专利名称：一种ev71抗原酶联反应检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种酶联诊断试剂盒及其用途，具体说，是涉及一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒，属于医学、生物技术领域。
背景技术：
肠道病毒71型(英文名为Human enterovirus 71),简称EV71 :EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。由于EV71引起的手足口病(hand - footand mouth disease ;HFMD)影响范围的广泛性、危害的严重性,该病在中国已纳入丙类传染病管理。鉴于此，世界各国学者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。其基因组为单股正链RNA,长度约为7，408个核苷酸,编码开放读码框(open-reading frame, 0RF)。EV71基因组编码的多聚蛋白(polyprotein)约含2，193个氨基酸,该多聚蛋白可进一步被水解成Pl、P2、P3三个前体蛋白(图I)。经过进一步的剪切，Pl前体蛋白可以进一步成熟为VP1、VP2、VP3和VP4四个病毒结构蛋白，负责病毒颗粒的装配和稳定；P2前体蛋白则进一步成熟为非结构蛋白(non-structural protein, nsp)2A(特异性蛋白酶)、2B和2C ；P3前体蛋白则用以形成非结构蛋白3A、3B (VPg，5’末端结合蛋白)、3C (特异性蛋白酶)和 3D(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。肠病毒的流行与季节转换、环境变异有着极大的关联性，肠病毒只在夏季及初秋流行，每年六 九月为高峰期，气温过低的地区并不利于肠病毒生存。根据流行病学调查，肠病毒之传染途径主为粪一口传染(stool - oral)，感染肠病毒的患者会经由粪便排出病毒，这些含有高浓度肠病毒的粪便会污染环境甚至地下水源，在公共卫生条件不佳的地区，极易经由污染的水源而散播该病毒。EV71对于中枢神经系统有极高的感染性，故临床上出现之症状包括脑炎(encephalitis)、无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、急性无力肢体麻痹(acute flaccid paralysis)、手足口症(hand - foot - mouth disease)、泡疫性咽峡炎(herpangina)、急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonic jerk)、头痛(headache)、发烧(fever)及呕吐(vomoting)等，而其中以手足口症及泡疹性咽峡炎最为常见。一般而言，感染肠病毒多为无症状(约50 80%)或出现轻微类似感冒的症状，病人会自然痊愈而产生抗体，但因感染肠病毒且转成重症之患者却有极高的机率死于心肺衰竭及广泛性的脑干伤害，实不容小觑。加强对EV71型感染病患的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测试剂盒是预防控制此传染病的关键。在EV71病毒所编码的四个结构蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用来形成包装病毒颗粒的衣壳(capsid)，而VP4则被包埋在病毒衣壳的内部，负责与核心(core)相互作用，用以稳定病毒的基因组，因此VP1、VP2和VP3形成了 EV71病毒的主要抗原决定簇，其中又以VPl的抗原性最强，而成为目前抗体研究与设计开发的主要靶点。同时，研究表明肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性，并且存在着较高的重组性。其中EV71与Cox A16的相似性达到了 80%，拥有很多共同表位，许多克隆抗体EV71的单抗具有了与Cox A16的交叉反应性。成为EV71抗原检测方法建立的一项制约。常规的针对EV71病毒的诊断方法主要通过分离病毒，中和抗体检测和免疫组织化学法来进行。但这些方法费时、费力，无法满足疾病流行期间同时大量处理大量标本的需要。同时，鉴于EV7·1病毒的危害性,有必要开发一种简单快速易行的检测EV71病毒抗原表位含量的检测方法。该研究使用的特异性识别EV71病毒Vpl中保守区域基因的单克隆抗体具有高效的EV71病毒的中和效果，同时与Cox A16交叉反应性，有效避免了抗原检测中与EV71 80%相似性的Cox A16的假阳性干扰。因此，所述方法的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义，同时该方法也为EV71疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。
