NEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用 美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片（4x 44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h， 然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0070] 6、芯片数据处理与分析
[0071] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2. 0或小于0. 5的基因作为差异表达基因。
[0072] 7、统计学处理
[0073] 采用SPSS 13. 0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法， P〈0. 05差异有显著性意义。
[0074] 8、结果
[0075] 结果如图1显示，与正常人相比，急性心肌梗死患者血液中DSG3基因的mRNA水平 显著升高，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0076] 实施例2QPCR实验验证急性心肌梗死患者和正常人中差异表达的基因
[0077] 1、研究对象：
[0078] 收集体检健康者40例（正常对照组），选择门诊急性心肌梗死患者40例。男女不 限，年龄不限。AMI患者均符合1979年国际心脏病学会和协会及WHO临床命名标准化联合 专题组制定的标准。所有患者均排除恶性肿瘤、急性感染、外伤及严重肝、肾疾病、脑栓塞、 肺栓塞、下肢静脉栓塞、DIC和急性肾功能不全等疾病。
[0079] 所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
[0080] 2、采血方法
[0081] 步骤同实施例1。
[0082] 3、血液中总RNA的提取
[0083] 步骤同实施例1。
[0084] 4、逆转录
[0085] 用逆转录缓冲液对1 μ g总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25 μ 1反应体系，每 个样品取1 μ g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5 X逆转录缓 冲液，lOmmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV，模板 RNA。 42°C孵育lh，72°C lOmin，短暂离心。
[0086] 5、QPCR
[0087] (I)引物设计
[0088] 根据Genbank中DSG3基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0089] DSG3 基因：
[0090] 正向引物为 5' -GTGGTCATATTGGTTCAT-3'（SEQ ID NO. 3);
[0091] 反向引物为 5' -AGTTATCTTCTCCTTCTCT-3'（SEQ ID NO. 4)，
[0092] GAPDH 基因：
[0093] 正向引物为 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID NO. 5);
[0094] 反向引物为 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0095] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0096] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0097] 表1PCR反应体系
[0099] (3)卩〇?反应条件：95°(：1011^11，（95°(：108,601€408)*45个循环。以5￥81?6代611 作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和 电泳确定目的条带，△ ACT法进行相对定量。
[0100] 6、统计学方法
[0101] 结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示，采用SPSS13. 0统计软件来进行 统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0102] 7、结果
[0103] 结果如图2所示，与正常人相比，急性心肌梗死患者血液中DSG3基因的mRNA水平 显著增加，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)，结果同基因芯片实验。
[0104] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测DSG3基因表达的产品在制备诊断急性心肌梗死的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测DSG3基因表达水平以诊断急性心肌 梗死的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断急性心肌梗死的产品 至少包括一对特异扩增DSG3基因的引物；所述用实时定量PCR诊断急性心肌梗死的产品至 少包括一对特异扩增DSG3基因的引物；所述用免疫检测诊断急性心肌梗死的产品包括：与 DSG3蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断急性心肌梗死的产品包括：与DSG3基 因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断急性心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯 片；其中，蛋白芯片包括与DSG3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与DSG3基因的核酸 序列杂交的探针。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断急性心肌梗死的 产品至少包括的一对特异扩增DSG3基因的引物如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。5. -种用于诊断急性心肌梗死的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中 DSG3基因的表达来诊断急性心肌梗死。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通 量测序平台。7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所 述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用 于检测DSG3基因转录水平的针对DSG3基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载 体以及固定在固相载体的DSG3蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋 白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测DSG3基因转录水平的试剂；所述蛋 白免疫检测试剂盒包括DSG3蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测DSG3基因转录水 平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测DSG3基因转录水平的试剂。8. 根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测DSG3基因转录水平的试剂包括 针对DSG3基因的引物和/或探针。9. 根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对DSG3基因的引物序列如下： 正向引物序列如SEQIDNO. 3所示，反向引物如SEQIDNO. 4所示。10. 根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。
【专利摘要】本发明公开了DSG3基因可以作为急性心肌梗死早期诊断的分子标志物。本发明利用基因芯片和QPCR的方法发现DSG3基因在正常人和急性心肌梗死患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中DSG3基因表达情况来判断受试者是否患有急性心肌梗死。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断急性心肌梗死的试剂盒，该试剂盒通过检测DSG3基因的表达从而进行急性心肌梗死的诊断。本发明的诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K45/06, G01N33/68, A61P9/10
【公开号】CN105400880
【申请号】CN201510923782
【发明人】曹月娟, 李荣庆, 李阳春, 张涛, 吴楠, 张凤萍, 张建艳, 郭兆增
【申请人】天津市人民医院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月11日