8+T细胞依赖的方式抵抗hCEA阳性的鼠结肠癌细胞的生长。2003 年，Lixin Zhang等将HPV E7抗原/hMUC_l和⑶40L胞外区的融合表达框构建到腺病毒 载体中，证明其对E7阳性或hMUC-Ι阳性的肿瘤细胞具有免疫抵抗作用。以上研究表明， ⑶40L与肿瘤抗原融合表达后，能通过其靶向作用将肿瘤抗原带到抗原递呈细胞(DC、巨噬 细胞等)表面，进而更有效地发挥抗肿瘤免疫效应。但是，这种治疗方式也存在这一定的缺陷。首先，肿瘤病人的免疫系统往往受到抑 制，包括能够促进DC成熟和分化的细胞因子GM-CSF。CD40L只能将肿瘤抗原带到DC表面， 而对抗原的处理、加工和递呈，需要GM-CSF等细胞因子的共同作用。其次，无论是复制缺陷 型腺病毒载体还是质粒载体，目的基因的表达往往是瞬时的，而目的基因对机体免疫功能 的激活作用不仅取决于局部的浓度，而且可能与刺激持续的时间有关。因此，掌握恰当的给 药量、给药方式可能会关系到治疗的成败。( 二)溶瘤病毒治疗溶瘤腺病毒构建的策略之一是用组织特异性启动子替换天然的病毒启动子来控 制病毒复制启动基因的表达，得到转录调控型的溶瘤腺病毒。目前，溶瘤腺病毒也是前列腺癌治疗研究的热点。2004 年，Sang-Jin Lee 等制备了 PSMAe 控制 ElA 表达的 CRAD ；2005 年，xiong Ii 等制备了用PSES双向控制腺病毒ElA和E4基因表达的CRAD，但是，两种病毒均只在PSMA+ 细胞中有活力。2005年，W-S Cheng等制备了 PSA-PSMA-TARP(PPT)嵌合启动子和小鼠H19 绝缘子元件控制ElA表达的CRAD，并证实其具有较好的前列腺癌特异性，且是雄激素非依 赖的。但是，该启动子中的H19绝缘子序列过长，对于Adeasy系统的穿梭质粒容纳是很大 的负担。同时，腺病毒感染细胞时，需要ElB_55KDa蛋白结合细胞内p53蛋白并使之失 活，抑制P53基因依赖的细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而使病毒大量繁殖。所以缺失了 ElB-55KDa基因的腺病毒将不能在p53功能正常的细胞内有效复制。为保证腺病毒的有效 复制，将ElB基因启动子及其调控的ElB-55KDa基因克隆到腺病毒载体中。近年，随着溶瘤腺病毒的发展，其溶瘤作用不仅仅依靠病毒本身的复制能力，还通 过病毒携带一些外源基因，如自杀基因、免疫调节因子基因等，增强对肿瘤细胞的杀伤能 力。溶瘤腺病毒虽然在理论上能够在前列腺癌细胞中特异性复制并杀灭所有肿瘤细胞。但 是，在启动子启动效率及机体多种因素的影响下，溶瘤腺病毒往往只能杀灭大部分的肿瘤 细胞。特别是对于已经转移到其他器官的肿瘤细胞，由于转移灶附近腺病毒的浓度较低，病 毒不能感染和杀伤肿瘤细胞。因此，对肿瘤复发和转移的治疗效果往往不佳。(三)免疫溶瘤双功能腺病毒胡泽斌等构建了溶瘤腺病毒Ad-CD80-TPE-GM，并证明其能够在端粒酶阳性的细胞 中复制，并表达GM-CSF和共刺激分子B7-1 (⑶80)。动物研究表明，该重组腺病毒能在端粒 酶阳性的人喉癌ifep2细胞移植瘤组织内大量复制并有效表达目的基因，具有明显抗肿瘤 效应。但是，该溶瘤腺病毒携带的基因为免疫调节基因，其对机体免疫的激活是非特异性， 因此，免疫反应的强度也较弱。综上所述，制备一种能够在前列腺癌细胞中特异性复制，而且能够表达具有特异 性免疫激活作用的目的基因的重组腺病毒，为前列腺癌的临床治疗提供一种特异、高效的 方法，具有重大的理论和现实意义。

发明内容
本发明的目的是为了构建一种前列腺癌特异性的免疫溶瘤双功能腺病毒，为前列 腺癌的治疗提供一种新的策略。本发明采用Adeasy系统，将“前列腺癌特异性启动子调控ElA的表达框，ElB启动 子调控ElB-55KDa及GM-CSF的表达框，及cmv启动子调控PSA-IZ-CD40L的表达框”构建到 穿梭质粒。PmeI将其线性化，并于BJ5183菌株中与Adeasy-I同源重组。得到的重组腺病 毒质粒，经PacI线性化后，转染HEK293细胞，包装得到重组腺病毒。并在前列腺癌细胞中 鉴定其目的基因的表达和溶瘤效应。具体为1、前列腺癌特异性嵌合启动子(PSA-PSMA-TARP，PPTp)的构建我们参照W-S Cheng等采用的PPT和H19联合启动子的基础上，去处H19绝缘子， 并将ElA表达筐置于目的基因表达筐加尾信号下游，使其不受包装信号中增强子的影响。 有利于溶瘤腺病毒中插入一些具有免疫激活功能的目的基因，从而发挥溶瘤和免疫的双重
4功能。此外，启动子的启动效率和特异性是一对矛盾，综合考虑后，删除了 PSAe部分序 列，保留全部AREc。该启动子具有较W-S Cheng等采用的联合启动子更强的启动效率，较 xiong Ii等的PSES启动子更好的特异性。2、pShuttle-cmv-PSA-IZ-CD40L-PPTp-ElA-GM-IRES-ElB55K 的构建及鉴定本发明重组腺病毒融合蛋白能否发挥功能，关键在于其功能区域的结构是否稳 定。我们选用了含有CD40结合位点的TNF结构域(113-261位氨基酸)，并将194位氨基酸 由半胱氨酸(CySteine，C)突变为色氨酸(Tryptophan，W)，防止二硫键形成。此外，“GGGGS+ 异亮氨酸拉链(isoleucine zipper, IZ)+LL”的连接方式，在保证蛋白结构稳定的同时，增 强其抗原性，有助于机体免疫反应的激活。3、制备重组腺病毒 Ad-pShuttle-cmv-PSA-IZ-CD40L-PPTp-ElA-GM-IRES-ElB55 K 该重组腺病毒，同时携带能够靶向免疫激活的融合蛋白基因PSA-IZ-⑶40L和免 疫刺激因子基因GM-CSF，有效提高DC递呈抗原的能力；同时，通过其在前列腺癌细胞中不 断复制以及感染周围细胞的能力，使得目的基因的表达能够持续，且维持在一定的高度。这 对于机体的免疫激活至关重要。4、对照重组腺病毒的制备；为了对免疫溶瘤双功能腺病毒的作用机制进行探讨，我们构建了三种对照 腺病毒，分别为(l)Ad-pSh-PPT-ElA:只具有溶瘤功能，而没有携带免疫基因；(2) Ad-pSh-PL-IR-GM 携带两个免疫激活基因PSA-IZ-CD40L和GM-CSF，但没有溶瘤作用；(3) Ad-psh-PL-PPT-ElA 具有溶瘤功能并携带一个免疫激活基因PSA-IZ-CD40L。5、前列腺癌特异性启动子启动效率及特异性评价构建由前列腺癌特异性启动子调控EGFP表达的重组腺病毒，并以cmv启动子调控 EGFP表达的重组腺病毒作为对照。将其感染不同的肿瘤细胞和正常细胞后，荧光显微镜和 流式细胞检测目的基因EGFP的表达。直观评价前列腺癌特异性启动子的启动效率和特异 性。6、前列腺癌细胞中各种基因的表达；将重组腺病毒感染前列腺癌细胞后48h，Western-blot和ELISA分别检测 PSA-IZ-⑶40L和GM-CSF的表达。目的基因的有效表达是免疫功能得意发挥的保障。7、前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒体外溶瘤效果的评价本发明采用MTT法和结晶紫染色法分别检测病毒感染的前列腺癌细胞的存活情 况，评价重组腺病毒体外溶瘤作用。本发明的创新点在于将溶瘤腺病毒与肿瘤基因治疗最新成果的有效结合。其 免疫和溶瘤功能能够相互作用，共同促进机体的抗肿瘤效应。肿瘤局部给药后，首先通 过肿瘤细胞内的有效复制，杀灭肿瘤细胞；不断复制的病毒能够持续产生大量的目的蛋 白PSA-IZ-CD40L和GM-CSF。局部高浓度免疫分子的刺激，可以激活机体的免疫功能 PSA-IZ-⑶40L通过⑶40L的靶向作用，将前列腺癌抗原PSA带到DC表面；同时，GM-CSF促 进DC的成熟、分化，DC将PSA抗原处理、加工，并递呈给T淋巴细胞。激活的T淋巴细胞能 够杀伤残留或发生转移的前列腺癌细胞。


