一种基于免疫酶联反应的基因组snp位点检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种SNP检测方法，具体涉及一种基于免 疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是由基因组单个核苷 酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，是在不同个体的同一条染色体或同一位点的核 苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象。SNP在人类基因组中可 达到300万个，平均约每1250个碱基对就会有一个SNP位点。研究表明SNP与多种疾病的 发生相关，而快速、简便的检测这些具有生物学意义的SNP是准确医疗诊断的基础和前提。 一方面，SNP检测可参考已有的基因组序列进行，目的相对明确。但另一方面，SNP鉴定需检 测基因组DNA序列上特定核苷酸的转换、颠换、插入或缺失情况，对检测灵敏度、通量以及 准确性等都有特殊的要求。
[0003] 截至目前，已报导的SNP检测方法将近百种。其中较常用的方法有以下几大类：首 先，是1995年Livak研究小组报导TaqmMan探针SNP分型法，这种通过将荧光发色团和淬 灭基团偶联在SNP探针的两端，通过对SNP区域的RT-PCR实现对探针切割，从而通过检测 RT-PCR过程中产生的荧光信号种类区分等位基因的SNP类型。这种方法具有分析简单的 特点，已被广泛应用于多样本单一 SNP位点的检测，但其探针较为昂贵。其次，是以凝胶电 泳为基础的传统经典的检测方法，如：限制性片段长度多态性法PCR-RFLP、单链构象多态 性法 PCR-SSCP、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 〇 另外，随机扩增多态性（RAPD)和寡核苷酸连接分析（OLA)也是较为常用的方法，这几种方 法检测信息准确，但都较为烦琐。再次，是近些年来发展起来的，高通量、自动化程度较高的 检测SNP的方法，例如：DNA测序法、DNA芯片检测、飞行质谱仪（MALDI-T0FMS)检测、变性 高效液相色谱（DHPLC)法等等的高通量分析，其中直接测序是最容易实施的SNP检测方法， 而MALDI-T0FMS是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后，在硅芯片 上进行引物的退火、延伸，突变位点配对的碱基与正常配对的碱基不同，在质谱仪上显示不 同峰而检测SNP。
[0004] 这些方法各具优势，具有操作简便、检测特异性高、高通量或高精度等特点，但对 实验仪器均有特殊要求和较高的依赖性，局限了其应用的灵活性和范围。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，该方 法能够分析基因 SNP信息，并具有特异性高及仪器依赖性小的优点。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，包括以下步骤：
[0008] 1)依照待检测SNP位点相邻序列，设计带有5'-生物素标记的特异性引物和带有 5' -地高辛标记的特异性SNP探针组；
[0009] 2)将带有5' -生物素标记的特异性引物与提取出的待检测基因组DNA进行变性 杂交，然后去除未与待检测基因组DNA结合的带有5'-生物素标记的特异性引物，得到纯化 后的与引物杂交的基因组DNA ;
[0010] 3)在PCR反应体系中对纯化后的与引物杂交的基因组DNA进行单次短时间延伸， 然后通过基因组DNA纯化除去PCR反应体系，得到带有生物素标记的延伸产物；
[0011] 4)将带有生物素标记的延伸产物分别与带有5' -地高辛标记的特异性SNP探针 组中的不同SNP探针进行变性杂交，使全部或部分带有生物素标记的延伸产物与SNP探针 互补结合，然后通过基因组DNA纯化分离出与延伸产物结合的SNP探针、游离引物、多余SNP 探针和其他存在于反应体系中的核酸短序列；
[0012] 5)用磁珠捕获所有带有生物素标记的与延伸产物结合的SNP探针及其他带有生 物素标记的核酸短序列，然后经DNA内切酶处理，除去与延伸产物不完全互补的SNP探针及 其他带有生物素标记的核酸短序列，再重新收集磁珠，得到与延伸产物完全互补的SNP探 针；
[0013] 6)用地高辛标记免疫酶联反应对得到的与延伸产物完全互补的SNP探针进行检 测，根据是否发生显色判断SNP的分型，其中基因组SNP位点即为与出现颜色反应的SNP探 针相同的核苷酸。
[0014] 所述的带有5'-生物素标记的特异性引物由基因组SNP位点相邻上游区域的基因 序列确定，该特异性引物的长度为20~28bp，该特异性引物的基因序列与基因组SNP位点 相邻上游区域的基因序列相同，该特异性引物的3' -端核苷酸紧邻但不包含基因组SNP位 点，该特异性引物的5' -端带有生物素修饰基团。
