铜绿假单胞菌与噬菌体感染相关基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体功能基因的筛选和药用功能的开发，尤其是铜绿 假单胞菌与噬菌体感染相关基因及应用。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌是造成院内感染最常见的病原菌之一，目前治疗方法主要是应用抗 生素杀死或者抑制病原菌的生长。但是铜绿假单胞菌自身具有一些耐药机制，包括低渗透 性的外膜、不同外排栗组成型基因的表达和抗生素失活酶的产生，同时菌株也能够获得一 些抗性基因、降低表达一些孔蛋白以及突变喹诺酮靶位基因等，所以铜绿假单胞菌对临床 应用的许多抗生素都产生了耐药性，而且耐药程度日趋严重，多重耐药已成为当今医药界 的一个世界性难题。
[0003] 噬菌体能够以高效率特异性杀死细菌宿主，有望作为一种生物剂用于杀菌处理。 使用铜绿假单胞菌噬菌体治疗感染的一些临床试验已经取得了很好的效果，如腿部溃疡， 烫伤，耳部感染，和囊肿性纤维化。在噬菌体体内和体外的杀菌实验中，同一噬菌体针对不 同的菌杀菌效率不同，这和噬菌体感染宿主菌的过程受到宿主菌基因表达水平的影响有 关，噬菌体裂解宿主依赖于宿主菌的机制，从而增加了噬菌体裂解宿主菌的复杂程度。了解 更多与噬菌体感染相关的宿主基因，这将有利于噬菌体的治疗效率，并且在未来提供多种 临床感染的治疗方案。但是，迄今为止，只有少数的研究揭示了铜绿假单胞菌噬菌体感染过 程所需的宿主基因，如负责精脒合成的宿主基因 speD是噬菌体JG004成功感染所必需的基 因。
[0004] 本研究中，我们选择铜绿假单胞菌裂解性噬菌体Cl 1来研究噬菌体感染的潜在机 制，使用Tn5G转座子插入技术构建宿主菌株PAK耐受噬菌体的文库，并通过反向PCR鉴定 Tn5G插入位点，从而鉴定噬菌体感染的必需基因，并利用互补实验证实了这些基因。这些基 因的发现有助于对噬菌体与宿主相互作用的理解，为噬菌体的治疗提供理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供5个与噬菌体感染相关的铜绿假单胞菌基因， 它们都是病毒感染必需基因，这些基因本身可以作为靶位基因，用于筛选治疗和防止病毒 感染的药物，病毒可以包括细菌病毒、动物病毒和人类病毒。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] 基因 BN889_05221作为靶位基因，用于筛选抑制噬菌体感染相关药物的应用。
[0008] 基因 PA0243作为靶位基因，用于筛选抑制噬菌体感染相关药物的应用。
[0009] 基因 PA3808作为靶位基因，用于筛选抑制噬菌体感染相关药物的应用。
[0010] 基因 PA1993作为靶位基因，用于筛选抑制噬菌体感染相关药物的应用。
[0011] 基因 PA1115作为靶位基因，用于筛选抑制噬菌体感染相关药物的应用。
[0012] 上述的基因在筛选治疗和防止病毒感染的药物制剂有效性试剂中的应用。
[0013] 而且，所述基因作为筛选抵御人类病毒CVB3感染药物的应用。
[0014] 通过构建菌株PAK的转座子Tn5G突变文库，获得耐受噬菌体Cl 1突变株。反向PCR 鉴定突变株的Tn5G插入位点，并且通过blastp分析出突变基因。构建基因的表达载体，对 相应突变株进行基因功能回复实验，用实验证明这些基因是噬菌体感染必需的宿主基因， 这些基因可以作为筛选病毒感染相关靶位基因的依据，进一步筛选出治疗和防止病毒感染 的药物。
[0015] 本发明的优点和技术效果如下：