附图1TE-PPT-SV-IR-55K的构建示意图PCR扩增合成前列腺癌启动子ΡΡΤρ，替 换TE-terpt-SV-IR-55K地terpt启动子，得到含有前列腺癌特异性启动子(PPTp)的TE载 体TE-PPT-SV-IR-55K，1表示采用PCR方法将三段基因连接成为全长ΡΡΤρ，2表示NotI和 EcoRI分别酶切TE-terpt-SV-IR-55K和ΡΡΤρ，并进行连接。附图2穿梭质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-EIA-GM的构建示意图PCR扩 增合成融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L，并将其克隆到pShuttle-cmv载体上，得到 pshuttle-cmv-PL, pShuttle-cmv-PL 和 TE-terpt-SV_IR-55K 经 MfeI 酶切、连接得到 pShuttle-cmv-PL-PPT-ElA-GM。1表示PCR方法将四段基因连接成全长的PL基因，2表示 用KpnI和EcoRV分别酶切PSA-IZ-CD40L和pShuttle-cmv，并进行连接；3表示用MfeI分 别酶切 pshuttle-cmv-PL 和 TE-PPT-SV-IR-55K，并进行连接；附图 3 穿梭质粒 pShuttle-cmv-PL-PPT-EIA-GM 的酶切鉴定 1 为 DL2000Marker ；2 为BglII酶切产物，3为HincII酶切产物，4为KpnI酶切产物，5为λ-HindIII Marker。附图4Ad-psh-cmv-PL-PPT-ElA_GM构建的结构示意图1表示 pShuttle-cmv-PL-PPT-EIA-GM 经 PmeI 酶切，并电转 BJ5183 感受态细胞，与 Adeasy-I 同源 重组，得到 Ad-psh-cmv-PL-PPT-EIA-GM ；2 表示 Ad-psh-cmv-PL-PPT-EIA-GM 经 PacI 酶切 后，转染HEK293细胞，包装产生重组腺病毒。附图5PacI酶切鉴定重组腺病毒质粒1为Ad-psh-cmv-PL ；2为Ad-psh-cmv-PL 经PacI酶切产物；3为Ad-psh-cmv-PL-PPT-ElA-GM经PacI酶切产物；4为 Ad-psh-cmv-PL-PPT-EIA-GM ；附图 6 重组腺病毒 Ad-p sh-cmv-PL-PPT-E IA-GM 和 Ad-psh-cmv-PL 的鉴定 a， Western-blot (抗CD40L抗体)鉴定目的蛋白的表达1为HEK293细胞蛋白；2为感 染 Ad-psh-cmv-PL 的 HEK293 细胞；3 为感染 Ad-psh-cmv-PL-PPT-ElA-GM 的 HEK293 细 胞；b，Western-blot (抗PSA抗体)鉴定目的蛋白的表达1为HEK293细胞蛋白；2为感 染 Ad-psh-cmv-PL 的 HEK293 细胞；3 为感染 Ad-psh-cmv-PL-PPT-ElA-GM 的 HEK293 细 胞；附图7重组腺病毒感染前列腺癌细胞PC3M和DU145后，Western-blot检测融合蛋 白表达的结果1、2分别为Ad-psh-cmv-PL感染PC3M和DU145细胞的结果；3、4为分别为 Ad-psh-cmv-PL-ppt-ElA-GM感染PC3M和DU145细胞的结果。采用的抗体为PSA的抗体附图8MTT法测定细胞存活率结果a为重组腺病毒感染DU145后5d检测的结 果；b为重组腺病毒感染LNCaP后5d检测的结果；c为重组腺病毒感染PC3M后5d检测的 结果。纵坐标为0D570nm检测值，1为未感染病毒的空白对照；2 5分别为5M0I，1M0I， 0. 5Μ0Ι，0· IMOIAd-psh-cmv-PL-ppt-ElA-GM 感染的结果；6 8 分别为 5M0I, ΙΜΟΙ,Ο. 5Μ0Ι Ad-psh-cmv-PL感染的结果。
具体实施例方式实施例1含有前列腺癌特异性启动子PPTp的TE载体的构建其方法是以人基因组DNA为模板，设计引物分别扩增前列腺特异性抗原增强子 AREc3区(PSAe)、前列腺膜特异性抗原增强子(PSMAe)和TARPp，然后采用PCR方法将其连接成嵌合启动子 PPTp，取代 TE-SV-tertp-ElA-GM-IRES-ElB55K(TE-Tertp-SV-IR-55K)中 的 Tertp，得到目的质粒 TE-SV-PPT-E1A-GM-IRES-E1B55K(TE-PPT-SV-IR-55K)。(如附图 1 所示)(1)前列腺特异性抗原增强子AREc3区(PSAe)的扩增设计PSA增强子序列(AF243527 38200-38900)AREc3区引物外侧引物上游见 序列表1，下游见序列表2 ；内侧引物上游带有NotI酶切位点，见序列表3，下游带有部分 PSMAe序列，见序列表4。以人基因组DNA为模板，巢氏PCR扩增。(2)前列腺膜特异性抗原增强子(PSMAe)的扩增设计PSMA增强子序列(AF007544 =14600-15200)引物外侧引物上游见序列表5， 下游见序列表6 ；内侧引物上游带有部分PSAe序列，见序列表7，下游带有部分TARPp序列， 见序列表8。以人基因组DNA为模板，巢氏PCR扩增。(3) TARPp 的 PCR 扩增设计TARPp序列(NG_001336 =100000-100500)引物外侧引物上游见序列表9，下 游见序列表10 ；内侧引物上游带有部分PSMAe序列，见序列表11，下游带有EcoRI酶切位 点，见序列表12。以人基因组DNA为模板，巢氏PCR扩增。(4)前列腺癌特异性嵌合启动子(PSAe-PSMAe-TARPp，PPTp)的合成将以上得到PSAe、PSMAe、TARPp等三条序列，类似基因合成的方法，在不加引物的 条件下先扩增10个循环。然后加入带有NotI的上游引物(序列3)和带有EcoRI的下游 引物(序列12)进行PCR扩增。得到的产物序列如序列表序列13。(5)前列腺癌特异性启动子克隆到TE载体并鉴定TE-SV-tertp-ElA-GM-IRES-ElB55K(TE-Tertp-SV-IR-55K)质粒(保藏号 P2004-03-05)，含有端粒酶启动子调控腺病毒复制启动基因E1A的序列；同时含有E1B启动 子调控GM-CSF和E1B55K的序列，是溶瘤腺病毒制备的一个中间载体。而且该载体调控E1A 的启动子序列可以被方便地替换，用于制备不同要求的溶瘤腺病毒。经酶切、连接，将该TE载体中的Tertp替换成PPTp。具体方法为NotI.和EcoRI 双酶切TE-Tertp-SV-IR-55K，将小片段的Tertp弃去，回收大片段，并与PPTp片段连接得到 目的质粒 TE-SV-PPT-E1A-GM-IRES-E1B55K (TE-PPT-SV-IR-55K)。经酶切、PCR 和测序鉴定 正确。实施例2 穿梭质粒 pShuttle-cmv-PL-PPT-ElA-ElBp-GM-IR-ElB55K 的构建其方法是以人前列腺癌细胞LNCaP的cDNA为模板，扩增前列腺癌特异性抗原 (PSA)；以人白血病细胞Juarket的cDNA为模板，扩增⑶40L ；基因合成的方法合成用于连 接PSA和⑶40L的接头。将以上三个片段PCR连接，获得PSA和⑶40L的融合表达框，然后 将其克隆到穿梭质粒 pShuttle-cmv，得到 pShuttle_cmv-PL。Mfel 将 pShuttle_cmv-PL 和 TE-PPT-SV-IR-55K 酶切、连接，得到目的质粒 pShuttle-cmv-PL-PPT-ElA-ElBp-GM-IR-ElB 55K。(如附图2所示)(1)前列腺癌特异性抗原(PSA)的PCR扩增设计PSA序列(NM_001648. 2，GI =22208990)引物上游引物带有Kpnl酶切位点， 如序列表序列14，下游引物序列不包含终止子，如序列表序列15。以人前列腺癌细胞LNCaP (保藏号C9_4_34)的cDNA为模板，PCR扩增。为避免翻译时融合蛋白的提前终止，将PSA的终止子去除。(2) CD40L 的 PCR 扩增由于⑶40L的112Aa_113Aa之间存在一切点，在生理条件下能被切成可溶性的 ⑶40L，为防止融合蛋白被切断，我们设计的⑶40L是从113Aa开始的TNF结构域。此外，为 防止二硫键的形成，需要将192位的C突变为W。我们将采用PCR方法进行定点突变，扩增 产物将分为N端、C端两个片段。设计⑶40L序列(NM_000074. 2)的引物外侧上游引物见序列表16，外侧下游引 物见序列表17 ；为引入定点突变，将CD40L分为N端和C端分别进行扩增，N端内侧引物上 游见序列表18，下游见序列表19 ；C端内侧引物上游见序列表20，下游带有EcoRV酶切位 点，见序列表21。以人白血病细胞Juarket (保藏号C6-5-32)的cDNA为模板，巢氏PCR+ 定点突变的方法扩增目的基因。(3)PSA与CD40L融合蛋白接头的合成(GGGGS+IZ+LL)参考文献报道，我们在PSA和⑶40L之间设计了异亮氨酸拉链(IZ)，以保持⑶40L 三聚体的形成和PSA结构的维持，同时，在PSA与IZ之间添加了 GGGGS，在⑶40L与IZ之间 添加了 LL。我们采用基因合成的方法得到接头序列我们设计了六条引物，如序列表序列 22 序列27，将引物序列混合后，先PCR扩增15个循环，后加入两头的引物进行常规PCR 扩增，得到目的产物。(4)、融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L的PCR扩增将以上得到的四个片段序列PSA、linker,⑶40L N端和⑶40L C端，割胶纯化后 混合，按照基因合成的方法，先PCR扩增15个循环，然后加入带有Kpnl酶切位点的上游引 物(序列14)和带有EcoRV酶切位点的下游引物(序列21)进行常规PCR扩增。所得产物 条带与预期相一致，其序列如序列表序列28所示。(5)、将 PSA-IZ-CD40L 克隆到穿梭质粒 pShuttle-cmv 上穿梭质粒pShuttle-cmv载体(购自stratagene)和PSA-IZ-CD40L片段分别进行 Kpnl和EcoRI双酶切，然后进行连接，Kana+筛选获得目的质粒pShuttle-CMV-PL。