Survivin启动子调控CD基因的重组腺病毒载体构建及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种重组腺病毒，这种重组腺病毒包含了胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因），所述的CD基因受本发明设计的一种Survivin启动子控制。更具需要进一步的公开了这种重组腺病毒的制备方法，并将重组腺病毒应用于治疗癌症的药物。本发明提供的重组腺病毒，对肿瘤细胞有很好的特异性，在启动肿瘤细胞的自杀程序的同时，并不影响正常细胞的存活。
【专利说明】Survivin启动子调控CD基因的重组腺病毒载体构建及其
应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组腺病毒，更具体地，涉及一种存活素(survivin)启动子靶向性调控自杀基因胞喃唳脱氨酶(cytosine deaminase,⑶)的重组腺病毒载体构建，以及该重组腺病毒在抗肿瘤治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002]癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，也是当今科学研究面临的重大难题之一。传统的治疗方法难以根除肿瘤且伴随着严重的副作用。随着生命科学的不断发展，基因治疗有望成为取代传统肿瘤治疗的的一个新手段。而基因治疗能否成功应用于临床实践的关键问题是治疗的靶向性，良好的靶向性才能保证治疗的安全性和有效性。
[0003]作为凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin基因是在1997年由Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-1 (EPR-1) cDNA在人类基因组文库的杂交筛选中首次分离出的。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis, IAP)家族的成员，正常情况下它仅表达于人类的胚胎组织，在除甲状腺、胸腺及生殖腺以外的分化成熟的成人组织中几乎无表达，另外，它过表达于绝大多数常见的恶性肿瘤组织如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、何杰金氏病、黑色素瘤等，而在这些癌组织中相对应的正常组织并不表达Survivin，具有高度的肿瘤组织特异性。因此，利用survivin的这一特性进行肿瘤靶向性的治疗具有重要的研究价值。
[0004]5氟尿嘧啶(5-FU)是临床应用较为广泛的抗肿瘤化疗药物，其在体内的代谢产物5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸(FdUMP)能够抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性，导致dTTP池的耗尽，而最终抑制DNA的合成，达 到杀死肿瘤细胞的目的。5-FU可由5氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转化而来，而这一过程可由某些微生物的胞嘧唳脱氨酶(cytosine deaminase,⑶)进行催化。CD由于能将原本无毒的前体药物5-FC转化成具有细胞毒性的化疗药物5-FU，因此又被称为前药基因或者自杀基因，基于这一原理，当前发展了一种CD/5-FC自杀基因系统用于抗肿瘤治疗的研究。
[0005]⑶/5-FC系统相较于另一种自杀基因系统——单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplex virus thymidine kinase, HSV-TK)/更昔洛韦(ganciclovir, GCV),有更强的旁观者效应，这是由于5-FU不需要细胞间隙连接通讯来杀伤未转化的临近肿瘤细胞,而细胞间隙连接通讯在肿瘤细胞中往往是下调或者缺失的。另外，免疫因素也参与了⑶/5-FC系统杀伤肿瘤的作用:一方面经CD/5-FC途径作用后，部分死亡的肿瘤细胞能够刺激机体产生急性炎症反应，导致各种免疫效应因子在肿瘤局部积聚，从而有助于免疫细胞的浸润?’另一方面随着部分肿瘤细胞的死亡，增加了肿瘤抗原的免疫原性，有助于免疫系统对肿瘤的识别和杀伤。