实用新型内容针对现有技术存在的上述问题，本实用新型的目的是提供一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒。为实现上述实用新型目的，本实用新型采用的技术方案如下一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒，包括盒体，盒体内置有7个下凹瓶位，7瓶设有密封盖的试剂瓶、一块多孔酶联板及一张封板膜，其中所述的7个下凹瓶位内分别相应放置装有阳性参考品、阴性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液各一瓶，所述的多孔酶联板包括数个底面封闭且顶面敞口的微反应孔的内壁包被有抗EV71抗体。作为一种优选方案，所述的抗EV71抗体为特异性识别EV71病毒Vpl中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段，且可被生物标记或化学标记的；所述阳性对照品为EV71抗原对照品；所述阴性对照品为阴性血清；所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金离子标记的。作为进一步优选方案，所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。作为进一步优选方案，所述多孔酶联板位于所述试剂瓶之上或之下，所述封板膜与所述多孔酶联板相邻；且所述封板膜与所述多孔酶联板的大小一致。作为进一步优选方案，所述多孔酶联板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。作为进一步优选方案，所述多孔酶联板上共设有96个微反应孔，且所述多孔酶联板外设有封套。作为更进一步优选方案，所述样品稀释液通过在牛血溃白蛋白IOg加入0.01 MPBS IOOOml和混合生物素防腐剂O. 5ml即得；所述浓缩洗液为取NaH2PO4. 2H20 2. 96g、Na2HPO4. 12H20 29. 0g、NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加纯化水至 1000ml 即得；所述终止液为取浓硫酸112ml加入纯化水888ml即得；所述显色液A为取醋酸钠27. 2g、柠檬酸3.2g、30%H2020. 6ml加入双蒸水至IOOOml即得；所述显色液B为取ΤΜΒ0. 4g,EDTA-Na2O. 4g、柠檬酸I. 9g、甘油IOOml加入双蒸水至IOOOmlo[0020]本实用新型提供的EV71抗原酶联反应检测试剂盒具有较好的特异性，尤其是对于Cox A16无交叉反应性；双人对于EV71纯化前、后的样品进行抗原含量重复检测，两人的变异系数〈10%，重复性良好；3次的线牲相关系数均>0. 99，线性较好；对于EV71病毒纯化前后的样品、铝佐剂吸附EV71样品均能较好的检测。采用本实用新型提供的试剂盒，可快速、准确有效地的对手足口病感染患者进行EV71检测，从而为EV71病毒感染诊断和预防提供了一种新的途径，因此具有十分广阔的应用前景。
图I为本实用新型提供的EV71抗原酶联反应检测试剂盒的结构示意图；图2为本实用新型提供的EV71抗原酶联反应检测试剂盒中的96孔酶联版的结构示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本实用新型。应理解，下述实施例仅用于说明本·实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
以下结合附图及其实施例对本实用新型进一步详细说明
实施例如图I和图2所示，本实用新型提供的一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒，包括盒体(1)，盒体内置有7个下凹瓶位(2)，7瓶设有密封盖的试剂瓶组(3)、一块多孔酶联板
(4)及一张封板膜(5)，其中所述的7个下凹瓶位内分别相应放置装有阳性参考品(31)、阴性参考品(32)、样品稀释液(33)、浓缩洗液(34)、显色液A (35),显色液B (36)和终止液
