急性心肌梗死早期诊断标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于急性心肌梗死诊断的分子标志物，具体 涉及血液中的分子标志物-DSG3基因在制备诊断急性心肌梗死的产品中的应用。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉急性、持续性缺 血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不 能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力 衰竭，常可危及生命。本病在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年 来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。
[0003] 现有技术中用于诊断急性心肌梗死的方法包括：（1)心电图特征性改变为新出现 Q波及ST段抬高和ST-T动态演变；（2)心肌坏死血清生物标志物升高，肌酸激酶同工酶 (CK-MB)及肌钙蛋白（T或I)升高。可于发病3~6小时开始增高，CK-MB于3~4d恢复 正常，肌钙蛋白于11~14天恢复正常；（3)其他，白细胞数增多，中性粒细胞数增多，嗜酸 性粒细胞数减少或消失，血沉加快，血清肌凝蛋白轻链增高。关于心电图特征性改变的诊断 方法，由于国内，国外缺乏较大样本的临床对照研究，目前各个权威机构推荐的AMI的心电 图诊断标准的灵敏度和特异性尚不清楚，没有统一标准，限制了其应用。用于诊断急性心肌 梗死的血清蛋白标志物经常联合使用，因为在AMI的早期，特别是在梗塞发生后的最初几 个小时，当心肌酶尚未升高而心电图又不典型时，肌钙蛋白I(cTnl)、肌红蛋白（Mb)、心肌 酶谱的联合检测具有重要意义。因此一个血清蛋白标志物的检测特异性、准确性均不尽人 意。而通过白细胞数等免疫细胞的检测来诊断急性心肌梗死不能体现早期诊断的理念。基 于现有技术中检测急性心肌梗死的手段的局限性，寻找一种特异性和灵敏性高的用于急性 心肌梗死早期诊断的方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于急性心肌梗死早期 诊断的分子标志物。相比传统的急性心肌梗死的诊断方法，使用基因标志物来诊断急性心 肌梗死的具有及时性、特异性和灵敏性的特点，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险， 针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了检测DSG3基因表达的产品在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应 用。
[0007] 进一步，上面所提到的检测DSG3基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测DSG3基因表达水平以诊断急性心肌 梗死的产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断急性心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增DSG3基 因的引物；所述用实时定量PCR诊断急性心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增DSG3基因 的引物；所述用免疫检测诊断急性心肌梗死的产品包括：与DSG3蛋白特异性结合的抗体； 所述用原位杂交诊断急性心肌梗死的产品包括：与DSG3基因的核酸序列杂交的探针；所述 用芯片诊断急性心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与DSG3 蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与DSG3基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断急性心肌梗死的产品至少 包括一对特异扩增DSG3基因的引物的序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台、诊断数据库。其 中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测DSG3基因表达的产品可以应用于该平台 实现对DSG3基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱 的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出 哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知DSG3基因的异常与急性心肌梗死 相关也属于DSG3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0011] 急性心肌梗死诊断数据库也是一类特殊的诊断工具，这类数据库通过以下方式实 现疾病的诊断：数据库设置疾病的入库标准，当输入病例的基因组信息、转录组信息等遗传 信息时，用入库标准对病例的遗传信息进行筛选分析，这个入库标准就是与正常组相比，病 例的DSG3基因表达明显升高，则允许该病例进入到该数据库中。通过以上方法实现急性心 肌梗死诊断的数据库也在本发明的保护范围之内。
[0012] 本发明还提供了一种诊断急性心肌梗死的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、 试纸、高通量测序平台或诊断数据库。
[0013] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测DSG3基因转录水平的针对 DSG3基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的DSG3蛋 白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括DSG3基因在内的多个基因（例如，与急性 心肌梗死相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括DSG3蛋白在内 的多个蛋白质（例如与急性心肌梗死相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与急性 心肌梗死的标志物同时检测，可大大提高急性心肌梗死诊断的准确率。
[0014] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测DSG3基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括DSG3蛋白的 特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片 方法检测DSG3基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对DSG3基因的 引物和/或探针。根据DSG3基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测DSG3基因表 达水平的引物和探针。
[0015] 与DSG3基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合， 任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针 的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度 对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一 般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自 身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0016] 所述高通量测序平台包括检测DSG3基因表达水平的试剂。
[0017] 所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测 DSG3基因的转录水平。
[0018] 所述诊断数据库是以DSG3基因的异常表达为入库标准。所述DSG3基因的异常表 达为：与正常组相比，病例组的DSG3基因表达显著升高，该病例即诊断为急性心肌梗死。
[0019] 进一步，所述DSG3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述DSG3 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与DSG3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗 体。
[0020] 在本发明的具体实施方案中，所述针对DSG3基因的引物序列如下：正向引物序列 如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO. 4所示。
[0021] 用于诊断急性心肌梗死的DSG3基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组 织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于 诊断急性心肌梗死的DSG3基因及其表达产物的来源是血液。
[0022] 在本发明的上下文中，"DSG3基因"