(6)pShuttle-cmv-PL-PPT-ElA-ElBp-GM-IR-ElB55K 的构建将中间载体TE-PPT-SV-IR-55K 和 pShuttle-cmv-PL 进行 Mfel 酶切，连接，Kana+ 筛选得到目的质粒 pShuttle-cmv-PL-PPT-ElA-ElBp-GM-IR-ElB55K(pShuttle-cmv-PL-PP T-E1A-GM)，其序列如序列表序列29所示。分别进行Bglll、HincII和Kpnl酶切鉴定正确 (如附图3所示)。实施例3 重组腺病毒 Ad-pSh-cmv-PL-PPT-ElA-ElBp-GM-IR-ElB55K 的制备其方法是Pmel 酶切穿梭质粒 pshuttle-cmv-PL-PPT-ElA 和 pShuttle-cmv-PL，电 转BJ5183感受态细胞，与Adeasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-pSh-cmv-PL-PPT-El A-ElBp-GM-IR-ElB55K(Ad-pSh-PL-PPT-ElA-GM)和 Ad-pSh-cmv-PL。PacI 酶切重组腺病毒 质粒，并将其转染HEK293细胞制备病毒。鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。(如附 图4所示)(1)重组腺病毒质粒的产生将穿梭质粒pshuttle-cmv-PL-PPT-ElA 和 pShuttle-cmv-PL 进行 Pmel 酶切，并去磷酸化，以“200Q，2. 5KV，25ii F”的条件电击转化BJ5183_Adeasy-l感受态细胞(购 自Stratagene公司)，同源重组，Kana+筛选得到腺病毒质粒Ad-pSh-PL-PPT-ElA-GM和 Ad-pSh-cmv-PL。PacI酶切鉴定正确，结果如附图5所示。(2)重组腺病毒的制备鉴定正确的重组腺病毒质粒Ad-pSh-PL-PPT-ElA-GM和Ad-pSh-cmv-PL，经PacI酶 切和酚氯仿抽提纯化，转染包装细胞HEK293 (保藏号C12-7-14)，8天噬斑形成，lid细胞 完全病变。收集细胞及上清，反复冻溶3次后收集上清。制备得到的重组腺病毒能够表达 PSA-IZ-CD40L和GM-CSF (其中PSA-IZ-CD40L蛋白序列如序列表序列30所示)。(3)重组腺病毒的鉴定病毒上清感染HEK293细胞，48 72h出现细胞病变。收集细胞上清，ELISA检测 GM-CSF的表达(如表1所示)，表明构建的病毒能够表达GM-CSF ；收集细胞，提取病毒基因 组DNA和蛋白，PCR及Western-Blot检测目的蛋白PSA-IZ-CD40L的表达，表明构建的病毒 能够产生目的蛋白(如附图6所示)。以上结果，表明我们成功制备了免疫溶瘤双功能腺病表1ELISA检测病毒感染的293细胞GM-CSF表达结果
Ad-psh-crav-PLAd-psh-cmv-ppt-ElA-GMOD450nra0. 0231. 068含量pg/ml0. 1333696. 8(4)、重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定重组腺病毒感染HEK293细胞后进行病毒扩增，收集病变细胞。氯化铯密度梯度 法纯化后于-80°C保存在含10%甘油的Hank’ s液中备用。用紫外分光光度计法(波长 260nm)和有限稀释法分别测定重组腺病毒Ad-pSh-PL-PPT-ElA-GM和Ad-pSh-cmv-PL的颗 粒滴度(viralparticle units per milliliter, vp/ml)，纯度(0D260nm/280nm)和感染滴 度(infection units per milliliter，IU/ml)，这些指标均符合实验需要，结果见表2。表2 重组腺病毒 Ad-pSh-PL-PPT-ElA-GM 和 Ad-pSh-cmv-PL 滴度测定结果
病毒名称颗粒滴度纯度感染滴度Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM2. 42 x 10n1. 23383. 2 x 1010Ad-pSh-cmv-PL2. 82 x 10121. 34786. 3x 1010实施例4对照重组腺病毒的构建得到的腺病毒Ad-pSh-PL-PPT-E 1A-GM含有cmv启动子调控的免疫靶向基因 PSA-IZ-CD40L ；前列腺癌特异性启动子调控的腺病毒复制启动基因E1A ；E1B启动子调控的 免疫调节基因GM-CSF和E1B55K。本发明的腺病毒具有溶瘤和免疫激活的双重功能，为准确 进行功能评价和机制探讨，我们需要构建一些对照病毒(1) Ad-psh-PL-PPT-E 1A 的构建
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本发明中含有两个重要的免疫基因PSA-IZ_⑶40L和GM-CSF。其中，融合蛋 白PSA-IZ-CD40L具有靶向免疫激活功能；而GM-CSF具有促进免疫细胞成熟、分化等功 能。为准确评价两者的功能和相互作用机制，需要构建GM-CSF缺失的对照病毒。首先 需要构建穿梭质粒 pshuttle-cmv-PL-PPT-ElA-ElBp-ElB55K(pShuttle-cmv-PL-PPT-E 1A) :MfeI酶切pShuttle-cmv-PL和TE-PPT-SV-55K后连接，Kana+筛选得到目的质粒 pShuttle-cmv-PL-PPT-ElA，经酶切鉴定正确。Pmel线性化，转染BJ5183感受态细胞，同源 重组获得Ad-psh-PL-PPT-ElA。PacI线性化，并转染HEK293细胞，获得重组腺病毒TE-PPT-SV-55K 构建的具体操作为TE-SV-PPT_IR-55K 进行 Spel 和 Nsil 双酶 切，切除GM-CSF，IRES和部分的E1B55K序列，获得7224bp的片段；PCR扩增被切除部分的 E1B55K序列(ElB55Kplus)。ElB55Kplus.上游引物带有Spel酶切位点，如序列表序列31 所示；下游引物带有Nsil酶切位点，如序列表序列32所示。将以上片段酶切后与载体相连 得到目的质粒TE-SV-PPT-55K，酶切、PCR及测序鉴定正确。(2)Ad-pSh-PL-IR_GM 的构建为体现本发明溶瘤性和免疫治疗的有效结合，需要设计非溶瘤腺病毒用于评价免 疫治疗效果。融合蛋白基因PSA-IZ-⑶40L和免疫调节基因GM-CSF以IRES连接的方式克 隆到穿梭质粒pShuttle-cmv，cmv启动子能够调控融合蛋白和GM-CSF的共同表达。具体操 作为以 TE-Tertp-SV-IR_55K 为模板，扩增 GM-CSF，并将其克隆到 pShuttle_CMV 上， Kana+ 筛选得到 pShuttle-cmv-GM。以 pShuttle-cmv-PL 为模板，扩增 PSA-IZ-CD40L，并进行 Kpnl 和 EcoRI 双酶切； EcoRI 和 NotI 双酶切 PUDK-HBV-IR-GM(保藏号P2007-05_01)得到 IRES。Kpnl 和 NotI 双酶切 pShuttle-cmv-GM，与 PSA-IZ-CD40L 和 IRES 连接，Kana+ 筛 选得到目的质粒pShuttle-cmv-PL-IR-GM。酶切、PCR及测序鉴定正确。Pmel线性化，转染 BJ5183感受态细胞，同源重组获得Ad-psh-PL-IR-GM。PacI线性化，并转染HEK293细胞，获 得重组腺病毒。GM-CSF上游引物带有Hindlll酶切位点，见序列表序列33，下游引物带有EcoRV 酶切位点，见序列表序列34。PSA-IZ-⑶40L上游引物带有Kpnl酶切位点，见序列表序列 35，下游引物带有EcoRI酶切位点，见序列表序列36。(3)Ad-pSh-PPT_ElA 的构建溶瘤特性是本发明的一个重要方面，为更好评价溶瘤效果，需要构建单独溶 瘤的重组腺病毒，观察其效果。具体构建方法为穿梭质粒空载体pshuttle-cmv和 TE-PPT-SV-55K分别进行Mfel酶切、连接，Kana+筛选得到目的质粒pShuttle-cmv-PPT-El A-ElBp-ElB55K(pshuttle-cmv-PPT-ElA)。酶切及 PCR 鉴定正确。Pmel 线性化，转染 BJ5183 感受态细胞，同源重组获得Ad-pSh-PPT-ElA。PacI线性化，并转染HEK293细胞，获得重组 腺病毒。实施例5前列腺癌特异性启动子PPTp启动效率及特异性评价其方法是构建并制备PPT启动子调控EGFP表达的重组腺病毒，同时构建cmv启动 子调控EGFP表达的对照腺病毒。将其以不同的M0I感染前列腺癌细胞系和其他细胞系，荧 光显微镜和流式细胞术观察EGFP表达效率，评价启动子的启动效率和前列腺癌特异性。