(36)各一瓶，所述的多孔酶联板包括数个底面封闭且顶面敞口的微反应孔的内壁包被有抗EV71抗体；所述多孔酶联板位于所述试剂瓶之上或之下，所述封板膜与所述多孔酶联板相邻；且所述封板膜与所述多孔酶联板的大小一致；所述多孔酶联板包括支撑架(41)，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条(42 )，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔(43);所述多孔酶联板上共设有96个微反应孔，且所述多孔酶联板外设有封套(6)。试剂盒中的多孔酶联板及试剂的制备(I)抗原参考品的制备；(2)单克隆抗体的制备；(3)抗EV71单抗包被板的制备；(4)酶标抗体的制备；(5)样品稀释液、浓缩洗液、终止液的配置；(6)显色液的配置；其中，所述的EV71抗原检测方法是双抗体夹心酶联免疫法；(I)所述的抗原参考品制备方法如下将通过基因工程方法制备的EV71病毒Vpl纯化液配制为含有抗原的溶液，然后向该溶液添加牛血清白蛋白作为保护剂。对其进行分装，即制得EV71抗原参考品；(2)所述的单克隆抗体制备方法如下①采用制备的EV71纯化液免疫小鼠.效价测定后，采用效价最高的小鼠取脾脏细胞与骨髓瘤细胞按比例进行融合，在培养液上培养融合杂交的瘤细胞；②进行三次亚克隆，每次亚克隆时，检测各细胞孔的效价，对于OD值大于O. 6的孔的细胞进行克隆化，获得高效价的针对不同位点的单克隆抗体的细胞株；③通过对获得的细胞株进行大规模培养，并将培养后的细胞注射到小鼠腹腔，制备抗EV71单克隆抗体腹水，即得所述的单克隆抗体；(3)所述的抗EV71单抗包被板的制备方法如下 使用制备的纯化的抗EV71克单隆抗体作为包被抗体，以最佳包被抗体浓度加于酶标板反应孔内，并于低温下放置。弃去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封闭液于孔中，封闭，弃去封闭液，拍干，干燥，真空封装，最后将封装后的包被板于低温下保存；(4)所述的酶标抗体的制备方法如下；将获得的纯化抗EV71单克隆抗体BE2采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP )，标记后加等体积甘油分装，-20 V放置。其中所述的酶标抗体使用前采用方阵滴定法确定最适工作浓度；(5)所述的样品稀释液、浓缩洗液、终止液配置方法如下I)样品稀释液取牛血溃白蛋白10g，加入O. 01 M PBS 1000ml，混合生物素防腐剂O. 5ml即得样
品稀释液。2)浓缩洗液取NaH2PO4. 2H20 2. 96g,Na2HPO4. 12H20 29. 0g,NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加纯化水至1000ml即得。3)终止液取浓硫酸112ml加入纯化水888ml即得。(6)所述的显色液配置方法如下I)显色液A取醋酸钠27. 2g、柠檬酸3. 2g、30%H2020. 6ml加入双蒸水至IOOOml即得。2)显色液B取ΤΜΒ0. 4g、EDTA-Na2O. 4g、柠檬酸 I. 9g、甘油 IOOml 加入双蒸水至 1000ml。实施例2 EV71抗原酶联反应检测试剂盒的使用本发明所述的检测方法是通过ELISA方法来实现的；本发明的试剂盒或实际是通过ELISA进行对EV71抗原进行定量的。EV71抗原酶联反应检测试剂盒的检测操作程序如下A.定性检测(I)将浓缩洗涤液用蒸馏水做高倍数稀释；(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，加检样品、阳性对照；(3)恒温水浴箱避光孵育，用洗液洗涤，拍干；(4)将标记抗体用加入各反应孔；[0065]( 5 )恒温水浴箱避光孵育；(6)用洗涤液洗涤，拍干；(7)加入显色液A于孔中，再加入显色液B，震荡将其混匀；(8)恒温水浴箱避光孵育；(9)滴加终止液于孔中，震荡混匀；(10)用酶标仪于450nm波长下读数；(11)结果判定；Cut off值=2 · I X N (N为阴性对照平均A值) a阴性对照平均A值应小于O. 3，否则实验不成立。b标本A值小于Cut off值为阴性，大于等于Cut off值为阳性。定量检测( I)将浓缩洗涤液用蒸馏水做高倍数稀释；(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，将抗原标准品稀释为不同年度，每稀释度各加一孔；(3)加待检样品、标准品、样品；(4)恒温水浴箱避光孵育，用洗液洗涤，拍干；( 5 )将标记抗体用加入各反应孔；(6)恒温水浴箱避光孵育；(7)用洗涤液洗涤，拍干；(8)加入显色液A、显色液B，震荡将其混匀；(9)恒温水浴箱避光孵育；(10)滴加终止液，震荡混匀；(11)用酶标仪于450nm波长下读数；(12)结果判定；Cut off值=2 . I X N (N为阴性对照平均A值)a阴性对照平均A值应小于O. 