[0006]但是在缺乏表达特异性的情况下，CD/5-FC不仅能够杀伤肿瘤细胞，也会作用于正常细胞，对正常组织造成严重损伤，因此难以在肿瘤患者身上取得理想疗效。为了使治疗基因⑶能够选择性地表达于肿瘤细胞中，从而提高肿瘤治疗靶向性，保护正常组织，应用肿瘤组织特异性的启动子来介导治疗基因的表达是实现这一目的的有效手段。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一为提供一种启动子，来调控基因CD能特异性的选择肿瘤细胞，提高肿瘤治疗的靶向性。
[0008]根据以上发明目的，首先提供一种Survivin启动子，所述的启动子的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。
[0009]根据需求再提供一种胞嘧啶脱氨酶基因，所述的胞嘧啶脱氨酶基因受上述的Survivin启动子调控。
[0010]更进一步的提供一种重组腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒包含了根据上述的胞嘧啶脱氨酶基因。
[0011]更具体地，提供一种受survivin启动子调控的⑶自杀基因的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤:
51.克隆survivin启动子:设计引物，通过PCR的方法从BEL-7402细胞的基因组中扩增survivin启动子片段,克隆到pGEM_T载体中构建成重组质粒pT_SP,并进行序列分析；
52.构建survivin启动子调控绿色荧光蛋白GFP的报告质粒:用限制性内切酶AseI和Nhe I双切pT-SP和pEGFP-Nl质粒，回收survivin启动子和pEGFP-Nl质粒大片段进行连接，构建成重组质粒pSP-EGFP ；
53.克隆CD基因:设计引物，以酵母基因组为模板扩增CD基因，克隆到pGEM-T载体中构建成重组质粒PT-⑶，并进行序列分析；
54.构建含survivin启动子和酵母⑶基因的重组腺病毒穿梭质粒:先利用限制性内切酶Sac I和Sal I双切pT_⑶和pSP-EGFP质粒，回收⑶基因和线性化的pSP-EGFP进行连接，构建成重组质粒PSP-⑶；然后利用限制性内切酶XbaI和SalI双切pSP-⑶质粒和PDC315穿梭质粒，回收SP-⑶片段和pDC315载体的大片段进行连接，构建成重组腺病毒穿梭质粒 PDC315-SP-CD ;
55.重组腺病毒Ad-SP-⑶的包装、扩增和纯化:将步骤S4所得的穿梭质粒PDC315-SP-CD与骨架质粒共转染HEK-293细胞，出现病斑后收集病毒利用HEK-293细胞进行病毒的扩增，层析纯化，即得受survivin启动子调控的CD自杀基因的重组腺病毒。
[0012]步骤SI所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ N0:4所示。
[0013]步骤S3所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:5所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ N0:6所示。
[0014]最后提供一种重组腺病毒在抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的重组腺病毒为根据上述的重组腺病毒或根据上述的制备方法制得的重组腺病毒。
[0015]所述的肿瘤为肝癌或宫颈癌。
[0016]本发明将survivin基因的肿瘤特异性与⑶/5_FC自杀基因系统的可控性结合起来，利用survivin基因的启动子调控前药基因CD的表达，以达到使其在正常组织细胞中不表达或极低表达，在肿瘤细胞中高表达的目的，从而大大增强自杀基因抗肿瘤的特异性，为肿瘤特异性的基因治疗提供了一种新的思路。