(1)重组腺病毒 Ad-pSh-PPT-EGFP 和 Ad-pSh-cmv-EGFP 的构建及制备以TE-SV-PPT-IR-55K为模板，PCR扩增目的基因PPTp ；同时，以pLEGFP-Cl为模 板，扩增目的基因EGFP。PPTp启动子经Kpnl和Xhol双酶切，EGFP经Xhol和Hindlll双酶 切，依次克隆到穿梭质粒pShuttle (购.自Stratagene公司)上，得到pShuttle-PPT-EGFP ； 将EGFP克隆到pShuttle-cmv上得到pShuttle-cmv_EGFP。经酶切、PCR和测序鉴定正确。PPTp上游引物带有Kpnl酶切位点，见序列表序列37，下游引物带有Xhol酶切位 点，见序列表序列38。EGFP上游引物带有Xhol酶切位点，见序列表序列39，下游引物带有 Hindlll酶切位点，见序列表序列40。质粒经Pmel线性化，电转BJ5183-AdeaSy感受态细胞，同源重组，Kana+筛选得到 Ad-pSh-PPT-EGFP 和 Ad-pSh-cmv-EGFP，PacI 酶切鉴定正确。PacI 线性化后转染 HEK293 细 胞制备病毒，鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。(2)荧光显微镜和流式细胞测定EGFP在各细胞系中的表达效率将前列腺癌细胞系DU145 (保藏号C9-4-33)、PC3M(保藏号C9_4_32)，乳腺癌细 胞系MCF-7 (保藏号C9-3-31)，肺癌细胞系A549 (保藏号C9_3_32)，喉癌细胞系L02 (保 藏号C9-3-33)，肝癌细胞系7721 (保藏号C9_3_34)，正常肌肉细胞系C2C12(保藏号 C9-1-31)，血管内皮细胞系ECV304(保藏号C9_1_32)分别以6X 105细胞/孔接种6孔板， 第2天(约为1X106细胞)分别以100M0I、50M0I、25M0I、5M0I、1M0I和0M0I重组腺病毒 Ad-pSh-PPT-EGFP和Ad-pSh-cmv-EGFP感染细胞，感染后4h换液。于感染后48h，72h和96h 荧光显微镜观察及流式检测EGFP的表达(如表3、4、5所示)。以100M0I组为例，PC3M细胞感染后48h，对照组EGFP的表达效率90. 86%，而实 验组的表达效率为28. 79% ；72h对照组为97. 15%，而实验组为49. 01%。DU145细胞感染 后48h，对照组EGFP的表达效率64. 52 %，而实验组的表达效率为47. 76% ；72h对照组为 95. 95%，而实验组为56. 73%。而在7721细胞及其他细胞中，实验组EGFP的表达效率均低 于10%。表明PPTp启动子具有前列腺癌特异性，且其启动效率较高。表3不同M0I重组腺病毒感染PC3M细胞后，EGFP表达检测结果 表4不同M0I重组腺病毒感染DU145细胞后，EGFP表达检测结果 表5 100 M0I重组腺病毒感染7721和IfepG2细胞后72h，EGFP表达检测结果 实施例6Ad-psh-cmv-PL-ppt-ElA-GM在前列腺癌细胞中蛋白的表达其方法是将重组腺病毒Ad-psh-cmv-PL-ppt-ElA-GM 和 Ad-psh-cmv-PL 以 50M0I 感染前列腺癌细胞PC3M和DU145，感染后4h换液。于感染后48h收集细胞上清，ELISA法 测定细胞GM-CSF含量；同时，收集细胞，提取细胞蛋白，Western-blot测定PSA-IZ-⑶40L 的表达。GM-CSF的检测结果如表6所示，在前列腺癌细胞系PC3M和DU145细胞中， Ad-psh-cmv-PL-ppt-ElA-GM 能有效表达 GM-CSF ；而对照病毒 Ad-psh-cmv-PL 虽然也有 GM-CSF的分泌，但含量很低。融合蛋白PSA-IZ-CD40L的Western-blot检测结果如附图7所示，结果表明，病毒 感染PC3M细胞和DU145蛋白均有融合蛋白的表达。表6重组腺病毒感染前列腺癌细胞后GM-CSF分泌表达的检测 实施例7前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒体外溶瘤效果评价
其方法是以溶瘤腺病毒Ad-pSh-cmv-PL-ppt-ElA-GM感染各种前列腺癌细胞系和 非前列腺癌细胞系，形态学观察细胞病变；MTT法检测细胞存活；RT-PCR检测复制相关基因 E1A的表达。(1)形态学观察前列腺癌细胞病变情况将PC3M细胞和DU145细胞分别以6X 105细胞/孔接种6孔板。第二天将腺病毒 分别以100M0I、50M0I和10M0I感染细胞，感染后24h、48h、72h和96h分别观察细胞形态的 改变。结果表明，100M0I感染后72h，部分细胞开始变圆，出现病变的迹象；感染后96h，细 胞出现明显病变，而对照组则没有出现。收集细胞，以便进行E1A表达的检测。(2)MTT法检测病毒感染细胞的存活情况将PC3M细胞、DU145细胞分别以1 X 104细胞/孔接种96孔板、接种后第二天分别 以0. 1M0I、0. 5M0IUM0I和5M0I感染细胞，感染后5d分别采用MTT法检测细胞存活状况。 结果结果如表7，图8所示。表7 MTT法检测5M0I病毒感染6d后各细胞存活情况
细胞名称PC3MLNCaPDU1457721A549存活率 死亡率0. 4824 0. 51760. 5074 0. 49250. 5877 0. 41220. 9771 0. 02280. 9610 0. 0389(3) RT-PCR 检测 E1A 表达为了检测腺病毒复制启动基因E1A的表达情况，设计以下引物。提取(1)收集得 到的细胞RNA，然后进行PCR检测，重组腺病毒感染前列腺癌细胞后，能够表达腺病毒复制 启动基因E1A。综上所述，我们成功构建了具有免疫和溶瘤双重功能的重组腺病毒，并证实免疫 基因能够得到有效表达，其对前列腺癌细胞具有较强的溶瘤作用。首先，通过构建PPTp调控EGFP表达的重组腺病毒，我们对该启动子的启动效率和 特异性进行了评价，结果表明该启动子能够在前列腺癌细胞中有效启动报告基因的表达， 且其表达效率较高；但在已经检测的多种非前列腺癌细胞中没有明显的表达。其次，分别通 过Western-blot和ELISA检测了 PSA-IZ-CD40L蛋白和GM-CSF的表达，结果表明，构建的 重组腺病毒能够在293细胞和前列腺癌细胞中有效表达目的基因。再次，采用大体观察和 MTT法分别对病毒的溶瘤效果进行了检测，结果表明，该病毒对前列腺癌细胞具有较强的杀 伤作用；但对非前列腺癌细胞的杀伤作用不明显。重组腺病毒对前列腺癌细胞的溶瘤作用是通过腺病毒不断复制实现的，在腺病毒 不断复制的过程中，免疫基因能够得到有效表达，使得局部的免疫蛋白浓度增高，激活全身 抗肿瘤免疫反应，进而杀灭肿瘤局部和已经发生转移的肿瘤细胞。因此，预计该重组腺病毒 不但对原发前列腺癌细胞具有杀伤作用，对于复发或已发生转移的前列腺癌患者也具有良 好效果。序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
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<120> 一种前列腺癌靶向免疫溶瘤双功能腺病毒的制备及其应用<130><160>40<170>PatentIn version3. 2<210>1<211>25<212>DNA<213><400>1
catgttcaca ttagtacacc ttgcc 25<210>2<211>21<212>DNA<213><400>2
gctgccttat tctgggtttg g 21<210>3<211>38<212>DNA<213><400>3
cggggcggcc gcgatgaaga tattatcttc atgatctt 38<210>4<211>38<212>DNA<213><400>4
ggaaaaaata atttttcaag gatgtttgta aagcaggc 38<210>5<211>22<212>DNA<213><400>5
ttgccttcta aaatgagttg gg 22
14
<210>6<211>22<212>DNA<213><400>6
gctgagacca tgccattaca ct 22<210>7<211>43<212>DNA<213><400>7
caaacatcct tgaaaaatta ttttttcctt taacctttca aac 43<210>8<211>40<212>DNA<213><400>8
ccctgggcac ttaaaacaac aaaaaaatct agttgtatag 40<210>9<211>25<212>DNA<213><400>9
gggaagattt agaagattca ggcaa 25<210>10<211>25<212>DNA<213><400>10
atttcaccat gattagtgac caagg 25<210>11<211>39<212>DNA<213>
<400>11
gatttttttg ttgttttaag tgcccagggc aaggtgagg 39<210>12<211>37<212>DNA<213><400>12