3，否则实验不成立。b采用直线回归法计算样品抗原滴度，R2值应大于O. 97。组装所得的EV71抗原酶联反应检测试剂盒的特异性及灵敏度、线性和线性范围检测采用现有技术的常规方法，具体结果如下A.特异性特异性评价组装的EV71病毒ELISA检测试剂盒用于检测肠道病毒以及其它病毒，结果表明该试剂盒的特异性很高。结果表明该检测试剂盒的特异性高，与HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒、HAV等多种病毒没有交叉。、灵敏度、线性、线性范围灵敏度检测的Vpl范围5ng 1000ng/ml。病毒定量检测(原液TCID50=107/100ul)培养的EV71病毒原液检测的TCID50为107/100ul，可以检测100倍稀释的培养病
毒上清。[0099]本实用新型提供的EV71抗原酶联反应检测试剂盒具有较好的特异性，尤其是对于Cox A16无交叉反应性；双人对于EV71纯化前、后的样品进行抗原含量重复检测，两人的变异系数〈10%，重复性良好；3次的线牲相关系数均>0. 99，线性较好；对于EV71病毒纯化前后的样品、铝佐剂吸附EV71样品均能较好的检测。最后有必要在此说明的是以上实施例只用于对本实用新型的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本实用新型保护范围的限制，本领域的技术人员根据本实用新型的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本实用新型的保护范围。
权利要求1.一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒，其特征在于它包括盒体，盒体内置有7个下凹瓶位，7瓶设有密封盖的试剂瓶、一块多孔酶联板及一张封板膜，其中所述的7个下凹瓶位内分别相应放置装有阳性参考品、阴性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液各一瓶，所述的多孔酶联板包括数个底面封闭且顶面敞口的微反应孔的内壁包被有抗EV71抗体。
2.根据权利要求I所述的EV71抗原酶联反应检测试剂盒，其特征在于所述的抗EV71抗体为特异性识别EV71病毒Vpl中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段，且可被生物标记或化学标记的； 所述阳性对照品为EV71抗原对照品； 所述阴性对照品为阴性血清； 所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金离子标记的。
3.根据权利要求I所述的EV71抗原酶联反应检测试剂盒，其特征在于所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。
4.根据权利要求I所述的EV71抗原酶联反应检测试剂盒，其特征在于所述多孔酶联板位于所述试剂瓶之上或之下，所述封板膜与所述多孔酶联板相邻；且所述封板膜与所述多孔酶联板的大小一致。
5.根据权利要求4所述的EV71抗原酶联反应检测试剂盒，其特征在于所述多孔酶联板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。
6.根据权利要求4所述的EV71抗原酶联反应检测试剂盒，其特征在于所述多孔酶联板上共设有96个微反应孔，且所述多孔酶联板外设有封套。
专利摘要本实用新型公开了一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒，包括盒体，盒体内置有7个下凹瓶位，7瓶设有密封盖的试剂瓶、一块多孔酶联板及一张封板膜，其中所述的7个下凹瓶位内分别相应放置装有阳性参考品、阴性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液各一瓶，所述的多孔酶联板包括数个底面封闭且顶面敞口的微反应孔的内壁包被有抗EV71抗体。本实用新型提供的EV71抗原酶联反应检测试剂盒具有较好的特异性，尤其是对于CoxA16无交叉反应性；双人对于EV71纯化前、后的样品进行抗原含量重复检测，重复性良好，线性较好；对于EV71病毒纯化前后的样品、铝佐剂吸附EV71样品均能较好的检测。
文档编号G01N33/543GK202735348SQ20122037619
公开日2013年2月13日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者史晋, 吴克, 刘昊智, 鲍路伟, 王文灏, 程超, 张爱晖 申请人:上海博沃生物科技有限公司