[0016] 本研究主要鉴定了铜绿假单胞菌噬菌体Cll感染相关的宿主PAK基因。通过 构建菌株PAK的转座子Tn5G突变文库，获得5株耐受噬菌体Cll突变株。5株突变株 吸附率在93. 3 % -95. 4 %之间，与野生型菌株PAK的噬菌体吸附率92. 7 %相比没有显 著差别，5个突变株对应的5个突变基因没有影响噬菌体的吸附，可能与噬菌体感染其 他过程相关。其中突变基因 BN889_05221编码75aa小蛋白，可能编码一个调节因子；基 因 PA0243编码一种位于细胞质的转录调节因子，该调节因子具有一个DNA-binding HTH domain, TetR_type(IPR001647);突变基因 PA3808 编码产物与 ISC system FeS cluster assembly，IscX蛋白在氨基酸水平同源程度为67. I % ;突变基因 PA1993编码一种位于细 胞膜上的 MFS 超家族转运蛋白（major facilitator superfamily transporter);突变基 因 PA1115编码一种位于细胞膜的假定蛋白，该蛋白的结构域Sulfatase (IPR000917)属于 Sulfatase family (PF00884)。对噬菌体感染相关宿主基因的研究，能够更好地理解噬菌体 与宿主菌之间相互作用的分子机制，为噬菌体治疗提供理论依据，从而指导噬菌体应用于 临床治疗，未来能够对临床感染治疗提供多种治疗方案，噬菌体作为一种细菌病毒，其宿主 基因的研究对病毒感染的治疗具有启发意义，如未来可以对病毒感染所需的宿主基因采用 药物靶向干扰，达到间接治疗病毒感染的效果。
[0017] 本发明中噬菌体感染相关宿主基因的开发，能够更好地理解噬菌体与宿主菌之间 相互作用的分子机制，为噬菌体治疗提供理论依据，从而指导噬菌体应用于临床治疗，未来 能够对临床感染治疗提供多种治疗方案。噬菌体作为一种细菌病毒，其宿主基因的研究对 病毒感染的治疗具有启发意义，如未来可以对病毒感染所需的宿主基因采用药物靶向干 扰，达到间接治疗病毒感染的效果。
【附图说明】
[0018] 图1突变株染色体的Tn5G插入位点分析示意图；
[0019] 图2突变株和野生型菌株对噬菌体的吸附率；
[0020] 图3基因的互补实验基因表达载体恢复了突变株对噬菌体的敏感性白色三角表 不嗤囷体的裂解圈。
【具体实施方式】
[0021] 以下所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡 本行业的普通技术人员均可按以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术 人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、 修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例。
[0022] 本申请主要鉴定了铜绿假单胞菌噬菌体Cll感染相关的宿主PAK基因。通过构建 菌株PAK的转座子Tn5G突变文库，获得5株耐受噬菌体Cll突变株。5株突变株吸附率在 93. 3% -95. 4%之间，与野生型菌株PAK的噬菌体吸附率92. 7%相比没有显著差别，5个突 变株对应的5个突变基因没有影响噬菌体的吸附，可能与噬菌体感染其他过程相关，以下 详细论述的基因的说明如下：
[0023] 1、突变基因 BN889_05221编码75aa小蛋白，可能编码一个调节因子；基因 BN889_05221是一种病毒感染必需基因，基因本身可以作为靶位基因，筛选治疗和防止病毒 感染的药物，病毒可以包括细菌病毒、动物病毒和人类病毒；
[0024] 2、基因 PA0243编码一种位于细胞质的转录调节因子，该调节因子具有一个 DNA-binding HTH domain, TetR-type(IPR001647)，基因 PA0243是一种病毒感染必需基因， 基因本身可以作为靶位基因，筛选治疗和防止病毒感染的药物，病毒可以包括细菌病毒、动 物病毒和人类病毒；