gggcgaattc agctttgttc cgggaccaaa taccttg 37<210>13<211>720<212>DNA<213><400>13
cggggcggcc gcgatgaaga tattatcttc atgatcttgg attgaaaaca gacctactct 60 ggaggaacat attgtatcga ttgtccttga cagtaaacaa atctgttgta agagacatta 120 tctttattat ctaggacagt aagcaagcct ggatctgaga gagatatcat cttgcaagga 180 tgcctgcttt acaaacatcc ttgaaaaatt attttttcct ttaacctttc aaactcaagg 240 aaaaccagtt ggccttgact ctgtttgtgg aaaattttaa actactggtt taatttcttt 300 attggttgta atatgactat tttacgtcat ataacaattt ttattgtttg ttaaatgact 360 ttattgtttg tcatatgata attttatgtc atagaacaat ttttattgct tgatatatga 420 ctttattgtt atatggctat acaactagat ttttttgttg ttttaagtgc ccagggcaag 480 gtgaggtcag ttcttaaatt cctgattaca ttcagatcca gtgtgatttt gtttgacctt 540 tgtcttgact taacgtcagc agggccaatt tttatgtatt tatgtaaata ttgaaaaaaa 600 tgttggcaca attttaagac aaacacaaag ggagattctt ataaaggctt ctcaggtggt 660
gggcaagagt tgggcaaaaa aatcaaggta tttggtcccg gaacaaagct gaattcgccc 720<210>14<211>30<212>DNA<213><400>14
cggcggtacc atgtgggtcc cggttgtctt 30 <210>15
<211>22<212>DNA<213><400>15<210>16<211>25<212>DNA<213><400>16<210>17<211>25<212>DNA<213><400>17<210>18<211>31<212>DNA<213><400>18<210>19<211>31<212>DNA<213><400>19<210>20<211>31<212>DNA<213><400>20
ggggttggcc acgatggtgt cc 22
taaacaaaga ggagacgaag aaaga 25
gttataaata ggcagttaac agggg 25
atgcaaaaag gtgatcagaa tcctcaaatt g 31
taccggggga ctttagccag aggctggcta t 31tatagccagc ctctggctaa agtcccccgg t 31<210>21<211>31<212>DNA<213><400>21
ccgcgatatc gggcttaacc gctgtgctgt a 31<210>22<211>30<212>DNA<213><400>22
caaggacacc atcgtggcca accccggagg 30<210>23<211>50<212>DNA<213><400>23
tcttgtcctc gatttgcttc atcctgctgc cgccacctcc ggggttggcc 50<210>24<211>50<212>DNA<213><400>24
tgaagcaaat cgaggacaag atcgaggaga tcctgagcaa gatctaccac 50<210>25<211>50<212>DNA<213><400>25
ttcttgatgc gggcgatctc gttctcgatg tggtagatct tgctcaggat 50<210>26<211>50<212>DNA
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<213><400>26
gatcgcccgc atcaagaagc tgatcggcga gaggctgctg atgcaaaaag 50<210>27<211>41<212>DNA<213><400>27
caatttgagg attctgatca cctttttgca tcagcagcct c 41<210>28<211>1445<212>DNA<213><400>28cggcggtacc atgtgggtcc cggttgtctt cctcaccctg tccgtgacgt ggattggtgc 60 tgcacccctc atcctgtctc ggattgtggg aggctgggag tgcgagaagc attcccaacc 120 ctggcaggtg cttgtggcct ctcgtggcag ggcagtctgc ggcggtgttc tggtgcaccc 180 ccagtgggtc ctcacagctg cccactgcat caggaacaaa agcgtgatct tgctgggtcg 240 gcacagcctg tttcatcctg aagacacagg ccaggtattt caggtcagcc acagcttccc 300 acacccgctc tacgatatga gcctcctgaa gaatcgattc ctcaggccag gtgatgactc 360 cagccacgac ctcatgctgc tccgcctgtc agagcctgcc gagctcacgg atgctgtgaa 420 ggtcatggac ctgcccaccc aggagccagc actggggacc acctgctacg cctcaggctg 480 gggcagcatt gaaccagagg agttcttgac cccaaagaaa cttcagtgtg tggacctcca 540 tgttatttcc aatgacgtgt gtgcgcaagt tcaccctcag aaggtgacca agttcatgct 600 gtgtgctgga cgctggacag ggggcaaaag cacctgctcg ggtgattctg ggggcccact 660 tgtctgtaat ggtgtgcttc aaggtatcac gtcatggggc agtgaaccat gtgccctgcc 720 cgaaaggcct tccctgtaca ccaaggtggt gcattaccgg aagtggatca aggacaccat 780 cgtggccaac cccggaggtg gcggcagcag gatgaagcaa atcgaggaca agatcgagga 840 gatcctgagc aagatctacc acatcgagaa cgagatcgcc cgcatcaaga agctgatcgg 900 cgagaggctg ctgatgcaaa aaggtgatca gaatcctcaa attgcggcac atgtcataag 960 tgaggccagc agtaaaacaa catctgtgtt acagtgggct gaaaaaggat actacaccat 1020 gagcaacaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg accgttaaaa gacaaggact 1080 ctattatatc tatgcccaag tcaccttctg ttccaatcgg gaagcttcga gtcaagctcc 1140 atttatagcc agcctctggc taaagtcccc cggtagattc gagagaatct tactcagagc 1200 tgcaaatacc cacagttccg ccaaaccttg cgggcaacaa tccattcact tgggaggagt 1260 atttgaattg caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg actgatccaa gccaagtgag 1320 ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc tgaacagtgt caccttgcag 1380
gctgtggtgg agctgacgct gggagtcttc ataatacagc acagcggtta agcccgatat 1440
cgcgg 1445<210>29<211>13599<212>DNA〈213〉<400>29
