一套用于细菌耐药基因ndm-1检测的多核苷酸、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于细菌耐药基 因一一新德里金属β-内酰胺酶-1基因（NDM-I)检测的多核苷酸、方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着抗生素的广泛应用，多种细菌出现不同程度的耐药性。2010年9月， 印度、英国、瑞典、巴基斯坦和澳大利亚学者联合报道了一种几乎能抵抗所有抗生素的细 菌，称为"超级细菌"，该细菌能产生一种新的金属β-内酰胺酶，其水解活性远高于现有的 金属β-内酰胺酶。由于首个感染病例在印度新德里发现，因此，该酶被称为新德里金属 内酰胺酶 _1 (New Delhi metall〇-blactamase-l，NDM_l)。NDM-1 具有强大的水解作 用，几乎能抵抗目前使用的所有抗生素，已严重威胁人类健康。NDM-I的基因长度为813bp， 编码NDM-I酶的基因位于1个长度为HOOOObp的质粒上。质粒是游离于细菌DNA基因组 之外、可移动的遗传原件，能够在不同种属细菌间发生转移，从而导致耐药性在细菌中的扩 散。携带NDM-I质粒的细菌主要是医院感染相关的细菌。另外，NDM-I感染患者通过环境 传播、医护人员的接触传播均能造成耐药菌的扩散感染，使院内感染面临前所未有的挑战。
[0003] 质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在 PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定 量分析的标准曲线。但是由于受到DNA定量检测量值溯源水平的限制，目前可查的质粒DNA 标准物质还比较少，针对NDM-I耐药基因 PCR检测的质粒DNA标准物质还是空白。在生物 计量科学领域，质粒DNA标准物质研究受到广泛重视，参与该领域研究的国际国内单位包 括美国的国家标准技术研究院（NIST)，英国政府检测标准集团（LGC)，欧盟委员会联合研 究中心标准物质与测量研究院（IRMM)以及中国计量科学技术研究院等，至今已经有5个质 粒有证标准物质研发成功。由于针对NDM-I耐药基因 PCR相关检测方法的质粒DNA标准物 质的研制还是空白，在实际NDM-I耐药基因 PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建 的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值 方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、 有效性和可靠性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一套适用于细菌耐药基因 NDM-I实时荧光定量PCR检测的 质粒标准分子及其应用。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含细菌耐药基 因 NDM-I的序列。
[0006] 在另一优选例中，所述细菌耐药基因 NDM-I的序列选自下组：
[0007] (a)序列如SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸序列；
[0008] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0009] (C)序列与SEQ ID NO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQ ID NO. :1所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0010] (d)与（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0011] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0012] 本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明 第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
[0013] 在另一优选例中，所述DNA构建物中包含细菌耐药基因 NDM-I的序列。
[0014] 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
[0015] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
[0016] 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为细菌耐药基因 NDM-I检测的标准分 子（质粒标准分子）。
[0017] 在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19, pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScript II SK 和 pGEM。
[0018] 本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0019] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增细菌耐药 基因 NDM-I的基因序列。
[0020] 在另一优选例中，特异性扩增细菌耐药基因 NDM-I的基因序列的所述的引物对选 自下组：
[0021] SEQ ID NO. :3 和 SEQ ID NO. :4 所示的引物对；
[0022] SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物对；
[0023] SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物对；
[0024] SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物对；
[0025] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增细菌耐药 基因 NDM-I序列。
[0026] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ ID NO. : 11 所示。
[0027] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面 所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于细菌耐药基 因 NDM-I的检测。
[0028] 在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
[0029] 在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
[0030] 本发明的第五方面，提供了一套细菌耐药基因 NDM-I实时荧光定量PCR检测方法， 所采用的标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构 建物。
[0031] 本发明的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：
[0032] ⑴细菌耐药基因 NDM-I标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核 苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物；
[0033] (ii)特异性扩增细菌耐药基因 NDM-I序列的引物对，所述引物对为：
[0034] SEQ ID Nd :3和SEQ ID Nd :4所示的序列构成的引物对。
[0035] 在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合（combination)，较佳地所述组分 ⑴和（ii)是各自独立的。
[0036] 在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。
[0037] 本发明的第七方面，提供了一套细菌耐药基因 NDM-I的质粒标准分子的制备方 法，包括以下步骤：
[0038] ①人工合成细菌耐药基因 NDM-I序列，所述细菌耐药基因 NDM-I如SEQ ID NO. : 1 所示；
[0039] ②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到细菌耐药基因 NDM-I检测的质 粒标准分子。
[0040] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19, pUC18, pUC118, pUC119， pBlueScript II SK 或 pGEM。
[0041] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为PUC19。
[0042] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0043] 图1是本发明质粒标准分子PXL08的图谱。
[0044] 图2是本发明所得质粒标准分子pXL08稳定性检测结果图。
[0045] 图3是利用本发明质粒标准分子pXL08建立的实时荧光PCR标准曲线。
【具体实施方式】
[0046] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于细菌耐药基因 NDM-I实时荧 光PCR检测的多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质 粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检 测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
[0047] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的细菌耐药基因 NDM-I实时荧光PCR 检测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一套适用于细菌耐药基因 NDM-I实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应 用。
[0048] 实时荧光PCR检测细菌耐药基因 NDM-I的原理
[0049] 采用实时荧光PCR技术可特异性扩增细菌耐药基因 NDM-I序列，设计针对NDM-I 基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信 号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性 标准物质（或阳性标准分子）。PCR方法中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以作为 阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以构建稳定的标准曲线， 根据标准曲线可分别计算出样品中对