[0017]在基因治疗中，目的基因的有效传输是影响治疗效果的重要因素，目前常用的基因传输载体主要分为非病毒载体和病毒载体两大类，前者基于大分子材料，通过化学的方法将裸DNA、RNA或者真核表达质粒导入祀细胞内； 后者基于逆转录病毒(retrovirus,RV)、慢病毒体(lentivirus, LV)、腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)等整合型载体和腺病毒(adenovirus, AV)等非整合型载体，通过病毒介导的生物方法将目的基因导入靶细胞内。考虑到基因的传输效率，目前临床应用研究较多的还是病毒载体。由于病毒载体又分为整合型和非整合型两大类，考虑到安全性，我们采用了非整合型的腺病毒载体。腺病毒载体是一种线性双链DNA无包膜病毒，AV的基因由El (E1A、E1B)、E2A、E2B、E3、E4组成，El基因与AV的复制有关，El的去除可引起复制缺陷，也为治疗基因的插入腾出了空间。目前基因治疗中所应用的AV载体一般缺失整个ElA和部分ElB基因，必须由293细胞提供El蛋白才能复制出具有感染能力的病毒，这些重组病毒可在许多细胞中表达外源基因，却不能在El缺陷的细胞中复制，因此安全性较高。AV载体有广宿主性，能有效地感染非分裂状态的细胞，与RV相比，AV表达效价高，外源基因的容纳量。另外由于其DNA不能整合于靶细胞基因组中，因此没有致癌的危险。
[0018]综上所述，本发明的主要目的就是构建survivin启动子调控⑶自杀基因的重组腺病毒载体，并将其应用于抗肿瘤治疗。
[0019]本发明的优点如下所示:
1.构建一种受survivin启动子调控的⑶自杀基因的重组腺病毒，该腺病毒转染表达survivin蛋白的肿瘤细胞后才能够在细胞中相应转录因子的激活下诱导该启动子活化,从而表达出目的基因。而在正常细胞中，由于没有这种转录因子，因此survivin启动子就不会被活化，目的基因也就不能被表达，从而达到对肿瘤细胞的选择性杀伤。
[0020]2.本发明为治疗肿瘤提供了一个新的思路和方案。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为Survivin启动子PCR产物电泳分析。
[0022]图2为Ase I和Nhe I酶切后Survivin启动子和pEGFP-Nl质粒电泳分析。
[0023]图3为survivin启动子在不同细胞中启动报告基因GFP的表达情况。
[0024]图4为⑶基因的PCR产物电泳分析。
[0025]图5为Sac I和Sal I酶切后⑶基因和pSP-EGFP质粒电泳分析。
[0026]图6为SP-⑶片段酶切后电泳分析。
[0027]图7为重组腺病毒的包装。
[0028]图8为survivin启动子在不同细胞中启动⑶的表达情况。
[0029]图9为在人肝癌细胞株H印G2中survivin启动子调控的⑶能够有效地将5-FC转化为5-FU。
[0030]图10为survivin启动子调控的⑶能够在5_FC存在的情况下有效地诱导人肝癌细胞株H印G2的凋亡。
[0031]图11为survivin启动子调控的⑶联合5_FC对淋巴细胞的毒性检查。【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0033]实施例1:Survivin启动子的扩增
根据Genebank中survivin启动子的序列设计引物，并在引物中分别引入酶切位点Ase I 和 Nhe I ,
上游引物SEQ NO:3:
GGCATTAATTCTAGATCCCCAGCTCCCTTGTCTTCTTAT,
下游引物SEQ NO:4:
AATGCTAGCAGTAGAGGCGGGGCGGCGC。
[0034]用此引物以BEL-7402的基因组DNA为模板进行PCR扩增:94 V预变性5min ；94°C 40s, 55°C 50s, 72°C 50s，扩增35个循环后72°C延伸5min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到一个特异的条带(如图1)，其片段大小大概在700bp位置附近，与预期大小相符，将该片段胶回收后与PGEM-T载体连接，构建成重组质粒pT-SP，转化大肠杆菌DH5 α后挑取阳性克隆送公司测序分析，结果如SEQ NO:1所示，所克隆的survivin启动子序列正确。