[0015] 所述的带有5' -地高辛标记的特异性SNP探针组由若干SNP探针组成，其中所有 SNP探针均为与基因组SNP位点相邻并包含基因组SNP位点的基因序列，该基因序列具体包 括四部分：SNP探针5'-端与特异性引物互补的基因序列、与基因组SNP位点核苷酸互补或 不互补的核苷酸、与基因组SNP位点3' -端相邻的IObp核苷酸的互补基因序列、以及SNP 探针5' -端的地高辛标记；其中含有与基因组SNP位点核苷酸不互补的核苷酸的SNP探针 为阴性对照探针。
[0016] 所述步骤2)中变性杂交的具体操作条件为：先在95°C水浴中热变性5min，再在 (Tm - 4) °C水浴中杂交5min，其中Tm为带有5' -生物素标记的特异性引物的退火温度，退 火温度在60~70 °C。
[0017] 所述步骤2)中在变性杂交后，通过E.Z.N. A. Blood DNA kit基因纯化试剂盒对基 因组进行纯化，去除未与待检测基因组DNA结合的带有5' -生物素标记的特异性引物。
[0018] 所述步骤3)中单次短时间延伸的具体操作条件为：在（Tm-4) °C水浴中反应 10~30秒，其中Tm为带有5' -生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60~ 70。。。
[0019] 所述步骤4)中变性杂交的具体操作条件为：先在95°C水浴中热变性5min，再在 (Tm - 4) °C水浴中杂交5min，其中Tm为带有5' -生物素标记的特异性引物的退火温度，退 火温度在60~70 °C。
[0020] 所述步骤5)中的磁珠为链霉素亲和生物素磁珠，其可与延伸产物上的生 物素标记结合，从而达到分离延伸产物的目的；所述的DNA内切酶为T7核酸内切酶 I (T7Endonuclease I)，用于特异性切割不完全配对的dsDNA。
[0021] 所述步骤6)中的地高辛标记免疫酶联反应，是通过抗地高辛-HRP偶联抗体结合 带有5' -地高辛标记的SNP探针，催化HRP底物进行显色反应，其中HRP底物为TMB (3, 3' ，5, 5' -tetramethylbiphenyl，3, 3' 5, 5' -四甲基联苯双酸二缩水甘油醚）显色底物，终止 反应液为2mol/L的H2SO40
[0022] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0023] 本发明提供的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，首先针对基因组 SNP位点设计带有5' -生物素标记的特异性引物及带有5' -地高辛标记的特异性SNP探 针组，然后将引物与提取的基因组DNA进行杂交，再对与引物杂交的基因组DNA进行单次短 时间延伸，然后将延伸产物分别与特异性SNP探针组中的SNP探针进行变性杂交和退火，使 全部或部分延伸产物与SNP探针结合；再用磁珠捕获带有生物素标记的与延伸产物结合的 SNP探针，通过DNA内切酶处理，切除与延伸产物不完全互补的SNP探针；最后用地高辛标 记免疫酶联反应对结果进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型：基因组SNP即为与出 现颜色反应的SNP探针相同的核苷酸。本发明属于PCR非依赖性方法，虽然只包括单次延 伸反应，但通过3次特异性筛选和1次信号放大过程，保证了结果的特异性和灵敏度。其中， 3次特异性筛选过程为：①通过特异性引物与模板的结合与单次延伸合成出被检测序列和 非特异延伸的杂片断；②通过磁珠捕获去除基因组、基因组降解短片断及未与延伸产物结 合的多余SNP探针，此时捕获产物中仅为与SNP探针结合的被检序列和非特异序列；③通 过T7内切酶I对不完全互补的序列（包括所有杂序列和非同型SNP探针序列）进行切割， 剩余序列中只有可以与延伸产物SNP性质相同的地高辛标记得以保留，保证了反应的特异 性。1次信号放大过程为：通过地高辛免疫酶联反应放大信号，提高反应的灵敏度。另外， 本发明提供的方法中包含的试剂及操作工具均较轻便，可由发明试剂盒提供，依赖的外在 设备仅为加热装置，即：具有实验仪器及环境要求低的优点，可在不具备专业仪器的实验环 境或野外操作环境下进行检测。可能在未来疾病的初步筛查、刑侦初步判断等领域得以应 用。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明提供的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法的流程示意 图。
【具体实施方式】
[0025] 下面对本发明做进一步详细说明。
[0026] 本发明公开了一种SNP检测方法，该方法基于生物素标记引物的Taq酶单向延伸、 DNA限制性酶切、地高辛偶联核酸探针的免疫酶联反应实施。该方法包括：针对基因组SNP 位点设计带有5' -生物素标记的特异性引物及带