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt ttgtgacgtg 70 gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt gatgttgcaa gtgtggcgga 140 acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa 210 ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc 280 gggaaaactg aataagagga agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa nnnntaatag 350 taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgttacataactt acggtaaatg 420 gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 490 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 560 caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 630 cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 700 ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 770 caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 840 actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt 910 agtgaaccgt cagatccgct agagatctgg taccatgtgg gtcccggttg tcttcctcac cctgtccgtg 980 acgtggattg gtgctgcacc cctcatcctg tctcggattg tgggaggctg ggagtgcgag aagcattccc 1050 aaccctggca ggtgcttgtg gcctctcgtg gcagggcagt ctgcggcggt gttctggtgc acccccagtg 1120 ggtcctcaca gctgcccact gcatcaggaa caaaagcgtg atcttgctgg gtcggcacag cctgtttcat 1190 cctgaagaca caggccaggt atttcaggtc agccacagct tcccacaccc gctctacgat atgagcctcc 1260 tgaagaatcg attcctcagg ccaggtgatg actccagcca cgacctcatg ctgctccgcc tgtcagagcc 1330 tgccgagctc acggatgctg tgaaggtcat ggacctgccc acccaggagc cagcactggg gaccacctgc 1400 tacgcctcag gctggggcag cattgaacca gaggagttct tgaccccaaa gaaacttcag tgtgtggacc 1470 tccatgttat ttccaatgac gtgtgtgcgc aagttcaccc tcagaaggtg accaagttca tgctgtgtgc 1540
21tggacgctgg acagggggca aaagcacctg ctcgggtgat tctgggggcc cacttgtctg taatggtgtg 1610
cttcaaggta tcacgtcatg gggcagtgaa ccatgtgccc tgcccgaaag gccttccctg tacaccaagg 1680
tggtgcatta ccggaagtgg atcaaggaca ccatcgtggc caaccccgga ggtggcggca gcaggatgaa 1750
gcaaatcgag gacaagatcg aggagatcct gagcaagatc taccacatcg agaacgagat cgcccgcatc 1820
aagaagctga tcggcgagag gctgctgatg caaaaaggtg atcagaatcc tcaaattgcg gcacatgtca 1890
taagtgaggc cagcagtaaa acaacatctg tgttacagtg ggctgaaaaa ggatactaca ccatgagcaa 1960
caacttggta accctggaaa atgggaaaca gctgaccgtt aaaagacaag gactctatta tatctatgcc 2030
caagtcacct tctgttccaa tcgggaagct tcgagtcaag ctccatttat agccagcctc tggctaaagt 2100
cccccggtag attcgagaga atcttactca gagctgcaaa tacccacagt tccgccaaac cttgcgggca 2170
acaatccatt cacttgggag gagtatttga attgcaacca ggtgcttcgg tgtttgtcaa tgtgactgat 2240
ccaagccaag tgagccatgg cactggcttc acgtcctttg gcttactcaa actctgaaca gtgtcacctt 2310
gcaggctgtg gtggagctga cgctgggagt cttcataata cagcacagcg gttaagcccg atatccgatc 2380
caccggatct agataactga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 2450
ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag 2660
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 2800
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gcggccgcga tgaagatatt atcttcatga2520
tcttggattg aaaacagacc tactctggag gaacatattg tatcgattgt ccttgacagt aaacaaatct2590
gttgtaagag acattatctt tattatctag gacagtaagc aagcctggat ctgagagaga tatcatcttg 2730
caaggatgcc tgctttacaa acatccttga aaaattattt tttcctttaa cctttcaaac tcaaggaaaa 2870
ccagttggcc ttgactctgt ttgtggaaaa ttttaaacta ctggtttaat ttctttattg gttgtaatat 2940
gactatttta cgtcatataa caatttttat tgtttgttaa atgactttat tgtttgtcat atgataattt 3010
tatgtcatag aacaattttt attgcttgat atatgacttt attgttatat ggctatacaa ctagattttt 3080
ttgttgtttt aagtgcccag ggcaaggtga ggtcagttct taaattcctg attacattca gatccagtgt 3150
gattttgttt gacctttgtc ttgacttaac gtcagcaggg ccaattttta tgtatttatg taaatattga 3220
aaaaaatgtt ggcacaattt taagacaaac acaaagggag attcttataa aggcttctca ggtggtgggc 3290
aagagttggg caaaaaaatc aaggtatttg gtcccggaac aaagctgaat tcatgagaca tattatctgc 3360
cacggaggtg ttattaccga agaaatggcc gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg 3430
ataatcttcc acctcctagc cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc 3500