[0035]实施例2:survivin启动子调控绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒的构建及表达活性检测使用Nhe I和Ase I限制性内切酶对pT_SP和pEGFP-Nl质粒进行消化，分别胶回收切下来的survivin启动子和切除了 CMV启动子的pEGFP-Nl质粒，回收之后电泳检测两者的浓度(图2)，然后过夜连接后转化`大肠杆菌，挑取克隆进行菌落PCR检测，确定阳性克隆后大提质粒备转染用。
[0036]利用Lipofectamine2000将pSP-EGFP质粒转染不同的细胞，包括人肝癌细胞株BEL-7402，人肝癌细胞株H印G2，人宫颈癌细胞株HeLa和非肿瘤细胞HEK-293。同时WpEGFP-Nl作为阳性对照，转染48h以后进行荧光观察。可以看出，在BEL-7402细胞中pSP-EGFP转染组的绿色荧光蛋白表达水平最高，在H印G2和HeLa细胞中也有明显的绿色荧光蛋白的表达，但是在非肿瘤细胞HEK-293中，荧光非常的弱(图3)，这一结果表明克隆的Survivin启动子在肿瘤细胞中能够有效地启动EGFP的表达。
[0037]实施例3:酵母细胞Cytosine deaminase (⑶)基因的克隆
根据Genebank中酿酒酵母CD基因的序列设计引物，并在引物中分别引入酶切位点Sac I 和 Sal I ,
上游引物 SEQ NO:5:atagagctcacgATGGTGACAGGGGGAATGGC,
下游引物 SEQ NO:6:cgcgtcgacCTACTCACCAATATCTTCAAACC。
[0038]用此引物以酿酒酵母细胞的基因组DNA为模板进行PCR扩增:94°C预变性IOmin ；940C 40s, 550C 50s, 72°C 50s，扩增35各循环后72°C延伸5min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到一个特异的条带(如图4)，其片段大小大概在500bp位置附近，与预期大小相符，将该片段胶回收后与PGEM-T载体连接，构建成重组质粒PT-⑶，转化大肠杆菌DH5 α后挑取阳性克隆送公司测序分析，结果如SEQ NO: 2所示，所克隆的⑶基因序列正确。
[0039]实施例4:survivin启动子调控⑶基因的穿梭载体构建
首先使用限制性内切酶Sac I和Sal I对质粒pSP-EGFP和pT_⑶进行酶切，回收⑶基因和线性化的pSP-EGFP (图5)，将两者进行4°C过夜连接，构建成重组质粒pSP-⑶，转化大肠杆菌后鉴定阳性克隆。
[0040]将阳性克隆放大培养后提取质粒pSP-⑶，利用限制性内切酶Xba I和Sal I对其进行酶切，然后电泳分离和胶回收SP-CD片段(图6)，得到的SP-CD片段连入穿梭载体PDC315的相应酶切位点中，构建成穿梭质粒PDC31-SP-CD。
[0041 ] 实施例5:重组腺病毒Ad-SP-⑶的包装、扩增和纯化
接种4X105个HEK-293细胞于6孔板中，待细胞生长至约90%可进行转染，利用Lipofectamine2000将穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK-293细胞，具体操作方法如下:将转染的质粒(2ug穿梭质粒+2ug骨架质粒)、10 μ I脂质体分别用培养基稀释至250 μ I,轻轻混匀，室温静置5min ;将脂质体加入到质粒稀释液中，轻轻混匀，室温静置约20min ;将脂质体与质粒的混合液加入到相应的每孔细胞的上清中，37°C，5%C02培养4-6h后更换细胞培养液；37°C，5%C02继续培养细胞。转染24h后把细胞从板上消化下来转移到大培养瓶中去养，约10天后可观察细胞病变形成病斑(图7)。收集病毒利用HEK-293细胞进行放大和扩增，得到的病毒利用阴离子层析进行纯化。
[0042]实施例6:survivin启动子调控的⑶基因在肿瘤细胞中的表达
将重组腺病毒Ad-SP-CD分别感染肿瘤细胞H印G2和非肿瘤细胞HEK-293，24h后提取各组细胞总RNA，逆转录出相应的cDNA模板后进行PCR检测，RT-PCR电泳结果显示⑶基因能够在宿主细胞中表达(图8)，与CMV启动子相比，Survivin启动子在肿瘤细胞中启动⑶基因表达的能力显著高于非肿瘤细胞。
[0043]实施例7:survivin启动子调控的CD对5-FC的转化