[0025] 3、突变基因 PA3808 编码产物与 ISC system FeS cluster assembly, IscX 蛋白 在氨基酸水平同源程度为67. I %，基因 PA3808是一种病毒感染必需基因，基因本身可以作 为靶位基因，筛选治疗和防止病毒感染的药物，病毒可以包括细菌病毒、动物病毒和人类病 毒；
[0026] 4、突变基因 PA1993编码一种位于细胞膜上的MFS超家族转运蛋白（major facilitator superfamily transporter)，基因 PA1993是一种病毒感染必需基因，基因本 身可以作为靶位基因，筛选治疗和防止病毒感染的药物，病毒可以包括细菌病毒、动物病毒 和人类病毒；
[0027] 5、突变基因 PA1115编码一种位于细胞膜的假定蛋白，该蛋白的结构域 Sulfatase (IPR000917)属于 Sulfatase family (PF00884)，基因 PA1115 是一种病毒感染必 需基因，基因本身可以作为靶位基因，筛选治疗和防止病毒感染的药物，病毒可以包括细菌 病毒、动物病毒和人类病毒。
[0028] 本申请的重要意义在于：对噬菌体感染相关宿主基因的研究，能够更好地理解噬 菌体与宿主菌之间相互作用的分子机制，为噬菌体治疗提供理论依据，从而指导噬菌体应 用于临床治疗，未来能够对临床感染治疗提供多种治疗方案。噬菌体作为一种细菌病毒，其 宿主基因的研究对病毒感染的治疗具有启发意义，如未来可以对病毒感染所需的宿主基因 采用药物靶向干扰，达到间接治疗病毒感染的效果。
[0029] 本申请用于研究上述5个基因的方法具体步骤如下：
[0030] 1、材料和方法
[0031] 菌株和质粒
[0032] 实验所用菌株及质粒，具体见表1所示，实验所涉及的引物具体见表2所示。
[0033] 2、转座子文库构建
[0034] 参照实验方法描述（方法记载在[12]并做了相应的修改构建耐受噬菌体Cll的 突变株文库。
[0035] 具体如下：将供体菌菌株E. coli/PRK2013Tn5G和受体菌菌株PAK过夜培养，过夜 培养菌液转接到加有相应抗生素的液体培养基扩大培养，即E. coli/PRK2013 Tn5G转接至 含有庆大霉素（10 μ g/mL)液体LB培养基中，PAK转接至含有氨苄青霉素（10 μ g/mL)的液 体LB培养基中，培养10h。菌液以4000rpm离心收集菌体，分别用新鲜LB液体培养基洗涤 E. coli/PRK2013 Tn5G和PAK菌体3次，以去除残留的抗生素。最后将E. coli/PRK2013Tn5G 和PAK分别浓缩成0. 5mL菌泥并两种菌泥混匀，加入牛肉膏蛋白胨培养基平板，37°C培养 9h。用ImL液体LB重悬菌泥，加入5mL含有庆大霉素（100 μ g/mL)、氨苄青霉素（100 μ g/ mL)的噬菌体Cll纯裂解液，并置于37°C摇床以220rpm培养4h，以裂解对噬菌体Cll敏感 的突变株，离心收集菌体，涂于含有庆大霉素（100 μ g/mL)、氨苄青霉素（100 μ g/mL)的LB 平板，37°C培养12h。对平板上的单菌落进行纯化，对纯化后的单菌落使用双层平板法进一 步验证突变株对Cll的敏感性。
[0036] 表1菌株和质粒说明
[0038] *29-32,引用参考文件序号，见第一部分的参考文件；Ap%氨苄青霉素抗性；Gnf， 庆大霉素抗性
[0039] 表2引物序列说明
[0040]
[0041] *下划线表示的碱基代表添加的酶切位点
[0042] 3、突变株吸附率测定
[0043] 过夜培养突变株以3 %的接种量转接至新鲜的5mL液体LB培养基中，培养至对数 期（OD6。