ccccgaagat cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 3570
gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc cggcagcccg 3640
agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta ccggaggtga tcgatcttac3710
ctgccacgag gctggctttc cacccagtga cgacgaggat gaagagggtg aggagtttgt gttagattat 3780
gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta 3850
tgtgttcgct ttgctatatg aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg 3920
tgatagagtg gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt 3990
gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt ctgaacctga gcctgagccc gagccagaac cggagcctgc 4060
aagacctacc cgccgtccta aaatggcgcc tgctatcctg agacgcccga catcacctgt gtctagagaa 4130
tgcaatagta gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc 4200
cgctgtgccc cattaaacca gttgccgtga gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat gtatcgagga 4270
cttgcttaac gagcctgggc aacctttgga cttgagctgt aaacgcccca ggccataagg tgtaaacctg 4340
tgattgcgtg tgtggttaac gcctttgttt gctgaatgag ttgatgtaag tttaataaag ggtgagataa 4410
tgtttaactt gcatggcgtg ttaaatgggg cggggcttaa agggtatata atgcgccgtg ggctaatctt 4480
ggttacatct gacctcacta gtatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg gcactgtggc ctgcagcatc 4550
tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc4620
ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat 4690
gtttgacctc caggagccga cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc 4760
ctcaccaagc tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg 4830
aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact ttctgcttgt 4900
catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagtc gacgaattaa ttcgctgtct gcgagggcca 4970
gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa 5040
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aagacaatct ttttgttgtc aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact tgagtgacaa 5180
tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac tgcaggtcga gcatgcatct5250
agggcggcca attccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 5320
ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa 5390
cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt 5460
tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg 5530
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caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 5740
tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac 5810 gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca actcgacgag ttttataaag gataaatgga 5880 gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggttgt5950 gagacacaag aatcgcctgc tactgttgtc ttccgtccgc ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag 6020 cagcagcagg aggaagccag gcggcggcgg caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc 6090 ctcgggaatg aatgttgtac aggtggctga actgtatcca gaactgagac gcattttgac aattacagag 6160 gatgggcagg ggctaaaggg ggtaaagagg gagcgggggg cttgtgaggc tacagaggag gctaggaatc6230 tagcttttag cttaatgacc agacaccgtc ctgagtgtat tacttttcaa cagatcaagg ataattgcgc 6300 taatgagctt gatctgctgg cgcagaagta ttccatagag cagctgacca cttactggct gcagccaggg6370 gatgattttg aggaggctat tagggtatat gcaaaggtgg cacttaggcc agattgcaag tacaagatca 6440 gcaaacttgt aaatatcagg aattgttgct acatttctgg gaacggggcc gaggtggaga tagatacgga 6510 ggatagggtg gcctttagat gtagcatgat aaatatgtgg ccgggggtgc ttggcatgga cggggtggtt 6580 attatgaatg taaggtttac tggccccaat tttagcggta cggttttcct ggccaatacc aaccttatcc 6650 tacacggtgt aagcttctat gggtttaaca atacctgtgt ggaagcctgg accgatgtaa gggttcgggg 6720 ctgtgccttt tactgctgct ggaagggggt ggtgtgtcgc cccaaaagca gggcttcaat taagaaatgc 6790 ctctttgaaa ggtgtacctt gggtatcctg tctgagggta actccagggt gcgccacaat gtggcctccg 6860 actgtggttg cttcatgcta gtgaaaagcg tggctgtgat taagcataac atggtatgtg gcaactgcga 6930 ggacagggcc tctcagatgc tgacctgctc ggacggcaac tgtcacctgc tgaagaccat tcacgtagcc 7000 agccactctc gcaaggcctg gccagtgttt gagcataaca tactgacccg ctgttccttg