在重组腺病毒Ad-SP-⑶感染细胞24h后，在各组细胞培养基中加入终浓度为5mM的前药5-FC，加药96h后取培养上清20 μ I进行毛细管电泳检测，结果显示感染了重组腺病毒Ad-SP-CD的肿瘤细胞培养上清液中5-FC含量有所降低，并且有少量5-FU的出现，但是在非肿瘤细胞ΗΕΚ-293的培养上清中没有看到5-FC的减少和5-FU的出现，这一结果表明Survivin启动子调控的⑶基因能够特异地在肿瘤细胞中将5-FC转化为5-FU (图9).实施例8:survivin启动子调控的⑶联合5-FC对肿瘤细胞的杀伤利用细胞周期检测对经过重组腺病毒Ad-SP-⑶感染和5-FC处理的肿瘤细胞IfepG2和非肿瘤细胞HEK-293进行分析。结果显示(图10)，在HepG2细胞转染⑶基因并添加5-FC后，与对照病毒感染组相比出现明显的细胞凋亡；而在非肿瘤细胞HEK-293中，Ad-SP-⑶感染组和对照病毒感染组相比则变化不明显，表明Survivin启动子调控的⑶基因能够特异地对肿瘤细胞进行杀伤。
[0044]实施例9，正常细胞毒性实验
将重组腺病毒Ad-SP-⑶感染健康人淋巴细胞后加入5-FC处理，利用细胞周期分析细胞凋亡情况，结果如图11所示，重组腺病毒Ad-SP-⑶对正常细胞的毒性非常小。
【权利要求】
1.一种Survivin启动子,其特征在于,所述的启动子的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。
2.一种胞嘧啶脱氨酶基因，其特征在于，所述的胞嘧啶脱氨酶基因受权利要求1所述的Survivin启动子调控。
3.—种重组腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒包含了根据权利2所述的胞嘧啶脱氨酶基因。
4.一种受survivin启动子调控的⑶自杀基因的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:51.克隆survivin启动子:设计引物，通过PCR的方法从BEL-7402细胞的基因组中扩增survivin启动子片段,克隆到pGEM_T载体中构建成重组质粒pT_SP,并进行序列分析； 52.构建survivin启动子调控绿色荧光蛋白GFP的报告质粒:用限制性内切酶AseI和Nhe I双切pT-SP和pEGFP-Nl质粒，回收survivin启动子和pEGFP-Nl质粒大片段进行连接，构建成重组质粒pSP-EGFP ； 53.克隆CD基因:设计引物，以酵母基因组为模板扩增CD基因，克隆到pGEM-T载体中构建成重组质粒pT-CD，并进行序列分析； 54.构建含survivin启动子和酵母⑶基因的重组腺病毒穿梭质粒:先利用限制性内切酶Sac I和Sal I双切pT_⑶和pSP_EGFP质粒，回收⑶基因和线性化的pSP_EGFP进行连接，构建成重组质粒PSP-⑶；然后利用限制性内切酶XbaI和SalI双切pSP-⑶质粒和PDC315穿梭质粒，回收SP-⑶片段和pDC315载体的大片段进行连接，构建成重组腺病毒穿梭质粒 pDC315-SP-CD ; 55.重组腺病毒Ad-SP-⑶的包装、扩增和纯化:将步骤S4所得的穿梭质粒PDC315-SP-CD与骨架质粒共转染HEK-293细胞，出现病斑后收集病毒利用HEK -293细胞进行病毒的扩增，层析纯化，即得受survivin启动子调控的CD自杀基因的重组腺病毒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤SI所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:5所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ NO:6所示。
7.—种重组腺病毒在抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的重组腺病毒为根据权利要求3所述的重组腺病毒或根据权利要求4所述的制备方法制得的重组腺病毒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌或宫颈癌。
【文档编号】C12N15/861GK103484462SQ201310391654
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】邵红伟, 黄树林, 沈晗, 吴凤麟, 张文峰, 李家明 申请人:广东药学院