89. -种从生物体的生物样品确定第一甲基化型态的方法，所述生物样品包括包含源 自第一组织和第二组织的游离DNA分子的混合物的游离DNA，所述方法包含： 从所述生物样品分析多个DNA分子，其中分析DNA分子包括： 确定所述生物体的基因组中所述DNA分子的位置； 确定所述DNA分子的基因型； 确定所述DNA分子在一或多个位点是否甲基化； 鉴别多个第一基因座，其满足与所述第一组织的第一基因组相应的第一等位基因和相 应的第二等位基因是杂合的并且所述第二组织的第二基因组相应的第一等位基因是纯合 的； 对于所述第一基因座中的每一者： 对于与所述基因座相关的一或多个位点的每一者： 确定在所述位点上甲基化并对应于所述基因座的所述相应第二等位基因的DNA分子 的数目； 基于在所述基因座的所述一或多个位点上甲基化并对应于所述基因座的所述相应第 二等位基因的DNA分子的所述数目以计算甲基化密度； 从所述第一基因座的所述甲基化密度产生所述第一组织的所述第一甲基化型态。
90. 如权利要求89所述的方法，其中所述生物样品来自怀有胎儿的女性个体，并且其 中所述第一组织来自所述胎儿或胎盘并且所述第二组织对应于所述女性个体。
91. 如权利要求89所述的方法，其中所述位点对应于CpG位点。
92. 如权利要求89所述的方法，其中每个基因座包括至少一个CpG位点。
93. 如权利要求89所述的方法，其中每个基因座靠近至少一个CpG位点。
94. 一种用于分析生物样品中的胎儿DNA的试剂盒，所述生物样品含有胎儿DNA和来自 怀有胎儿的女性个体的DNA的混合物，所述试剂盒包含： 一或多种寡核苷酸能与表S2A、S2B、S2C、S2D、S3A、S3B、S3C和S3D中的所列的基因组 区域的至少一部分特定性杂交。
95. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述寡核苷酸中，至少一种是与所述基因组 某一区域的至少一部分相对应的引物。
96. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述寡核苷酸中，至少一种是与所述基因组 某一区域的至少一部分相对应的探针。
97. 如权利要求94所述的试剂盒，其进一步包含： 一或多种甲基化敏感性限制酶。
98. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种甲基化敏感性限制酶中，至少 一种切割低甲基化的DNA分子。
99. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种甲基化敏感性限制酶中，至少 一种切割高甲基化的DNA分子。
100. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S2A〇
101. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S2B〇
102. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S2C〇
103. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S2D〇
104. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S3A〇
105. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S3B〇
106. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S3C〇
107. 如权利要求94所述的试剂盒，其中在所述一或多种寡核苷酸中，至少一种是选自 表S3D〇
108. -种评估生物体的生物样品中DNA的甲基化水平的方法，所述方法包含： 对于多个尺寸中的每个尺寸： 测量与所述尺寸相对应的来自所述生物样品的多个DNA片段的量； 基于多个尺寸下DNA片段的所述量，用计算机系统计算第一参数的第一值，所述第一 参数提供所述生物样品中DNA片段的尺寸型态的统计量度； 将所述第一尺寸值与参考尺寸值比较，所述参考尺寸值由参考样品的DNA片段计算； 以及 基于所述比较评估所述甲基化水平。
109. 如权利要求108所述的方法，其中测量与所述尺寸相对应的DNA片段的量包括： 对于来自所述生物样品的所述多个DNA片段的每一者： 测量所述DNA片段的尺寸， 其中测量DNA片段的尺寸包括： 对所述DNA片段进行双末端测序以获得成对序列读数； 将所述成对序列读数与参考基因组比对；以及 使用所述比对位置确定所述DNA片段的所述尺寸。
110. 如权利要求109所述的方法，其中通过只从与特定区域比对的DNA片段确定所述 第一尺寸值，所述甲基化水平对应于所述特定区域。
111. 如权利要求108所述的方法，其中测量与所述尺寸相对应的DNA片段的量包括使 用电泳。
112. 如权利要求108所述的方法，其中所述参考样品是在所述生物样品的之前从所述 生物体中所获得，其中所述评估的甲基化水平是指与所述第一尺寸值相对于所述参考尺寸 值所增加或降低的量相对应的相对水平。
113. 如权利要求108所述的方法，其中所述参考尺寸值是校准曲线的一部分。