catttgggta 7070 acaggagggg ggtgttccta ccttaccaat gcaatttgag tcacactaag atattgcttg agcccgagag 7140 catgtccaag gtgaacctga acggggtgtt tgacatgacc atgaagatct ggaaggtgct gaggtacgat 7210 gagacccgca ccaggtgcag accctgcgag tgtggcggta aacatattag gaaccagcct gtgatgctgg 7280 atgtgaccga ggagctgagg cccgatcact tggtgctggc ctgcacccgc gctgagtttg gctctagcga 7350 tgaagataca gattgaggta ctgaaatgtg tgggcgtggc ttaagggtgg gaaagaatat ataaggtggg 7420 ggtcttatgt agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag caccaactcg tttgatggaa 7490 gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc7560 cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc aaactctact accttgacct acgagaccgt gtctggaacg 7630 ccgtiggageL ctgcagcctc cgccgccgct tcagccgctg cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact 7700 ttgctttcct gagcccgctt gcaagcagtg cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc 7770 tcttttggca caattggatt ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt ggatctgcgc 7840CN 101928696 A
说明书
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cagcaggttt ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa cataaataaa aaaccagact 7910
ctgtttggat ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta tttaggggtt ttgcgcgcgc ggtaggcccg 7980
ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct gtgtattttt tccaggacgt ggtaaaggtg actctggatg 8050
ttcagataca tgggcataag cccgtctctg gggtggaggt agcaccactg cagagcttca tgctgcgggg 8120
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tcatgttgtg cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca cttgggaaat ttgtcatgta gcttagaagg 8400
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ggctttcgct gtacggcagt agtcggtgct cgtccagacg ggccagggtc atgtctttcc acgggcgcag 9170
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ctcggtgacg aaaaggctgt ccgtgtcccc gtatacagac ttgagaggga gtttaaacga attcaatagc 9660
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cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat taaaaagcac caccgacagc tcctcggtca tgtccggagt 10010
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cggcggtacc atgtgggtcc cggttgtctt 30
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cgggggtacc gatgaagata ttatcttcat gatctt 36
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gcagctcgag atggtgagca agggcgag 28
CN
[0351 [0352 [0353 [0354 [0355
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85
[0380 [0381 [0382 [0383 [0384 [03
29gacgaagctt ttatctagat ccggtgga 28
权利要求
一种用于前列腺癌治疗的重组腺病毒，其特征在于以stratagene公司的Adeasy载体系统为基础，用前列腺癌特异性启动子序列替换天然的E1A启动子；用免疫激活分子的cDNA序列替换E1B19K序列，并在免疫激活分子cDNA序列和E1B55K cDNA序列之间插入核糖体内部进入位点IRES序列；在包装信号ES和E1区之间插入前列腺特异性抗原和CD40L胞外区的融合蛋白PSA IZ CD40L表达框。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于腺病毒复制调控区域包括前列腺癌 特异性启动子和腺病毒El区复制起始基因，其所说的腺病毒El区复制起始基因位于前列 腺癌特异性启动子的下游。
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于前列腺癌特异性启动子PPTp具有序 列表中序列13所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于免疫激活分子为人粒细胞_巨噬细 胞集落刺激因子GM-CSF，并可方便替换为其他分子。
5.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于免疫基因PSA-IZ-⑶40L和GM-CSF 的共表达。
6.根据权利要求5所述的重组腺病毒，其特征在于免疫基因PSA-IZ-⑶40L具有序列表 中序列28所述的核苷酸序列和序列30所述的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于该腺病毒载体的构建方法是将携 带目的基因的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒AdEasy-I在细菌内同源重组获得重组腺病毒质 粒；PacI线性化后转染到293细胞制备得到重组腺病毒。
8.权利要求1-7任一项所述的重组腺病毒在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
全文摘要
一种前列腺癌靶向腺病毒的制备及应用，本发明涉及生物技术和基因治疗领域的一种前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能重组腺病毒载体系统的建立，及其在前列腺癌细胞中目的基因的表达、病毒特异性复制及溶瘤功能的验证。该腺病毒可以在前列腺癌细胞中大量复制，进而破坏肿瘤细胞；而不断复制的重组腺病毒，可高效表达PSA-IZ-CD40L和GM-CSF，进而激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。这种免疫反应不但能够有效配合肿瘤局部的溶瘤作用，而且可以通过全身免疫反应杀伤发生转移的前列腺癌细胞。
文档编号C12N7/01GK101928696SQ200810182688
公开日2010年12月29日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年9月27日
发明者吴祖泽, 杨月峰, 王 华, 王立生 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所