114. 如权利要求108所述的方法，其中所述甲基化水平是甲基化密度。
115. 如权利要求114所述的方法，其中所述甲基化密度是针对CpG位点。
116. -种从生物体的生物样品检测染色体异常的方法，所述生物样品包括包含源自第 一组织和第二组织的游离DNA分子的混合物的游离DNA，所述方法包含： 从所述生物样品分析多个DNA分子，其中分析DNA分子包括： 确定参考基因组中所述DNA分子的位置； 确定所述DNA分子在一或多个位点上是否甲基化； 对于多个位点中的每一者： 确定在所述位点上甲基化的DNA分子的相应数目； 基于所述第一染色体区域内的位点上甲基化的DNA分子的所述相应数目，计算第一染 色体区域的第一甲基化水平； 将所述第一甲基化水平与第一阈值比较； 基于所述比较确定所述第一组织中所述第一染色体区域的异常的分类。
117. 如权利要求116所述的方法，其中将所述第一甲基化水平与阈值比较包括： 将所述第一甲基化水平标准化并将所述标准化第一甲基化水平与所述阈值比较。
118. 如权利要求117所述的方法，其中所述标准化是指使用第二染色体区域的第二甲 基化水平进行标准化。
119. 如权利要求117所述的方法，其中所述标准化是指使用来自所述第一组织的游离 DNA的百分比浓度进行标准化。
120. 如权利要求116所述的方法，其中计算第一甲基化水平包括： 鉴别所述生物体的基因组的多个区域； 鉴别每一所述区域内的一或多个位点； 计算每个区域的区域甲基化水平，其中所述第一甲基化水平是针对第一区域，以及 其中将所述第一甲基化水平与第一阈值比较包括： 将每一所述区域甲基化水平与相应区域的阈值比较； 确定区域甲基化水平超出所述相应区域阈值的区域的第一数目；以及 将所述第一数目与阈值以确定所述分类。
121. 如权利要求120所述的方法，其中所述阈值是百分比，并且其中将所述第一数目 与阈值比较包括： 在与所述阈值比较前，将区域的所述第一数目除以区域的第二数目。
122. 如权利要求121所述的方法，其中区域的所述第二数目是指所鉴别的所述多个区 域全部。
123. 如权利要求120所述的方法，其中所述相应区域阈值是来自参考甲基化水平的指 定量。
124. 如权利要求116所述的方法，其中所述生物样品来自怀有胎儿的女性个体，其中 所述第一组织来自胎儿或胎盘并且所述第二组织来自所述女性个体，并且其中所述染色体 异常是胎儿染色体异常。
125. 如权利要求116所述的方法，其中所述阈值是指基于与来自所述女性个体的所述 第二组织的DNA相关的背景甲基化水平。
126. 如权利要求124所述的方法，其中所述阈值从怀有无染色体异常的胎儿的其它女 性怀孕个体针对所述第一染色体区域确定。
127. 如权利要求124所述的方法，其中所述染色体异常是指第21对染色体三体症或第 18对染色体三体症或第13对染色体三体症或特纳综合症（Turnersyndrome)或克氏综合 症（Klinefeltersyndrome)〇
128. 如权利要求116所述的方法，其中所述第一组织来自所述生物体内的肿瘤并且所 述第二组织来自所述生物体的非恶性组织。
129. 如权利要求116所述的方法，其中所述阈值由未患癌症的其它生物体确定。
130. 如权利要求116所述的方法，其中阈值是基于所述生物样品中源自所述第一组织 的游离DNA的浓度。
131. 如权利要求130所述的方法，其中所述阈值是基于与异常类型相对应的比例因 子，其中所述异常类型是缺失或重复。
132. 如权利要求116所述的方法，其中确定所述DNA分子在参考基因组中所在的所述 位置包括确定所述位置是否在所述第一染色体区域内。
133. 如权利要求132所述的方法，其中确定所述DNA分子在所述参考基因组中所在的 所述位置是通过确定所述DNA分子是否比对到所述第一染色体区域内来实现。
134. 如权利要求116所述的方法，其中所述染色体异常是亚染色体缺失或亚染色体重 复或迪乔治综合症OiGeorgesyndrome) 〇
【专利摘要】本实施例提供了测定并使用各种组织和样品的甲基化型态的系统、方法和设备。因阐述发明的需要，我们提供了相关的实例说明。基于血浆DNA甲基化(或具有游离DNA的其它样品，例如尿液、唾液、生殖器洗涤液等)与母亲/患者的甲基化型态的比较来推断胎儿/肿瘤组织的甲基化型态。当样品具有DNA混合物时，可以使用组织特定的等位基因以鉴别来自胎儿/肿瘤的DNA，来确定胎儿/肿瘤组织的甲基化型态。甲基化型态可以用于确定胎儿/肿瘤的基因组中的拷贝数变异。通过各种技术鉴别出胎儿的甲基化标记物。可以通过确定DNA片段的尺寸分布的尺寸参数来确定甲基化型态，其中所述尺寸参数的参考值可以用于确定甲基化水平。另外，甲基化水平可以用于确定癌症等级。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104781422
【申请号】CN201380058654
【发明人】赵慧君, 陈君赐, 卢煜明, 伦妙芬, 江培勇, 陈渭雯
【申请人】香港中文大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年9月20日
【公告号】CA2884066A1, EP2898100A1, WO2014043763A1